Thực hành hóa sinh học – ĐHQG hà nội

Cán bộ phụ trách thực hành có thê lựa chọn các bài của các p h ầ n như: cách tính toán các loại nồng dộ, xứ lý mẫu till nghiệm, phương ph áp so màu, phương pháp quang phổ kê, định lượn

Đ A I H O C Q U Ố C G I A H A N Ô I

N G U Y Ế N V À N MÙI

f f ia !

(Ị} G

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI• • • NGUYỄN VẢN MỪI

HOÁ SINH HỌC

NHÀ XU ẤT B Ả N ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI - 2001

Lời n ó i d ầ u ~

C h ư ơ n g 1 H oá c h ấ t và d u n g d ị c h 9

I Khái niệm vê hoá c h ấ t 9

II Dung dịch 13

III Nồng độ dung dịch 14

IV Pha dung dịch tiêu chuẩn để chuẩn đ ộ 22

V Cách tính hệ số điều c h ỉ n h 25

VI Bài t ậ p 26

C h ư ơ n g 2 P h ư ơ n g p h á p lấ y m ẩ u p h ả n t í c h 29

I Lấy m ẫ u 29

II C huẩn bị mẫu phán tích 31

III Cỏ định m ẫ u 31

C h ư ơ n g 3 P h ư ơ n g p h á p s o m a u 34

I Phương pháp so m à u 34

II Định luật L am bert-B eer 35

III Màu dung dịch và chọn hước sóng ánh sáng (hay chọn kinh lọc m à u ) 37

C h ư ơ n g 4 P h ư ơ n g p h á p q u a n g p h ố k ế 43

I Hấp thụ tử ngoại của các loại cuvet khác n h a u 44

II Q uang phổ hấp th ụ tử ngoại của NAD* và N A D H 44

III Ước tính khôi lượng NADH 45

C h ư ơ n g 5 Đ in h lư ợ n g g l u x i t 46

I Định lượng đường khứ theo phương pháp B e r tr a n d 46

II Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich 50

III Định lượng glucozd trong máu bằng phương pháp N e ls o n 52

rv Định lượng fructozd trong (lung dịch có lản đường khử khác 53

V Định lượng đường khử bằng phường pháp axit dinitro-salicylic (D NS) 55

VI Định lượng sacarozd theo phương pháp thuỷ phân bằng a x it 56

VII Đinh lượng tinh bột theo phương pháp thuỷ phân bằng a x i t 57

VIII Định lượng xenlulozơ 59

IX Định lượng pectin bằng phương pháp canxi p e c ta t 60

X Định lượng dextrin bằng phương pháp kết tủ a vối cồn 61

C h ư ơ n g 6 Đ ịn h lư ợ n g lip ĩt 63

I Định lượng lipit bằng máy Soxhlet 63

II Xác định các chỉ sô của li p it 6 6 C h ư ơ n g 7 Đ ịn h lư ơ n g a x ỉt a m in và p r o t e i n 72

I Định lượng axit amin bằng phương pháp chuẩn độ íbrmol (phương pháp Sorensen) * 72

II Định lượng axit amin bằng n in h iđ n n 74

III Định lượng axit amin nhờ tạo thành phức chất vối đồng (Phương pháp Pope và S tevens) 76

IV Định lượng nitd bằng phương pháp Kjeldahl 78

V Định lượng protein bằng phương pháp Low rv 83

VI Định lượng protein tỏng sỏ, albumin và globulin trong huyêt thanh máu hằng phương pháp B iure 84

VII Định lượng protein bằng Coomasie Brilliant Blue G-250 8 6 VIII Định lượng protein bằng phương pháp quang p h ô 89

C h ư ơ n g 8 Đ ịn h lư ợ n g a x it n u c l e i c 92

I Phương pháp Schimidt và T h a n n h a u se r 92

II Phương pháp Schneider 94

III Phương pháp Ogur và R o se n 95

IV Phướng pháp quang phố 97

V Định lượng hợp chất photpho trong mô ruột theo phương pháp Schmidt và T h annhauser có sửa đ ổ i 98

VI Định lượng photpho theo phương pháp Horecker và các cộng sự 101

VII Định lượng photpho vỏ cơ có nguồn gốc từ photpholipit theo phường pháp Delorv ĩ 101

VIII Định lượng ARN bằng orxinol 102

IX Định lượng ADN bằng phướng phấp điphenylam in 104

C h ư ơ n g 9 Xáo đ ịn h h o ạ t đ ô c ủ a m ộ t sô e n z i m 106

I Định nghĩa (lơn vị hoạt độ của en zim 106

II Chú ý khi xác định hoạt độ enzim 106

III Xác định hoạt độ của ascorbat oxidaza 107

IV Xác định hoạt độ của a- amylaza theo Rukhliadeva Geriacheva 108

V Xác định hoạt độ của c a ta la z a 112

VI Xác định hoạt độ cholinesteraza của huyết thanh (ChE) - phương pháp sửa đổi của H estrin 113

VII Xác định hoạt độ của glucoamylaza 114

VIII Xác định hoạt độ lip a z a 116

IX Xác định hoạt độ p a p a in 118

X Xác định hoạt độ pepsin bằng phương pháp A nson 121

XI Xác định hoạt độ peroxidaza 123

XII Xác định hoạt độ photphataza kiếm và photphataza axit theo phương pháp King -Armstrong 125

XII ỉ Xác định hoạt độ proteinaza theo phương pháp Anson cai tiên 127

XIV Xác định hoạt độ ureaza theo phương pháp chuân đ ộ 130

C h ư ơ n g 10 Đ ịn h lư ợ n g v i t a m i n 132

I Định lượng vitamin c theo phương pháp chuẩn đ ộ 132

II Định lượng vitamin B2bằng phương pháp huỳnh q u a n g 135

III Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang 142

C h ư ơ n g 11 Đ ịn h lư ợ n g m ộ t sô" n g u y ê n t ô 144

I Định lượng p h o tp h o 144

II Định lượng Kali tổng sô của thực vật bằng Natri Cobantinitrit 150

III Định lượng Canxi và Magie tống sô của thực vật bằng trilon B 151

IV Định lượng Canxi trong mô cơ theo phương pháp R etin x k i 152

V Định lượng s ắ t 154

("hương 12, Phụ lụ c 155

I Các dung dịch đ ệ m 155

II Dung dịch pH c h u ẩ n 163

III Nồng độ axit và amoniac thường g ặ p 163

IV Pha dung dịch phần trăm axit và amoniac 164

V Khỏi lượng mol phân tử và tỷ khôi của một sô" a x i t 165

VI Kiêm tra nồng r* \ các dung dịch chuẩn độ đã pha bằng dung dịch chát gốc có nồng độ chính x á c 165

VII Chỉ thị màu axit - b a z ơ 166

VIII Cách pha và sử dụng một số thuốc thử chỉ thị màu thông thường 167

IX Các dung dịch rửa dụng cụ bẩn trong phòng thí n g h iệm 168

X Nguyên tử khôi của một sô" nguyên tô" 169

XI Nồng độ dung dịch amoni sunfat băo hoà ở nhiệt độ khác nhau 170

XII Cách tính lực li t â m 170

XIII Các ký hiệu quy định kích thưóc và các phần thập p h â n 170

XIV Các chữ cái Hy L ạ p 171

XV Các tính chất của một sô đồng vị phóng xạ ứng dụng trong y sinh h ọc 171

XVI Sự phụ thuộc của tỷ khổi và chỉ sô" khúc xạ vào nồng độ dung dịch 172

Tài liệ u t h a m k h ả o 173

L ờ i n ó i đ ầ u

Giáo trình "Thực hàn h hoá sinh học” dùng cho sinh viên năm th ứ ba, ngành Công nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quỏc gia

