ứng dụng của enzyme trong y học

GIỚI THIỆUCác macrophagesĐại thực bào tiếng Anh: "macrophage" là những tế bàobạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịchkhông đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặ

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CNSH - KTMT

NHÓM: 7

BÀI BÁO: Anti-inflammatory activity of a sulfated polysaccharide isolated from an enzymatic digest of brown

seaweed Sargassum horneri in RAW 264.7 cells

GVHD: ĐỖ THỊ HIỀN

1 GIỚI THIỆU 4

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6

2.1 VẬT LIỆU 6

2.2 HÓA CHẤT 6

2.3 PHƯƠNG PHÁP 6

2.3.1 CHUẨN BỊ CÁC ENZYME TIÊU HÓA S HORNERI 6

2.3.2 TÁCH CÁC POLYSACCHARID THÔ TỪ ENZYME TIÊU HÓA 7

2.3.3 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7

2.3.4 NUÔI CẤY TẾ BÀO 8

2.3.5 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CỦA TẾ BÀO 8

2.3.6 PHÂN TÍCH WESTERN BLOT 9

2.3.7 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 10

3 KẾT QUẢ 11

3.1 Năng suất khai thác và các thành phần chung 11

3.2 Phổ FT-IR của CP 11

3.3 CCP cho thấy hiệu quả ức chế cao nhất đối với sản xuất NO trong tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS mà không có độc tới tế bào 12

3.4 Liều lượng CCP phụ thuộc vào sự giảm tiết PGE2 khỏi các tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS 13

3.5 CCP làm giảm mức biểu hiện của iNOS và protein COX-2 trong các tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS 13

3.6 CCP làm giảm sự tiết của các cytokine tạo viêm từ các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS14 3.7 CCP ức chế sự truyền tín hiệu NF-κB và MAPK trong các tế bào RAW 264.7 kích thích B và MAPK trong các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS 15 4 THẢO LUẬN 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

1 GIỚI THIỆU

Các macrophages(Đại thực bào (tiếng Anh: "macrophage") là những tế bàobạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịchkhông đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống.Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và cáctác nhân gây bệnh) đóng một vai trò quan trọng trong các phản ứng viêmthông qua việc giải phóng các yếu tố viêm khác nhau như nitric oxide (NO),Prostaglandins( (PG) là các acid béo không bão hòa ở các mô, có vai trò nhưmột chất trung gian hóa học của quá trình viêm và cảm nhận đau, ngoài ra còn

có các tác dụng sinh lý ở các mô riêng biệt), enzym tổng hợp oxi nitric(iNOS), cyclooxygenase (COX) -2 và các cytokine như yếu tố hoại tử khối u(TNF - tumor necrosis factor) Α và interleukin (IL) -6 [1,2] Đặc biệt, các đạithực bào có thể được kích thích bởi các cytokine pro-inflammatory vàendotoxin như lipopolysaccharide (LPS) và nó gây phản ứng viêm [1] Ngoài

ra, nó đã được chứng minh rằng trong quá trình viêm, sự phát triển bất thườngcủa NO và prostaglandin E2 (PGE2)(PGE là một loại tan trong môi trườngEther trong đó đặc biệt là PGE2 được giải phóng do kích thích cơ học, hóahọc, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạchgây viêm và đau.) là do sự kích hoạt của iNOS và COX-2 được biết đến như

là hai chất trung gian gây viêm pleiotropic điều hòa tập trung tiểu cầu, thấmqua mạch và Sự hình thành thrombus(một là một cục máu đông gậy để cácbức tường của một mạch máu hoặc cơ quan Đôi khi một thrombus có thể cảntrở các tàu Điều này là có hại vì nó ngăn chặn dòng chảy của máu.) [2].Ngoài ra, kích thích LPS có thể điều chỉnh biểu hiện của COX-2 và iNOS vàcác chất bài tiết của TNF-α, IL-1β, và IL-6 được biết đến như các cytokine

pro-inflammatory chính bằng kích hoạt yếu tố hạt nhân-kB (NF-κB) (MAPK)B) (MAPK)được gọi là phân tử thượng lưu của nó [2,3] Do đó, việc ức chế các chấttrung gian gây viêm và cytokine có thể là một cách tiếp cận hữu ích để điềutrị các bệnh viêm.

