Ứng dụng hóa mô miễn dịch trong nghiên cứu ung thư vú tại bệnh viện ung bướu nghệ an

Hình 1.3 UTBM tuyến vú tại chỗ DICS và UTBM tuyến vú xâm nhập Hình1.4 Cấu trúc không gian thụ thể Her2và sự kết cặp của các thành viên thuộc họ thụ thể Her2 Hình 1.5 Yếu tố tăng trưởng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

TRẦN THỊ TUYỂN

ỨNG DỤNG HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ VÚ TẠI BỆNH

VIỆN UNG BƯỚU NGHỆ AN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Nghệ An-2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

TRẦN THỊ TUYỂN

ỨNG DỤNG HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ VÚ TẠI BỆNH

VIỆN UNG BƯỚU NGHỆ AN

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp chương trình đào tạo Thạc sĩ khóa học 2012- 2014, tôi xin được gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy, các cô, các anh chị em đã luôn bên cạnh, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian qua

Trước hết, tôi xin gửi lời cám ơn tới các thầy, các cô khoa Sinh học đã định hướng và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu cho sau này

Xin được gửi đến lòng biết ơn và kính trọng tới người thầy là TS.BS Nguyễn Quang Trung- GĐ Bệnh viện Ung bướu Nghệ An và người cô là TS Nguyễn Thị Giang An đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong thời gian làm đề tài

Xin gửi lời cảm ơn tới Ths Bs Trần Đức Hùng cùng các anh, chị em trong Khoa Giải phẫu bệnh- Tế bào đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực tập Cám ơn các thầy cô trong Trung tâm Thực hành- Đại học Vinh cùng các bạn học viên đã luôn bên cạnh và động viên tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghệ An, tháng 10 năm 2014

Tác giả

Trần Thị Tuyển

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

DANH MỤC CÁC HÌNH, ẢNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu ung thư vú trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Tại Việt Nam 4

1.2 Sơ lược về giải phẫu, mô học và sinh lý tuyến vú 5

1.3 Dịch tế học, các yếu tố nguy cơ ung thư vú 8

1.2.1 Khái niệm về ung thư 8

1.2.2 Dịch tễ học ung thư vú 9

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ 10

1.4 Đặc điểm sinh học phân tử của ung thư vú 12

1.4.1 Protooncogen 12

1.4.2 Các yếu tố thụ thể nội tiết progesterone và estrogen 13

1.4.3 Gene sinh ung thư Her2/neu (ERB_B2) 14

1.5 Phân loại ung thư biểu mô tuyến vú 17

1.3.1 Phân loại TNM ung thư biểu mô tuyến vú 17

1.3.2 Phân loại mô học các ung thư biểu mô vú theo WHO năm 2003 19

1.6 Đặc điểm một số loại ung thư biểu mô tuyến vú thường gặp 21

1.4.1 Ung thư không xâm nhập (bao gồm cả bệnh Paget) 21

1.4.2 Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập 22

1.4.3 Ung thư biểu mô tiểu thùy xâm nhập 22

1.4.4 Ung thư biểu mô ống nhỏ 22

1.4.5 Ung thư biểu mô thể tủy 22

1.4.6 Ung thư biểu mô thể nhầy 23

1.7 Đặc điểm độ mô học của ung thư vú 23

1.8 Phân loại các nhóm phân tử ung thư vú 24

1.9 Hóa mô miễn dịch 26

1.7.1 Lược sử phát triển 26

1.7.2 Nguyên lý của phương pháp HMMD 27

1.7.3 Các kỹ thuật nhuộm miễn dịch men 29

1.7.4 Yêu cầu 29

1.7.5 Ý nghĩa 29

1.7.6 Vai trò của HMMD trong chẩn đoán ung thư vú 30

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.1 Đối tượng 31

2.1.2 Thời gian 31

2.1.3 Địa điểm 31

2.2 Vật liệu nghiên cứu 31

2.2.1 Các kháng thể, dung dịch đệm rửa, bộc lộ kháng nguyên và hệ thống phát hiện của hãng Dako Cytomation( Đan Mạch) 31

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng 32

2.2.3 Hóa chất 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 33

2.3.2 Phương pháp chọn mẫu 33

2.3.3.Phương pháp mô học 33

2.3.4 Phương pháp hoá mô miễn dịch (DAKO, 2003) 34

2.3.5 Xử lý số liệu 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

3.1 Nghiên cứu đặc điểm chung 39

3.1.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 39

3.1.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 41

3.1.3 Phân bố bệnh nhân theo vị trí u 41

3.1.4 Kích thước u 42

3.1.5 Tình trạng di căn hạch 43

3.1.6 Chẩn đoán và xác định mô typ bệnh học 45

3.1.7 Độ mô học của các khối ung thư biểu mô vú xâm nhập 49

3.2 Hóamô miễn dịch 50

3.2.1 Đặc điểm biểu hiện của marker ER, PR và Her-2/neu 50

3.2.2 Sự biểu hiện của ER, PR, Her 2/neu với các yếu tố lâm sàng 54

3.2.3 Phân tuýp ung thư vú dựa vào sự biểu hiện của các marker phân tử 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