Hà Nội

Sinh viên tiến h à n h làm 20 bài thực hành của 11 chương khác nhau, tùy thuộc

điều kiện, cơ sở v ậ t chất của phòng thí nghiệm cho phép Cán bộ phụ trách thực hành

có thê lựa chọn các bài của các p h ầ n như: cách tính toán các loại nồng dộ, xứ lý mẫu

till nghiệm, phương ph áp so màu, phương pháp quang phổ kê, định lượng gluxit, định lưựng lipit., định lượng axit am in và protein, định lượng axit nucleic, xác định hoạt độ

định lượng vitamin, định lương một sô' nguyên tô'kim loại

Ngoài ra, quyên sách còn được dùng cho thực tập chuyên đề của sinh viên năm

t hủ' tư và phục vụ cho học viên cao học làm luận á n thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá sinh học, trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Sách đả được sửa chửa và bố sung một sô phương pháp ở các chương định lượng protein, xác* định hoạt độ một sô" enzim, định lượng một sô" nguyên tô" kim loại so với lan xuàt ban đầu

Tác giả

C h ư ơ n g 1HOA CHAT VA DƯNG DỊ CH

I KHÁI NIỆM VỂ HOÁ CHẤT

1 C á c c h ấ t h o ả học

Các chất dùng đê phân tích hoá học, làm tiêu bản trong phòng thí nghiệm được gọi là hoá chất Các hoá chất có thê là chất rắn, lỏng, khí có mức độ tinh khiết khác nhau

By IR spectrum

Maximum Limits o f Impurities

Water Non-volatile matter Acidity (C H 3 CO O H )

Ethanol Heavy metals (as Pb)

Tính chất nguy hiểm của hoá chất được cảnh báo bằng các ký hiệu in trên n h à n

hoá chất (Hình 1.2)

C hất dễ cháy Chất dễ oxi hoá C h ất độc hại môi trường

Hình 1.2 - Các kỷ hiệu cảnh báo hoá chất nguy hiểm

Trong các cơ quan nghiên cứu và nhà máy sản x u ất hoá chất có những vùng nguy hiểm được cảnh báo bằng các ký hiệu (Hình 1.3), các biển hiệu cấm (Hình 1.4) và các biên hiệu điều kiện an toàn (Hình 1.5)

<— Nguy hiểm nhiễm trù n g

<- Nguy hiếm nhiễm trù n g

<— Mẫu bệnh lý, chú ý dễ hỏng

<” Tiệt trùng

<- Cảnh báo nguyên liệu phóng xạ

Vùng có chất độc Nguyên liệu dễ bốc cháy Nguyên liệu dễ nô

Hình 1.3 - Ký hiệu cảnh báo các vùng nguy hiểm

Hình 1.4 - Các ký hiệu cấm

Mũ bảo hiểm Chông ồn Phải rửa tay trước

Phải đi ủng cao su

Mù kính báo hiêm, chông ôn Mủ che đâu và mặí

Chỉ được đi bộ Găng tay bảo hiểm có cổ tay Phải có khẩu trang

Phải có găng tay cao su Phải có kính Phải có mặt nạ chống: độc

Tire nearest first

box 'm situated— >

Person in c h a r g e flH

J -

Dội nưóc khẩn cấp Hộp trợ cứu đầu tiên Rửa m ắt TrỢ cứu đầu tién

Hình 1.5 - Các ký hiệu vế điểu kiện an toàn

2 C á ch s ử d ụ n g h o á c h ấ t

a) Cần g i ữ h o á ch ất s ạ c h

- Chai lọ hoá chất phải cỏ nắp

Trước khi lấy hoá chất phải lau sạch nắp và cô lọ

- Không clùng lẳn nắp đậy và dụng cụ lấy hoá chất

- Không dùng hoá chất đã rơi vãi

h) Hoá c h ấ t (tá p h a

- Lọ hoá chất phải có nh ăn ghi tên hoặc công thức hoá học

- Ghi n ồ n g độ dung dịch

- Ghi ngày pha

* Chai lọ đựng hon chất pha phải có nắp

- Không đê hoá chất r ơ i vào nhăn

- Trước khi mớ nắp lọ phải lau sạch nắp và cô lọ

- Để nấp và dụng cụ lây hoá chất ở nơi sạch, không đế phan tiếp xúc vối hoá chấtxuống bàn

c) B à n th í n g h iê m

- Chỉ đê hoá chất dang dùng lúc đó

- Các ho á chất đê bốc hơi, có mùi phải lấy nhanh hoặc lấy trong tủ hút, phải đậy kín,

- Khi làm việc vói kiềm, axit và các chất độc phải theo đúng quy (lịnh

- Không được ngửi hay nếm thử hoá chất

- Các hoá ch ất dễ cháy, dễ nô không được để gần lửa

II DUNG DỊCH

Dung dịch là hồn hợp nhiều loại của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ vói nhau về lý, hoá học - thành phần đơn giản n h ấ t của dung dịch có thê tách ra được ớ dạng t inh khiết, ngược lại có thể điểu chế dung dịch ấy theo một thành phần b ất kỳ dược gọi là th à n h phần dư trong dung dịch so với th àn h phần kia là dung môi Thành phần còn lại là chất hoà tan

Ví dụ:

- Dung dịch NaOH 10% trong nước:

NaOH là chất tan, nước là dung môi

- Butanol bão hoà nước:

Nước là chất tan butanol là dung môi

111 NỒNG ĐỘ DU N G DỊCH

Trong phép tính nổng độ dung dịch, các chất ta n được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng, khôi lượng m oi đương lượng gam (thường được sử dụng), còn sô lượng dung mòi hoặc dung dịch được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng mol hoặc đơn vị thê tích Trong nghiên cứu thường dùng 3 nồng độ cơ bản

- Nồng độ phần trám (%)

- Nồng độ mol/1 (mol - M)

- Nồng độ đương lượng gam (N)

Ngoài ra còn có:

- Nồng độ gam trên lít: sô" gam chất tan có trong một lít

- Nồng độ dung dịch bão hoà: là ở nhiệt độ nhất định, c h ấ t hoà ta n không thê hoà

ta n thêm được nữa Thường biểu thị bằng sô" gam chất tan trong 1 0 0 ml nước

+ Microgam phần trăm (ng%) là sô" microgam (|ig) của ch ất hoà ta n trong 1 0 0 gam hoặc lOOml dung dịch (Ịig/100ml)

và hai loại nồng độ thường được sử dụng là:

+ Dung dịch phần nghìn (%o) là sô" gam chất hoà tan trong 1000ml dung dịch

+ Dung dịch phần triệu (ppm) là sô' gam chất tan trong 1.000.000ml dung dịch hay miligam trong 1 0 0 0 ml dung dịch hoặc microgam trong lm l

a) N ồ n g độ p h ầ n tr ă m k h ô i lư ơ n g - k h ố i lư ơ n g (% w /w )

• Chất rắn tan trong chất lỏng

+ Chất rắn không ngậm nước

Pha dung dịch từ chất rắ n không ngậm nước được tính theo công thức sau:

100Trong đó:

X - sô gam chất ta n lấy đê pha

a - số ph ần trăm dung dịch muôn pha

b - khối lượng dung dịch cần pha

Ví dụ ỉ: Cần bao nhiêu gam NaCl và bao nhiêu ml nưốc để nhận được 300 gam

đung địch NaCl 15% (w/w)?