Môi trường biển được xem là một kho tàng vô giá của các hợp chất hoạttính sinh học vì chúng có các biến thể hóa học và sinh học lớn [4] Trong sốcác sinh vật biển đã được nghiên cứu, rong biển nâu có nhiều hợp chất vớinhiều hoạt tính sinh học, bao gồm các phản ứng chống viêm, chống oxy hóa,chống vi khuẩn và bảo vệ thần kinh [5] Các nghiên cứu in vitro và in vivogần đây cho thấy các polysaccharides phân lập từ tảo biển có khả năng điềutrị tuyệt vời chống lại các phản ứng viêm [6] Việc cô lập các hợp chất hoạttính sinh học từ rong biển phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện chiết xuất Tuynhiên, một lượng lớn các polysaccharides trong các rong biển này hoạt độngnhư một rào cản vật lý hạn chế việc sử dụng các phương pháp chiết xuất hóahọc và cơ khí truyền thống Do đó, các phương pháp chiết xuất có hỗ trợenzyme (EEMs) có thể tiêu hóa các thành tế bào thường được sử dụng để côlập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ rong biển [7] Các chiết xuất enzymenày cho thấy tính an toàn của thực phẩm tăng lên và tính hòa tan trong nước

so với các chất chiết xuất dung môi hữu cơ, đây là một lợi thế khi sử dụngEEMs bổ sung vào dung môi chiết [8]

Sargassum horneri (S horneri) là một loài tảo nâu có thể ăn được, pháttriển trong khu vực bãi triều như là một loài hàng năm dọc theo bờ biển TrungQuốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Thân hình của S horneri có thể đạt chiều dàitrên 7 m và trọng lượng tươi là 3 kg [9] Các báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng

S horneri bao gồm vitamin, axit amin và polysaccharides đã được sử dụngnhư một nguồn thực phẩm cũng như một thành phần trong y học cổ truyền

trong hàng ngàn năm ở các nước châu Á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản vàTrung Quốc [10,11 ] Theo các báo cáo trước đây, polysaccharide sulfate vàmột số chất chiết xuất từ S horneri đã gây ra các đặc tính sinh học mạnh mẽtrong điều kiện in vitro như tính chất chống oxy hoá và chống ung thư [12].Tuy nhiên, có rất ít thông tin về khả năng chống viêm của polysaccharidesphân lập từ chủng S horneri Trung Quốc và cơ chế sinh học của nó Hơn nữa,trong vài năm gần đây, một số lượng lớn S horneri đã di chuyển vào bờ biểnđảo Jeju từ bờ biển phía đông của Trung Quốc và gây ra thiệt hại đáng kểtrong ngành đánh bắt cá và vẻ đẹp của bờ biển xung quanh đảo Jeju Tại thờiđiểm này, việc sử dụng S horneri là rất quan trọng để giải quyết các vấn đề ởHàn Quốc đã gây ra từ rong biển này Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi

đã chuẩn bị 4 loại polysaccharides thô từ chủng S horneri China bằng cách sửdụng bốn loại enzyme thực phẩm bao gồm amyloglucosidase (AMG),Celluclast, Viscozyme và Alcalase và đánh giá các hoạt động chống viêm và

cơ chế sinh học của chúng

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

S horneri Trung Quốc đã được thu thập từ tháng 5 đến tháng 6 năm

2015, dọc theo bờ biển đảo Jeju ở Hàn Quốc S horneri của Trung Quốc đã đượcViện nghiên cứu đa dạng sinh học Jeju (Jeju, Hàn Quốc) xác định

2.2 HÓA CHẤT

Dòng tế bào macrophage RAW 264.7 đã được mua từ Ngân hàng Dòng TếBào (KCLB, Seoul, Hàn Quốc) Chất trung gian Eagle được cải tiến củaDulbecco (DMEM), penicillin-streptomycin và huyết thanh của bào thai bò(FBS) đã được mua từ Gibco BRL (Burlington, ON, Canada) Các sản phẩm này