Giải: Áp dụng công thức trê n ta có:

x = l ^ -3-9° = 45(g)

100Đáp so: Để n h ậ n được 300 gam dung dịch NaCl 15% (w/w) cần cân 45 gam NaCl hoà tan trong 255 gam (ml) nước (300 - 45 = 255)

+ Chất rắ n ngậm nước

Muôn pha dung dịch này phải tính cả lượng nưốc ngậm trong phân tử của chất tan, sau đó tính khôi lượng tổng cộng (khôi lượng chất ta n và khổì lượng nưốc ngậm) Công thức tính:

wTrong đó: X- sô" gam chất ta n lấy pha

a- khôi lượng mol ngậm nướcb- p h ầ n tr ă m dung dịch cần phaw- khôi lượng ph ân tử không ngậm nước

ta được dung dịch CuSO ị 10% (w/w)

Trong thực tê, khi pha những dung dịch có nồng độ) vài % thì người ta thường cân chất tan rối cho vào binh định mức hay ông đongr, sau đó thêm nước đên ngàn muôn pha (vi trong trường họp này thẻ tích mất đi khôrhg đáng kể), cỏ n g thức tính:

- Chất lỏng tan trong chất lỏng

Chất tan ở đây là chất lỏng và được cân như chất tam và dung môi là nước

Tính theo công thức:

Ví dụ 3: Pha dung clịch HC1 10% trong nưôc: ta cân dung dịch HC1 rồi láy 100 gam

trừ đi sô gam HC1 là lượng nước thêm vào

*Chú ỷ: Các chất lỏng có nồng độ hoà tan tôi đa được tính theo phần trăm Ví dụ:

lổng này phải tính sô gam chất đó trong dung dịch theo công thức:

100.a

A —

—* -bTrong đó: X - khôi lượng chất tan cần có

a - nồng độ dung dịch cần pha

b - nồng độ chất tan hiện có

Ví dụ 4: Pha dung dịch HC1 10%.

Ta có HC1 đặc là 37%, vậy khối lượng HC1 được tính theo công thức(l.õ):

Như vậy ta phải cân một lượng HC1 là 27,03g, sau đó thêm một lượng nước:

100 - 27,03 = 72,97 (hay 72.97ml nước vì clị|i() = 1)Đôi với chất lỏng ta có thê chuyến th à n h thế tích đe th u ậ n lọi cho pha chê và đước tinh theo công thức sau:

(1.3)

X = 1 0 0 - a Trong đó: a - sô gam chất tan

Trong đó: V- th ế tích cần lấy

p - khôi lượng chất tan

d - tỷ khôi chất tan Vậy thể tích của 27,03 gam HC1 37% có thê tính như sau:

Vi dụ: c ẩ n bao nhiêu gam NaCl đê nh ận được 300ml dung địch NaCl 15% (w/v)?

Trong đó: V ì - th ê tích dung dịch cần lấy pha

V 2 - thê tích dung dịch cần pha

% J - ph ần trăm dung dịch lây pha

%; - p h ầ n trăm dung dịch pha

Vi dụ 1: c ầ n bao nhiêu ml dưng dịch NaCl 27% (w/v) để nhận được 3000ml dung

Cách p h a : Lây 100ml dung dịch 27% pha với 2900ml H2O (3000 — 100) hay dẫn nước đến 3000ml.

Ví dụ 2: Cách pha n hư thê nào đê nh ận được 200ml dung dịch HC1 25% (w/v) từ

HC1 có tỳ khối d = 1,19 và nồng (ỉộ 37%

Giải: Nồng độ của HC1 đặc là phần trăm khối lượng - khôi lượng bằng cách chuyển

nồng độ % w/w sang % w/v qua giá trị tỷ khôi của axit.

Nồng độ axit %(w/v) = 37%(w/w) 1.19(d) = 44 thay vào công thức (1.7)

Cách p h a : Pha 30g HjjSO,, 96% (30:1,84 = 16,3ml H^so^ 96% ) và 6 6 ml H / )

+ Pha dung dịch từ hai dung dịch có nồng độ khác nhau:

Ví dụ 4: c ầ n có dung dịch 40% từ hai dung dịch 50% và 20%.

Giải: theo quy tắc ta có

2 0 < - lOg 20%

Cách p h a : Lấy 20g dung dịch 50% và lOg dung dịch 20% được 30g dung dịch 40%

*Chú ý: Nếu chỉ từ một nồng độ dung địch cao xuống nồng độ dung dịch thấp cũng

tính theo quy tắc h ình bình hành, nhưng dung dịch thấp là nưóc 0%

Ví dụ 5: Pha dung dịch 10% từ dung dịch 50%.

Giải: Theo quy tắc h ình bình hành ta có:

Vi dụ 6: c ầ n bao nhiêu ml dung dịch NaCl 20% và 3% (w/v) đế nhận được 500ml

Từ 6 ml NaCl 20% có th ể n h ậ n được 17ml NaCl 9% (6 + 1 1 )

Từ X ml NaCl 20% có th ể n h ậ n được õOOml NaCl 9%

Muôn pha dung dịch loại này là cân chính xác khôi lượng chất tan bằng khỏi lượng mo] của chất đó, cho vào bình định mức và cho nưốc vào đến vạch ngấn lăc đều.

*Chú ý: Cho hoá chất qua phễu đặt trên bình định mức 1 lít, rửa cân th ậ n côc cân

hoá chất và phễu bằng tia nưổc nhỏ Bình định mức phải được đặt trên bàn phang Những chất toa nhiệt hay thu nhiệt phải đê cho vể nhiệt độ bình thường (2 0 °C) rồi mối thêm nước đến vạch ngấn

a) P h a c h ấ t r ắ n k h ò n g n g ậ m nước

Vi dụ 1: Pha K.,Ci\,07 có nồng độ IM

Giải: Khôi lượng moi của K2Cr2 0 7= 294 (g)

Cách p ha: Cân 294g K.,Cr.,07 pha trong bình định mức 1 lít

b) P h a c h á t r ắ n n g â m nước

- Chát tan là chất lồng tinh khiết (100%)

Tiên hành cân và pha như chất rắ n không ngậm nước

Ví dụ 2: Pha dung dịch Na^S^O.Ị.õH^O có nồng độ IM.

Giái: Khỏi lượng mol của Na.,S20.,.5H70 = 248 (g)

Cách p h a : Cân 248 gam Na^S^Oọ.õHr^O pha vào bình định mức 1 lít

- Chất tan là chất có phần trăm thấp (chưa được 100%)

Cần phai chú ý nồng độ phần trăm

Ví dụ 3: Pha HC1 IM từ HC1 37%, d = 1,19

Giái:Khỏi lượng mol HC1 = 36,5 (g)

Tính khôi lượng theo công thức:

v M X 100

Trong đó: X - khôi lượng chất tan cần cân

M - khôi lượng mol

c - nồng độ thực của dung dịchThay vào công thức (1.9) ta có:

Cách p ha: Lấy 83ml HC1 37% pha thành 1 lít được dung địch HC1 IM

+ Nếu cần pha nồng độ M lốn hơn hay nhỏ hòn IM Tính theo công thức sau:

Trong đó: X - khôi lượng chà't tan cần pha

M - khôi lượng mol

c - nồng độ thực của dung dịch C^Ị - nồng độ mol

Ví clụ 4: Pha HC1 2M từ HC1 37%, d = 1,19 ?

Giải: Thay vào công thức (1.10), ta có

X = 36,5 * 100 X 2 = 1 9 7 ,3(g)

37Thay vào công thức (1.3) ta có:

V = ! Ì M = i65,8(m l)1,19

Vi dụ 5: Pha H2SO.t 0,2M từ II2SO,, 96%,d=l,84 ?

Giai: Thav vào công thức (1.10) ta có:

Cách pha: Lấy 1 1 , 1 ml H2S 04 96% pha th à n h lMt

Cùng có thể lấy khôi lượng hoặc thế tích chất ta n n h â n với số lần lớn hơn hoặc nhỏ

Cách p ha: Láy 8,3ml HC1 37°ó pha thànii 1 lít.

GFeSO,, + K2Cr20 7 + 7 H ,S 04 = 3Fe2(S 0 4);í + Cr^SOj);, + KvSO, + 7 H fi

6Fe2+ + C r.,07" + 14 H+ = GFe:u + 2Cr:H + 7HaO

994 9Đương lượng gam K.,Cr, , ( ) 7 = - =49,04 g

Nồng độ đương lượng thường dược dùng đế biểu thị nồng độ các dung (lịch chuấn

vi rấ t tiện lợi Nêu dung dịch cùng một nồng độ đương lượng thì phíin ứng đúng theothè tích bằng nhau Nêu hai dung dịch có nồng độ đương lượng khác nhau thì phảnứng đúng theo những thế tích tỷ lệ nghịch với nong độ đường lượng cùa í húng Khi hai dung dịch phản ửng đúng vói nhau thì

Trong đó:

V1 là sô ml dung clịcli th ứ n h ất có nồng độ đương lượng N1

V.; là số’ ml dung dịch thứ hai có nồng độ đương lượng Nv

Đây là biểu thức cơ ban đế tính toán trong quá trình cliuán độ

IV PHA DUNG DỊCH TIỀU CHUAN đ ẻ CHUAN đ ộ

1* Một s ố d u n g đ ịr h tiê u c h u ẩ n

Một sô" dung dịch tiêu chuẩn đê chuẩn độ trong phòng thí nghiệm như H ọ S 0 j

0 1 N; KMnO ị 0,1N Từ các dung dịch có nồng độ 0 ,lN pha ra các* dung địch 0.05N:

0.02N: 0 ,0 IN Đẻ pha những dung dịch này trưóc hết pha gần đúng 0,1N (thường lấy cao hôn một ít) rồi sau đó mối xác định lại nồng độ chính xác và điều chình chúng bãng pha loãng.

Bảng 1.1- Pha dung dịch tièu chuẩn thường dùng (gần đúng)

Dung dịch tiêu chuẩn Lượng hoá chất đê pha thành

1 lít dung clịch

h 2s o 4 c u nNaOH 0,1N

KMnO.ị 0,1 N

Trilon B 0,05N

2,8ml H2S 04 đặc ((1=1,84)4,0 g

3,16 g

9,305g (có thê pha chính xác)Phan lốn những chất đà pha trên khống thế căn cứ khối lượng đã lấy pha đê tính

ra nồng độ chính xác vì chúng chứa tỉ lệ nưốc ngậm không ôn định hoặc trong thành phần chúng có lẫn th à n h phần khác như NaOH có chứa Na«,CO K M n 01 có lẫn MnOjj.Người ta thường dùng những chất có th àn h phần ồn định, có lượng nước trong tinh thê ôn định hoặc dễ dàng sấy khô, không bị h ú t ẩm hay bị oxi hoá trong quá trình pha chế, những chất này gọi là hoá chất gôc dùng để kiểm tra các dung dịch tiêu chuẩn đă pha trên Nồng độ hoá chất gốc được tính từ khôi lượng đỗ lấy pha, sau đó tính nồng độ đương lượng và áp dụng công thức (1 1 1 )

Cach kiểm tra: P h a 100ml hoá chất gốc có nồng độ chính xác 0,1N Lấy 3 bình nón

cờ 250m Ị cho vào mỗi bình chính xác 20ml dung dịch 0,1N của hoá chất gốc và chất chỉ thị Dùng dung dịch tiêu chuẩn đă pha rót vào buret Chuẩn độ cho đến điểm tương đương (đồi m àu chất chỉ thị)

Bảng 1 2- C á c chả't gốc dùng đế kiểm tra nống độ các dung dịch tié u chuẩn

Bỉnh nón có 20m l dung dịch gốc và chất

chi thị

Màu chuân độ

n hạt

am pun sẽ chảy vào bình định mức, dùng pipet hoặc bình phun rứa sạch ampun, dẫn nước đến ngấn bình định mức 1 lít Dùng nút nhám đậy kín, trộn đểu và cho vào lọ chứa để dùng dần.

Lồ trênAmpun

Lỗ dưới

Ampun

PhễuVach

Bình định mức

Hình 1.6 - Cách pha dung dịch chuấn

*Chú ý :

- Các ficxanal kiểm ăn da có thể bảo quản không quá sáu tháng vì giữ lâu dễ bị

vẩn đục do có chất b ẩ n và tạo thành cacbonat tương ửng

- Các ficxanal của muôi hay axit có thể bảo quản được lâu dài

V CÁCH TÍNH HỆ SỐ Đ lỂ U CHỈNH

Trong quá trình pha hoá chất có nhiều yếu tô' làm sai nồng độ như:

* Cân đo không chính xác

- Các chát chưa tinh khiết hay h ú t nưổc v.v

- Đê lâu bị thăng hoa hay oxi hoá v.v

Do đó người ta phải kiểm tra nồng độ thực của dung dịch pha dựa vào các chất ôn định hay có nồng độ chính xác như các dung địch tiêu chuẩn ficxanal Tính sự sai sô cùa dung (lịch để tìm nồng độ thực gọi là hệ sô điêu chỉnh, thường được ký hiệu là T

Hệ sô' điểu chỉnh theo dung dịch tiêu chuẩn ficxanal

Sau đó so H.,SO t tự pha voi ll.,vS()| 0, IN tiêu chuấn theo, công thưc sau:

T h j S C V I I s u , <".lN> ” ^11 >SOj / NaOỈ I * "Nỉ i OỊ I / II s o (AlNi

Trong đó:

T ||.,so /ỈUSO (0 1 N): 1 lộ số 1 1 ,8 0 , tự p h a so vối H.,SOj tiêu chuẩn

T|ị so /NaOH : 1 lệ số’ II.,SO 1 tự pha so với NaO II tự pha

T n í i O I I / H o SO ( Í I ] N ) : H ộ sỏ N a O H t ự p h a s o v ớ i I I , s o , t i ê u c h u ẩ n

Thay sô ở 2 ví dụ tròn vào ta có:

Tịị so /II so, {(UN) =0.83* 1,11 =0,9213Vậy nồng độ thực của axit tụ pha là:

B à i tậ p : Cần brio nhiêu nil II ,SOj 96% (<1 = 1,84) và bao nhiêu ml nưỏc ctể nhận

được dung dịch Hi,SO ị 5% ?