đã được mua lại dưới dạng bột KBr của FT-IR, 3- (4, 5-dimetylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), fucoidan(sản phẩm F5631-1G) Từ Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Hoa Kỳ) Ba enzymephân hủy carbohydrate (AMG, Celluclast, và Viscozyme) và một protease(Alcalase) được mua tại Novo Nordisk (Bagsvaerd, Đan Mạch) Các bộ dụng cụELISA cho TNF-α, IL-1β và PGE2 được mua từ R & D Systems Inc.(Minneapolis, MN, USA) Tất cả các hóa chất và thuốc thử khác được sử dụngtrong các thí nghiệm này đều thuộc nhóm phân tích.

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 CHUẨN BỊ CÁC ENZYME TIÊU HÓA S HORNERI

Các mẫu S horneri đã đông khô đã được đồng nhất với một máy xay đểthu được bột mịn Các phản ứng thủy phân enzyme được thực hiện bằng cách sửdụng các phương pháp của Heo et al [số 8] Tóm lại, 2 g bột S horneri đã được

ủ trong 100 mL nước cất (DW) với 20 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,l hoặc 20 mg AMG, Celluclast,Viscozyme, hoặc Alcalase ở nhiệt độ và độ pH tối ưu như Heo và cộng sự đã mô

tả [số 8] Sau 24 giờ, các mẫu được ly tâm ở 2.774 × g trong 10 phút và các dịchnổi trên bề mặt được lọc với Watman No.4 (GE Healthcare, Buckinghamshire,Anh) Sau đó, các dịch nổi trên bề mặt được làm khô bằng đông lạnh và được sửdụng làm enzym tiêu hóa

2.3.2 TÁCH CÁC POLYSACCHARID THÔ TỪ ENZYME TIÊU

HÓA

Các polysaccharides thô đã được điều chế từ bốn chất chiết xuất từ enzyme theo phương pháp của Shao et al [13] với một số sự thay đổi nhỏ Tómlại, các enzyme tiêu hóa được trộn với 95% ethanol đến một nồng độ cuối cùng

là 66% Hỗn hợp được bảo quản ở 4 ℃ trong 24 giờ, và sau đó các chất kết tủa trong 24 giờ, và sau đó các chất kết tủa

được thu nhận bằng cách ly tâm ở 10.000 xg trong 20 phút ở 4 ℃ trong 24 giờ, và sau đó các chất kết tủa Các kết tủađược làm khô bằng đông lạnh và được sử dụng làm polysaccharides thô (CPs).Các CPs đông khô đã được giải thể trong PBS để sử dụng trong các thí nghiệm.Các CP được tách ra từ bốn loại enzym tiêu hóa với AMG, Celluclast,Viscozyme, và Alcalase được chỉ định như sau AMGCP, polysaccharides thô từquá trình tiêu hoá enzym AMG; CCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêuhoá enzyme Celluclast; VCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóaenzyme Viscozyme; AlCP, polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzymeAlcalase.

2.3.3 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Tổng hàm lượng polysaccharide được đo bằng phương pháp axit phenolsulfuric như được mô tả bằng phương pháp được mô tả bởi DuBois et al [14] sửdụng glucose làm chuẩn Tổng hàm lượng phenol được định lượng bằng cách sửdụng một hệ thức được mô tả bởi Chandler và Dodds [15] Bằng cách sử dụngaxit gallic làm chuẩn Hàm lượng protein của tất cả các mẫu được định lượngbằng cách sử dụng bộ xét nghiệm Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, Rockford, IL, USA) sử dụng albumin huyết thanh bò theo tiêu chuẩn.Cuối cùng, hàm lượng sulfat trong CP đã được kiểm tra bằng phương phápBaCl2 gelatin bằng Na2SO4 theo tiêu chuẩn như được mô tả bởi Saito và cộng sự[16] với những thay đổi nhỏ

Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).