Đá p số: 2,72ml H.jS Oj 9G%, 91 ml II./)

B à i tậ p 4: Cần bao nhiêu nil HNO., 70% (cl = 1,42) và bao nhiêu ml nước đô nhận

được dung dịch HNO.J 20% ?

Đáp sò: 14,lml IĨNO 70*?« và f)0ml H.,0

B à i tậ p 5: Cần bao nhiêu ml CH >COOH 95,5% (đ = 1,05) và bao nhiêu ml nưốc đê

nh ận được dung dịch CHọCOOII 15% ?

gap.sol; 1.4,28ml CH.COOIl 95,5% và 80,5ml 11,0

B à i ta p 6: Cẩn cho nước đến vạch bao nhiêu ml khi p ha 40ml dung địch 25%

(\v/w) đô nhận được (lung dịch ró nồng- cỉộ 3°ó ?

Dá]) sò: 333ml

lià i tậ p 7: Có bao nhiêu ml dung dịch 20% (w/v) khi pha 50nil HC1 37% (d =1,19)?

Đ á p s ố: 1 1 0 m l

B à i tậ p 8: Cần bao nhiêu ml H.,S04 96% (d = 1,84) bao nhiêu ml nước để nhận

dược dung dịch II.,s o 1 30%?

B à i tậ p 13: Cần pha loãng 150g dung dịch NaOH 40% để có dung dịch 15% Hỏi

phải thêm bao nhiêu nước ? Được bao nhiêu gam dung dịch 15% mới pha ?

B à i tậ p 18: Cần chuẩn bị 80ml dung dịch kiềm 40% từ dung dịch 50% và 20%

Hỏi mỗi dung dịch cần bao nhiêu ?

Đáp sỏT: 26,7ml clung dịch 20% và 53,3ml dung dịch 50%

B à i tậ p 19: Cần thêm bao nhiêu nước vào 2 lít dung dịch NaOH 40%, tỷ khôi 1,43

đê có dung dịch kiềm 1 0 % ?

Đáp số: 8,58 lít

B à i tậ p 20: Hoà ta n l,966g NaCl vào trong bình định mức dưng tích 200ml và

dẫn nưốc tỏi vạch Tìm nồng độ M của clung dịch ?

Đáp so>: 32,6ml KOH 27,3% thêm nưóc vào đến 1 lít

B à i tậ p 23: Phải chuẩn bị 4 lít dung dịch HNO.J 0,1N thê nào từ dung dịch HNO'J

42,9%, d = 1,265 ?

Đáp số: 46,4ml HNO.Ị 42,9% pha thêm nưốc đến 4 lít

Hình 2 1 - C á c h chia õ lấy mẫu hạt p h âi lâ'y từ 500-1000g.

Mẩu được nghiên hoặc xay th ành bột, rây qua rây có kích thước lỗ 0,15 - 0,50 mm Bột giử trong lọ kín, có thê cho thêm chất chông mốc mà không ảnh hưởng đên thành

p hần hoá học của chất định phân tích Đôi với h ạ t có dầu phải giã từng ít một, nên bảo quán nguyên hạt Nêu là hạt lớn có vỏ cứng ngoài thì phai bóc vỏ trước khi nghiền

nhỏ Nêu muôn tính sò liệu phán tích toàn bộ hạt, phải xác định % vỏ bằng cách cản khôi lượng 50 hay 100 hạt tách vỏ và tính % khôi lượng vỏ hoặc tính % khôi lượng

nhân hạt đả tách vỏ và so sánh vói khôi lương h ạt nguvên Lúc bóc vỏ can chú ý không làm hỏng các phần nhan bên trong như m ắt của các loại hạt đậu v.v Đố dễ dàng tách

vỏ, có thê nghiền nhẹ trong cối cho nứt vỏ và sau đó bóc hoặc có thể ngâm cho trương

nước rồi mỏi tách vỏ, ví dụ ngâm hạt bông 4 - 6 giờ và dùng dao tách vỏ

H ạt nguyên hoặc h ạ t đă tách vỏ trước khi nghiển có thê sấy ở 70 80°c trong 15

-18 giò hoặc sấy ỏ 80 ■ 85"c từ 4 - 5 giờ cho đến trạng thái khô không khí Sau đó, nếu

xác định tro hay dầu lại đem sấy tiếp tục ở 1 0 0 -1 2 0°c trong một giờ

2 L ây m an rau

Tuỳ từng loại rau mà phải chú ý đến đặc điểm của nó lúc lấy mẩu

- Các loai r a u ă n quả nh ư cà chua, ốt, dưa chuột, bầu, bí v.v cần chú ý đến sô lượng quả, vị tr í quả tr ê n cây, độ chín của quả V V Những cây r a quả nhiều lứa, cần

p h â n tích ít n h ấ t là 10 cây và từ 3 - 5 quả mỗi cây

- Các loại củ n h ư khoai lang, khoai tây v.v , sau khi lấy 10 cây, p h â n các cú

th à n h 3 loại to, vừa, nhỏ và lấy 20 - «30 củ ở cả 3 loại

- N hững loại ra u ăn lá phải chú ý đến giai đoạn sinh trưởng và ph ân tích ít n h ất 2lứa

Khối lượng của mỗi m ẫu lấy để p h â n tích tùy từng loại Rau ă n lá là lkg Cà chua, bắp cải, dưa chuột, v.v là 2,5kg N hững loại quả lổn như bầu, bí, dưa bở v.v là 5kg Quả, củ cần bổ dọc và lấy ở quả, củ một phần, lượng mẫu không ít hơn lkg

Các loại r a u n ê n lấy vào sáng sóm để kịp p h â n tích trong ngày Nếu lấy vào buôi chiều (17-18 giờ) p h ả i giữ lạnh để hôm sau ph ân tích Nếu p h â n tích nhiều lần trê n một đỗi tượng thì phải thông n h ấ t thời gian lấy

Quả và quả mọng n h ư táo, lê, mận, cam, ch an h v.v phải lày tru n g bình của 10 cây mọc ỏ các vùng khác n h a u trong vườn rộng, trong sô đó có ít n h ấ t là õ cây mọc ở các vùng đại diện cho vườn Chọn các quả ở các tầ n g khác n h a u trên cây, mỗi cây lấy

từ õ - 6 quả, tổng khôi lượng quả ở 10 cây từ 1,5 - 2 kg hoặc lk g đôi vối nho Quả hỏng

- L ấy n h iề u điểm

T rên một diện tích cây trồng phải lấy nhiều m ẫu ở n h iều điểm khác nhau, thường lấy từ 5-9 điểm rồi trộn đều lại và lấy ra một lượng cần thiết, các điểm n ày phân bô" đều trê n toàn diện tích lấy mẫu (hình 2 2 )

- Loại tr ừ cá biệt không điên hình

Khi lây mẫu ở các điểm cẩn tr á n h những m ẫu cá biệt không điển hình như các

m ẫu cây bị bệnh, bị sâ u hoặc quá tốt T rá n h lấy m ẫu khi vừa mới phun thuốc trừ sâu hay p h u n hoá ch ất kích thích Nếu toàn diện tích kém đổng nhất, thì phải phân chia nhỏ ra Ví dụ toàn diện tích lấy m ảu có chỗ cao, chỗ trùng , cây trổng khác nhau, trong trường hợp này phải p h â n nhỏ ra nhiều ô, mỗi ô lấy một m ẫu đại diện đế về ph ân tích

II C H U Ẩ N b ị m ẩ u p h â n t í c h

T ấ t cả ra u quả trước khi p h â n tích p h ải rử a sạch đất, gọt sạch vỏ Cà chua, dưa chuột, ớt, khoai tây, cà rốt, táo, lê, nho, mơ, m ận nghiền toàn bộ quả Bắp cải trưốc khi nghiền phải bỏ các lá bẩn, lá xan h ở ngoài H àn h củ loại bỏ lớp vỏ ngoài Cam,

quýt, bưởi bóc lớp vỏ ngoài và cùi tr ắ n g bên trong H ạt quả một số trường hợp lấy

phân tích cùng t h ị • quả (ót, cà chua, dưa chuột ), một sô" quả cần bỏ h ạ t (nho, cam, chanh, lê, mận) kể cả ph ần bao h ạ t vì p h ầ n này giầư hemixenlulozd và pectin

Các quả đã lấy theo cách n h ư trê n đem bô dọc, mỗi quả lấy một lát, nghiền nhỏ (quả to có th ê d ù n g dao th á i nhỏ trước k h i nghiền), qu ả n h iề u nước có th ể ép nước để riêng, bã nghiền sau Có th ể dùng cối xay thịt, cối xay h ạt, cối sứ, máy xay sinh tô" để nghiền Mâu được nghiền th à n h dịch th ể đồng thể

III CỐ Đ ỊN H MẨU

Sau khi lấy mẫu, chưa p h â n tích ngay cần phải cô" định m ẫu để giữ nguyên các

th à n h p h ầ n của mẫu

1 S ấ y k h ô đ ế n t r ạ n g t h á i k h ô k h ô n g k h í

Phương pháp này dùng nhiệt độ cao để diệt enzim và vi k h u ẩn , sau đó dùng nhiệt

để loại p h ầ n lốn nưổc đến khi nguyên liệu khô giòn

Đầu tiê n cho nguyên liệu vào tủ sấy> sấy ỏ 110 - 120°c, n h iệ t độ trong nguyên liệu sẽ đạt 100 - 105° trong khoảng 30 phút, enzim và vi k h u ẩ n bị diệt Sau đó tiếp tục sấy ỏ 60 - 70°c cho đến khi khô giòn Thòi gian sấy khác n h a u tu ỳ từng loại

nguyên liệu, nhưng không kéo dài quá 8 - 10 giờ Đê sấy khô nhanh chóng cần thái nhỏ nguyên liệu, tủ sấy phải thông khí (có quạt gió và lồ thỏng khí) Trong quá trình sây không được đê nhiệt độ cao quá có thể làm cháy, làm hiên đối thành phần hoá học (đặc biệt với nguyên liệu nhiêu đường sè bị caram en hoá có mùi khét) Trong thời gian đầu nếu sấy khô chậm, các enzim sẽ hoạt động mạnh làm biến đôi thành phần trong nguyên liệu Vì vậy nâng nhiệt độ sấy cao lúc ban đầu rất quan trọng.

Nguyên liệu đã được sấy khô, cho vào bình đậy chặt bằng n ú t cao su hay n ú t bấc

có parafin gắn phía ngoài nắp, giữ ơ nơi khô và lạnh

2 C ỏ đ ị n h b ằ n g h ơ i n ư ớ c

Dùng hới nước đê làm ngừng hoạt động enzim Có thê dùng nồi xông hơi, nồi cách thuý hoặc xoong binh thường Đun một ít nước sỏi lúc đun đậy nắp, sau khi nưốc đã sỏi, trải nguyên liệu th ành lốp mỏng gói trong vải màn hoặc đặt trong chén sứ và đặt trên vi trong xoong, không để mẫu tiếp xúc với nưốc, đậy nấp tiếp tục đun 1 5 - 2 0 phút

hoặc lâu hon tuỳ theo nguyên liệu Lây mẫu ra và sấy trong tủ sấy thong khí ở 30 -

50“c hoặc tủ sấy bình thường ỏ 60 - 70°c đến khô

Phương pháp này có thể dùng để cô định các nguyên liệu như lá, thân, rễ, hạt chứa ít axit và hàm lượng (ỉưòng đã được xác định trong nguyên liệu tươi (cà rốt, bắp

cải )- Còn các quả, quả mọng (cà chua) và các loại rau quả có chứa nhiểu nước, đường,

axit hữu cơ không thế dùng phương pháp này được vì có thê bị mất dịch, đường bị thuỷ phân cùng như làm biên đối tỷ lệ giữa các dạng hiđratcacbon khi sấy tiêp tục Vì vậy

các loại mẫu này nên dùng phương pháp cố định bằng cồn.

Nguyên liệu sau khi sấy khô cho vào lọ sạch, đậy nút chật Phướng pháp này có thê dùng khi đi khảo sát ngoài thiên nhiên để giữ mẫu về phản tích ở phòng thí nghiệm

3 C ố d ịn h b ằ n g c ồ n

Thường khi phân tích đường, axit a mill, lấy 1 lượng mẫu thái nhỏ cho vào bình có lắp ông làm lạnh, cho cồn 96° đã đun sôi vào bình làm ngập toàn bộ mẫu, phải tính toán trước đê nồng độ cồn còn từ 78 - 82°, tiếp tục đun sôi 30 phút trên nồi cách thuỷ Sau đó để nguội (vẫn giữ nguyên ỏng làm lạnh), thay ông làm lạnh bằng nút đậy kín

Cô định mẫu bằng phương pháp này có thế giữ được th ành phần hoá học trong mẫu không bị biến đổi trong thời gian đến 1 năm

Phương pháp này thường dùng đê cô" định các mẫu lá, quả, rễ, cú h ạt Một sô đối tượng khác như mẫu có chất chát cần sấy khô trong bóng tối và ỏ nhiệt độ không cao lam, vì ánh sáng mặt trời làm giảm hàm lượng chất chát, nhiệt độ cao làm tăng quá trình oxi hoá và tạo th àn h các chất không tan Ngoài ra, tấ t cả các ch ất chát đểu tan trong nước lạnh và bị thuỷ phân dưối tác dụng của các enzim có trong nấm mốc

Vì vậy các mau phân tích chất chát phải giữ khô, tránh ẩm, mốc như:

• Đật mảu (lá, rễ) vào chỗ tối

sấy khô khống quá 60°c.