Các phổ hồng ngoại của CP được ghi lại bằng quang phổ FT-IR (quang phổNicolet ™ 6700 FT-IR, Madison, WI, USA) Các CPs đã được đồng nhất với bộtKBr và sau đó ép thành viên để đo FT-IR trong dải tần số 500-4000 cm-1

2.3.4 NUÔI CẤY TẾ BÀO

Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS khônghoạt hóa, 1% streptomycin (100 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) và penicillin (100 đơn vị / mL) Các tếbào RAW 264.7 được ấp dưới 5% CO2 tại 37 ℃ (Vườn ươm Sanyo MCO-18AICCO2, Moriguchi, Nhật Bản) Các tế bào nuôi cấy từ đoạn 4-6 đã được sử dụngcho các thí nghiệm.

2.3.5 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CỦA TẾ BÀO

Các cytotoxicity của CPs để RAW 264,7 tế bào đã được đánh giá thông quacác thử nghiệm MTT colorimetric như được mô tả bởi Mosmann [17], với nhữngsửa đổi nhỏ Tóm lại, các tế bào (1 x 105 tế bào / mL) đã được gieo trong mộttấm 24 giếng và ủ trong 24 giờ Sau đó, các tế bào được điều trị bằng CP (50 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g /

mL và 100 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) trong 24 giờ Thuốc thử MTT (200 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) được thêm vàomỗi giếng Sau 3 giờ ủ, các tinh thể formasan đã được hòa tan trong DMSO, vàlượng formazan xanh-đen được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở 540 nm Mật

độ quang phổ của formazan tạo ra trong các tế bào kiểm soát không được điều trịđược coi là đại diện cho khả năng sống sót 100% Dữ liệu được biểu diễn dướidạng phần trăm trung bình của các tế bào khả thi so với các kiểm soát tương ứng

540 nm sử dụng máy đọc ELISA (BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA)

Mật độ quang học của NO được sản xuất trong các tế bào được điều trị LPS chỉđược coi là đại diện cho 100% Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng tỷ lệ phần trămtrung bình của sản xuất NO so với sản xuất NO của tế bào được điều trị LPS

Xác định sản xuất PGE2

Prostaglandins( (PGE2) là các acid béo không bão hòa ở các mô, có vai trò

làm giảm thành mạch, tăng tính thấm thành mạch, gây viêm và đau ngoài ra còn

có các tác dụng sinh lý ở các mô riêng biệt) đóng một vai trò quan trọng trong

việc điều chỉnh phản ứng viêm [19] Các tế bào RAW-264.7 được nuôi cấy vàđiều chỉnh với nồng độ (1 x 105 tế bào / ml) các polysaccharide đo được, và sau

1 giờ ủ, tế bào được kích thích với LPS (1 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) Sau 24 giờ ủ, nồng độ PGE2trong chất nổi lên được định lượng bằng cách sử dụng một bộ thử miễn dịchenzyme cạnh tranh, theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Đo lường sản xuất TNF-α và IL-1β.

Tế bào RAW 264.7 (1 x 105 tế bào / giếng) đã được xử lý trước bằng CCP(25 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL, 50 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL, và 100 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) trong 1 giờ và ủ với LPS (1 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL)trong 24 giờ Các mức sản xuất TNF-α và IL-1β trong tế bào chất macrophageđược định lượng bằng các bộ dụng cụ ELISA, theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.3.6 PHÂN TÍCH WESTERN BLOT.

Để xác định hiệu quả của CCP đối với mức biểu hiện protein của iNOS,COX-2, NF-κB) (MAPK)B, và MAPK trong các tế bào RAW 264.7 kích thích LPS, việcphân tích Western blot đã được thực hiện Tóm lại, các tế bào RAW 264.7 (1 x105cells / mL) đã được gieo trong 6-giếng và ủ trong 24 giờ Các tế bào đượcđiều trị bằng CCP (25 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL, 50 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL và 100 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) trong 1 giờ Và sau

đó, các tế bào được kích thích với LPS (1 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g / mL) trong 10 phút hoặc 20 phút và

24 giờ Các protein nucleic và cytosolic được chiết xuất từ các tế bào bằng bộ

chiết xuất hạt nhân và tế bào chất của NE-PER® (Thermo scientific, Rockford,USA).