Sấy khỏ mẫu đến trạn g thái khô giòn

T ránh mưa, sương, đ ấ t ẩm

Phòng tránh mốc

Phương pháp so màu chỉ là một phần của phương pháp quang phỏ hấp thụ Phương pháp quang phô hấp th ụ củng chỉ là một phần của phương pháp quang học Trong hoá sinh, các phương pháp đo quang phô thường được cìo trong dải bước sóng từ

2 2 0 đến 800nm Dải quang phố này lại được chia thành vùng tứ ngoại (dưối 380nm), vùng khá kiên (trên 380nm) và vùng hồng ngoại (trên 800nm) Vùng hồng ngoại có rất

ít ứng dụng trong thí nghiệm hoá sinh Còn vùng kha kiên (ánh sáng thây) lại dùng trong phương pháp phân tích so màu

Đề biết màu được đo như th ế nào, trước hết phải hiểu được m àu ]à gì? Khi dòng ánh sáng trắn g xuyên qua một dưng dịch màu, các bước sóng n h ấ t định (tuỳ thuộc vào bản chất của dung dịch) sẽ bị hấp thụ, trong khi những bước sóng khác thì gần như không bị ánh hương Màu của dung dịch sẽ là màu của những bưóc sóng không hấp thụ Những điểu đó được tống kêt một cách đơn giản trong bíing 3.1

Báng 3.1 - Tính chất màu dung dịch trong vùng ánh sáng trắng

hấp th ụ bới dung dịch màu Ví dụ: đế đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch màu

đỏ thì dùng á n h sáng vàng - xanh da trời (chính là ánh sáng xanh lá cây) là thích hợp nhất Tốt n h ấ t là dùng ánh sáng của một bước sóng riêng (ánh sáng (lờn sảc) Anh sáng đơn sắc này có thê được tạo ra từ giấy lọc, lăng kính hoặc là cách tử nhiều xạ trong máy so màu và máy quang phô

Nêu á n h sáng đơn sắc xuyên qua một dung dịch màu thì cường cỉộ ánh sáng hấp

th ụ sẽ phụ thuộc vào:

- Độ dài đường á n h s á n g qua dung địch

- Nồng độ của chất ta n hấp th ụ ánh sáng.

Môi liên hệ nàv được biểu hiện bằng định luật Lambert- Beer trong phương trình

Ie - cường độ của tia đi raK- hệ sô" tắ t hoặc chỉ sô hấp thụ phán tử (cũng có thể được dùng 6

th ay K)

c - nông độ dung dịch

1 - chiểu dài của ánh sáng qua dung dịch (thường là lcm)

độ hấp th ụ (A- absorbancy) Trong thực hành, giá trị này không phải tính mà thu được trực tiếp từ mấy đo

II ĐỊNH LUẬT LAM BERT- B EER

Từ phương trình (3.1) dễ dàng thấy rằng khi 1 (độ dài) được giữ không đổi thì mật

độ quang sẽ tỷ lệ th u ậ n trực tiêp với nồng độ của chất màu Vì vây, đường ch u ẩ n (sè là một đưòng thẳng) có thể được vẽ từ một dãy các (lung clịch chuẩn vối những nồng độ khác nhau (hình 3.1)

Nồng độ của một dung dịch nghiên cứu sẽ được xác định dựa trẽn đường chuấn này Tuy nhiên, không phai lúc nào củng cần phải vẽ một đường chuẩn Vì có th ế tính được nhò sự liên quan giữa dung dịch nghiên cứu (u) và dung dịch chuẩn (S):

Khi tăng chiều dài (1) cũng như tăng nồng độ thì m ật độ quang (OD) sẽ tăng tỷ lệ

th u ậ n vối chúng chứ không phải độ hấp thụ ánh sáng

Ví dụ: nêu dung dịch có nồng độ C ì hấp thụ 50% ánh sáng thì dung dịch có nồng

Trong Iihiểu trường hợp độ hấp thụ và nồng độ không tỷ lệ thuận

Do đó, cần phải xác định giới hạn nồng độ, chỉ áp dụng định luật Lambert-Beer ó’

phần nồng độ táng tuyên tính Khi quan hệ giữa hai yếu tố này không phải là cỉưòng

thang tuyên tính thì không dùng được công thức (3.1) Trong trường họp này phải xây dựng một đường chuẩn và giá trị dung dịch nghiên cửu dược xác định trực tiếp từ

(lường chuẩn Đê so màu, người ta chọn điếu kiện sao cho mật độ quang (OD) nằm trong khoảng 0 ,1 -1 : tốt nhất là 0 2 -0 ,5.

III M À U D U N G DỊCH VÀ C H Ọ N BƯỚC S Ó N G Á N H S Á N G (HAY C H Ọ N KÍNH LỌC M À U )

M àu của dung dịch là do sự hấp thụ không đồng đểu các vùng khả kiên Khi cho ánh sán g tr ắ n g đi qua dung dịch màu không phải tấ t cả các tia cua phố đều bị hâp thụ vối mức độ giông nhau, có phần tia bị hấp thụ mạnh, có phan tia hình như không

bị hấp thụ Mỗi (lung dịch màu của các hợp chất khác nhau có đường cong hấp thụ khấc n h a u hay có phổ hấp thụ khác nhau Đê có đường cong hấp thụ, người ta tiên hành đo m ật độ quang của dung dịch màu đó ở các bưỏc sóng khác nhau Trên trục hoành của đồ thị là độ dài của bưỏc sóng ánh sáng từ 400nm (tím) đẻn 700nm (đỏ) Trên trục tu n g ctồ thị ghi giá trị mật độ quang (OD) Điếm cực đại của cìường cong là dạc tính q u a n trọng của hợp chat màu Khi nói hệ sô" hấp thụ phân tử của một chất

màu nào đó có nghĩa là trị sô" đó đủ được đo ổ vùng phổ mà á n h sáng bị hấp thụ cực đại

(hình 3.2)

Hinh 3.2 - Đường cong hấp thụ của dung dịch axeton coban sunfoxianua(1)

và của sắt sunfoxianua (2)

N hửng dung dịch có mầu trong các thí nghiệm sinh học ít khi chứa những màu đơn giản và cơ bản Do đó, việc lựa chọn bước sóng đúng đê dùng sẽ không phải là một

v ấn clề dễ dàng mà phải được xác định bằng thực nghiệm Những ký hiệu của màu

n hư đỏ, xanh, vàng thiếu chính xác so vổi bước sóng của ánh sáng (X) thường được

dùng Mối liên quan giữa bưỏc sóng và màu được giới thiệu ỏ hình 3.3.

1 T h í n g h iê m 1 - Liên hệ giữa các màu và các bướic sóng.

Đặt một mẩu giấy trắng nhỏ trên đường tia sánjg truyền qua trong một máy

quang phể (theo hướng dẫn) và ghi lại màu của tia s á n g tại những bước sóng khác

nhau

*Chú ý: Đơn vị của bước sóng (X) lànm

Hãy cho biết

ln m = m

lnm = Â (đòn vị này không được dùng cho X).

2- T h í n g h iê m 2 - Đồ thị độ hấp thụ của chất màu thực phẩm

1 Quan sát màu sắc của 3 chất màu thực phẩm được đưa ra và dự đoán các đỉnh hấp th ụ sẽ là bao nhiêu dựa trên bảng màu - bưóc sóng ỏ* trên

Chất màu thực

phẩm

Màu của chất màu thực phẩm

Dự đoán đỉnh trong phạm vi màu

Dự đoán đỉnh tạ i vị trí bước sóng (nm)A

Sử dụng máy so m àu hoặc máy quang phố để phân tích những dung dịch này theo

phướng pháp so m àu thì đọc ỏ bưóc sóng nào là tốt n hất ?

Bưốc sóng tốt

n h ấ t cho phân tích (nm)A

B

c

4 Đ ỉnh h ấp th ụ của dung dịch xanh lá cây là bao nhiêunm ?

5 Cho một dung dịch xanh lá cây đã pha loăng 50%, độ hấp th ụ dự tính là bao

nhiêu?

6 T rộn 5ml ch ấ t m àu xanh lá cây vối 5ml nước không ion hoá (nước cất) Sau

đó xác định độ hấp th ụ của cả chất màu ban đầu và ch ất màu đă bị pha loãng bằng

máy quang phố ở đỉnh bước sóng

7 Có dung dịch xanh lá cây vối nồng độ lổn gấp 5 lần Hăy dự đoán độ hấp thụ

của dung dịch này là bao nhiêu ?

8 Đọc độ h ấp th ụ bằng máy quang phổ

9 Độ hấp th ụ của dung dịch này có lơn gấp 5 lần độ hấp th ụ của dung dịch ban

đầu không ? G iải thích tại sao ?

3 T h í n g h iệ m 3 - Minh hoạ định lu ậ t Lam bert - Beer

1 Sắp xếp các ông nghiệm theo bảng sau T hành phần của các ổng nghiệm

trí sô' 0 Sau đó ghi lại độ hấp th ụ của mỗi dung dịch

3 Sinh viên được cung cấp một chất m àu không biết nồng độ Ghi lại độ hấp

th ụ của dung dịch nghiên cứu này

4 Báo cáo th í nghiệm:

- Vẽ đồ th ị độ hấp th ụ A* và nồng độ của chất màu (^Ag/ml trong mỗi ống nghiệm)

- Đồ th ị có tu â n theo định lu ậ t Lam bert- Beer không ?

- Nồng độ cùa chát màu nghiên cứu là bao nhiêu ? í Đưa vể đoìi vi ng/ml.

4 T h í n g h iệ m 4 — Định lượng hiđratcacbon bằng ị phương pháp so m àu

a) Đ ịnh lương glucozơ hằng p h ư ơ n g p h á p so rmàu Somogyi - Nelson

- Nguyên tắc

Vì phần lốn các hợp chất sinh học là khóng màu inẻn phương pháp p h ản tích so màu thường đòi hỏi phải có một phản ứng đầu dế tạo rra một sán phẩm có m àu Phán ứng này được tiên hành dưỏi những điêu kiện sao cho !lượng màu tạo th àn h phải tỉ lộ

th u ận vối nồng độ của hợp chất được p h ân tích

Ví dụ: phân tích glucozd bằng phương pháp Somoggyi • Nelson Trong th í nghiệm

này, muôi đồng bị khử trong dung dịch kiêm Khi thêmi dung dịch arseno-m olypđat, đồng oxit hình th àn h ỏ giai đoạn đẩu cua quá trinh khư sẽ phan ứng vối arseno- moiypđat, tạo th à n h một dung dịch m àu xanh (két hỢ]p giữa xanh da tròi và xanh lá cây) Màu của (lung dịch tỷ lệ th u ậ n vối nồng độ của chường khứ (dường khứ là bất cử phân tử đường nào có chứa một nhóm an đ eh it hay xetoỉtt)

Thí nghiệm này cho các loại (tường khác nhau

4 Đo cường độ tạo th àn h bang máy quang phô ỏ 500nm dùng ống nghiệm sô 1

làm đôi chứng Ông nghiệm này là ông thuốc thứ trắng và dùng cỉể hiệu chỉnh màu của thuốc thử.

- Báo cáo th í nghiệm:

1 Vẽ một cìồ thị chuẩn cho glucozơ từ giá trị thu đưọc của các ông nghiệm sô 1 đến

sô 5 Đổ thị này có tuân theo định luật Lam bert - Beer không ?

2 So sân h giâ trị thu được của ống sô 5, 6 , 7 Chúng có giông nhau không ? Giai thích.

3 Tinh lượng đường khứ trong dung dịch, chuyến th ăn h đơn vị mg/ml

b) Đ ịnh lương glucozơ bằng phương p h â p d ù n g enzim glucooxidaza

N guyín tắc

Câc kỳ th u ậ t hoâ học dùng trong quâ trìn h phđn tích gluxit thiíu tính đặc trưng Khi tiín h ăn h th i nghiệm bằng phương phâp dùng enzim glucooxidaza sỉ cho kít quả tốt hơn nhiều Enzim năy oxi hoâ glucozơ tạo th ă n h axit gluconic vă H20 2- Thuốc thử

có peroxidaza sẽ khử peroxit (H./).,) thănli nước với sự có m ặt của chất cho hiđro thích hựp C hất cho hiđro (o-toluiđin) sẽ bị oxi hoâ đí tạo ra mău,

3 Tiếp tục cho thím 0,5ml HC1 IM vẳ, trộ n đểu vă đọc ở bước sóng 680nm

Bâo câo th í nghiệm:

1 Ví đồ th ị c h u ẩn từ giâ trị đo được của ống sô 1 đến ông số 5 Kết quả có tuđn

theo định lu ật L am bert - Beer không ? Nếu tín h nồng độ bằng công thức năy thì đến nồng độ g]ucozơ năo mă định lu ậ t L a m b e rt« Beer văn được dùng

2 Nồng độ của glucozd trong hỗn hợp lă bao nhiíu ?

3 Kẻ bảng ghi nồng độ của glucozơ vă fructozơ trong dung dịch Thể hiện bằng đơn vị Ịig/ml vă mM

4 Xylozơ được đưa văo p h ầ n a vă b để lăm gì vă nó đê chứng minh được điíu gì ?

T râ lời một câch định lượng

c) H oâ c h ấ t

- Dung dịch glucozơ 100|Ag/ml

- Dung dịch fructozd 100fig/m]

• Dung dịch xylozơ 100|ig/ml

- Dung dịch HC1 1M

- Thuôc thử arseno-molypđat:

Cân 25g amoni molypdat [(NH t):,MoO j] hoà ta n trong 450ml nước cất, cho thêm 31ml H2S 04 đặc, trộn đểu, cho thêm 3g n atri a rse n a t (Na2H A s0 ít.7H.,0) Trộn lẫn hai dung dịch, ủ ở nhiệt độ 37°c từ 24 - 48 giờ hoặc đun nóng đến 55°c và giữ ở nhiệt độ

này 25 phút C ất dung dịch trong lọ màu Dung dịch có màu vàng và bển

- Thuốc th ử Somogyi:

+ Thuôc th ứ đồng I: Cân 200g N a2S 04 khan hoặc 356g N a2SO J.10H.,0 hoà vào 600ml nước cất nóng Cho thêm 25g muôi Seignette (kali - n atri - tactrat) (KNaC<lH40 G.4H20), Cho vào bình định mức 1 lít Lọc nếu dung dịch vẩn đục Tốt

n h ất bảo quản ở nhiệt độ 37°c Trong trường hợp xuất hiện tinh thể thì được hoà

ta n lại bằng cách đun nóng nhẹ trên bình cách thuỷ

+ Thuốc th ử đồng II: Dung dịch CuSOị 5H20 15%, cho thêm 1 - 2 giọt HvSO.ị đặc Thuốc thử Somagyi là dung dịch hỗn hợp thuốc thử đồng I và đồng II theo tỷ lệ 25:1