Sau khi tách trên một gel SDS-polyacrylamide 10% dưới điều kiện biếntính, các protein tế bào chất (40 μl hoặc 20 mg AMG, Celluclast,g) được truyền điện trên một màngnitrocellulose Sau khi chặn sữa non 5% trong 1 giờ, các blot được ủ riêng vớicác kháng thể chính sau đây: các kháng thể polyclonal thỏ (iNOS, p44 / 42(ERK, kinase điều hoà tín hiệu ngoại bào), phosphoryl hóa p44 / 42 (ERK), P38,phosphoryl hóa p38, NF-κB) (MAPK)B p65, NF-κB) (MAPK)B p50, và nucleolin), và các kháng thể đơndòng chuột (COX-2, và β-actin) (Công nghệ báo hiệu bằng tế bào, Beverly, MA,USA) trong 1 giờ Các blot được rửa hai lần với Tween 20 / dung dịch đệm Tris(TTBS) và sau đó ủ với IgG liên hợp HRP hoặc IgG chống lại thỏ trong 45 phút

Sự liên kết kháng thể được hình dung bằng cách sử dụng thuốc thử hóa học tănghóa học (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) Nồng độ bazơ của mỗiprotein được bình thường hoá bằng cách phân tích mức độ protein β-actin hoặcnucleolin bằng cách sử dụng chương trình ImageJ

3 KẾT QUẢ

3.1 Năng suất khai thác và các thành phần chung

Trước hết, chúng tôi chuẩn bị bốn loại enzyme chiết xuất từ S honeri vàkiểm tra năng suất chiết xuất của chúng Kết quả cho thấy sản lượng khai thác củaenzym tiêu hóa (AMG, 16,00 ± 0,50%, Celluclast, 20,17 ± 0,76%, Viscozyme,21,0 ± 1,00% và Alcalase, 22,17 ± 0,76%) tăng đáng kể so với của chiết xuất DW(9,50 ± 0,87%).

Tiếp theo, chúng tôi phân lập polysaccharides thô từ các enzyme tiêu hóa(CPs) và phân tích sản lượng cô lập và thành phần gần nhau Trong số CP, CCP đãdẫn tới sản lượng cô lập cao nhất (88,7%), so với các sản phẩm khác (AMGCP,VCP và AlCP) Như được chỉ ra trong Bảng 1, bốn loại CPs chứa polysaccharide

là chính và hàm lượng protein và polyphenolic nhỏ Đặc biệt, CCP có hàm lượngpolysaccharide và sulfate cao nhất (tương ứng là 88,7 ± 2,44% và 12,01 ± 0,98%)

Từ những kết quả này, chúng tôi chỉ ra rằng các CCP riêng lẻ có thể tạo cácpolysaccharides sulfate do các thành phần polysaccharide và sulfate dồi dào

BẢNG 1: Các thành phần tổng hợp của polysaccharide thô

Tất cả các giá trị trung bình SD ± (n = 3) Các chữ cái khác nhau trong cùng cột có nghĩa là sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu ở mức P <0,05 bằng xét nghiệm đa lớp của Duncan AlCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzym enzym alcalase; AMGCP, polysaccharides thô từ quá trình tiêu hoá enzym AMG; CCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hoá enzyme celluclast; VCP, các polysaccharides thô từ quá trình tiêu hóa enzyme viscozyme.

3.2 Phổ FT-IR của CP

Quang phổ FT-IR là một cách tiếp cận phân tích hữu ích để xác định daođộng giữa các nguyên tử khác nhau trong các phân tử Phổ thu được từ 400-4000cm-1 có thể được sử dụng để phân tích các đặc tính cấu trúc của polysaccharides,bao gồm các liên kết glucosidic và các nhóm chức [20,21] Trong nghiên cứu này,quang phổ FT-IR của bốn CPs được so sánh với quang phổ của loài tảo đá mua từSigma-Aldrich Điều thú vị là, CCP có phổ hồng ngoại tương tự như phổ loài tảo

đá thương mại (Hình 1) Ngược lại, AlCP cho thấy một mô hình hoàn toàn khác sovới các CP khác và loài tảo đá thương mại Một báo cáo cho rằng sự hấp thụ mạnh