HER2/NEU : Human Epiderman growth factor receptor 2

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1.1 Tỷ lệ nữ mắc UTV ở Hà Nội giai đoạn 1996 – 1999

Bảng 1.2 Bảng phân loại TNM các giai đoạn UTV

Bảng 1.3 Phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (2003)

Bảng 2.1 Các loại kháng thể được sử dụng

Bảng 2.2 Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi

Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới tính

Bảng 3.3 Phân bố vị trí u trên cơ thể

Bảng 3.4 Kích thước khối u nguyên phát

Bảng 3.5 Sự tương quan giữa kích thước khối u và tình trạng di căn hạch

Bảng 3.6 Phân bố bệnh nhân ung thư vú theo loại mô học và mối liên quan với độ tuổi Bảng 3.7 Độ mô học của UTBM TV xâm nhập

Bảng 3.8 Biểu hiện của ER, PR, Her-2/neu

Bảng 3.9 Kết quả nhuộm ER(+), PR(+) của một số tác giả trong nước

Bảng 3.10 Tỷ lệ Her-2/neu (+) của các tác giả trong và ngoài nước

Bảng 3.11 Sự biểu hiện củaER, PR, Her-2/neu theo tuổi

Bảng 3.12 Sự biểu hiện củaER, PR, Her-2/neu theo loại mô học

Bảng 3.13 Sự biểu hiện củaER, PR, Her-2/neu theo độ mô học

Bảng 3.14 Sự biểu hiện củaER, PR, Her-2/neu theo với trạng di căn hạch

Bảng 3.15 Sự biểu hiện của các ER, PR, Her-2/neu theo kích thước khối u

Bảng 3.16 Phân loại ung thư vú dựa vào sự biểu hiện của ER, PR, Her-2/neu

Bảng 3.17 Mối tương quan đa biến giữa các marker phân tử và đặc điểm lâm sàng

DANH MỤC CÁC HÌNH, ẢNH

Hình1.1 Cấu tạo vú khỏe mạnh ở người trưởng thành

Hình 1.2 Cấu trúc vi thể mô vú bình thường

Hình 1.3 UTBM tuyến vú tại chỗ (DICS) và UTBM tuyến vú xâm nhập

Hình1.4 Cấu trúc không gian thụ thể Her2và sự kết cặp của các thành viên

thuộc họ thụ thể Her2

Hình 1.5 Yếu tố tăng trưởng thượng bì (EGFR) và thụ thể Her2 trên tế bào Hình 1.6 Sơ đồCác phân nhóm phân tử trong ung thư vú

Hình 1.7 Nguyên lý của phương pháp HMMD

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả quy trình nhuộm HMMD

Hình 2.3 Thang điểm đánh giá ER, PR theo Alldred

Hình 2.4 Đánh giá Her-2/neu theo tiêu chuẩn Dako

Hình 3.1 Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo tuổi

Hình 3.2 Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo vị trí u

Hình 3.3 Biểu đồ phân bố loại mô học theo độ tuổi

Hình 3.4 Một số loại UTBM tuyến vú

Hình 3.5 Phân độ mô học của UTBM tuyến vú thể ống xâm nhập

Hình 3.6 Kiêu hình phân nhóm ER/PR(+), Her-2/neu(+)

Hình 3.7 Kiểu hình phân nhóm ER/PR(+), Her-2/neu(-)

Hình 3.8 Kiểu hình phân nhóm ER/PR(-), Her-2/neu(+)

Hình 3.9 Kiểu hình phân nhóm ER/PR(-), Her-2/neu(-)

MỞ ĐẦU

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Ung thư vú (UTV) là một trong những ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ tại Việt Nam cũng như trên thế giới Ở Châu Âu, năm 2006 có khoảng 3,2 triệu người được chẩn đoán ung thư và 1,7 triệu người tử vong do ung thư Trong đó, ung thư

vú chiếm tỷ lệ cao nhất (13,5%) [71] Ở Việt Nam, tỷ lệ ung thư vú có xu hướng ngày một tăng dần: Theo Nguyễn Bá Đức, ở Hà nội năm 1998 có 20,3/100.000 phụ

nữ mắc bệnh, vào các năm 2001- 2004 tăng lên 29,7/100.000 Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo Nguyễn Chấn Hùng, tỷ lệ này lần lượt tăng từ 11,7/100.000 (1997); đến 19,4/100.000 (2003) Ung thư vú từ vị trí thứ hai sau ung thư cổ tử cung vào những năm cuối của thế kỷ trước, năm 2003 đến nay đã trở thành loại ung thư thường gặp nhất [15]

Ung thư vú ngày càng phổ biến và để lại những hậu quả nghiêm trọng nhưng phần lớn bệnh được phát hiện vào giai đoạn muộn Ung thư vú là loại ung thư nguyên phát, nếu được phát hiện sớm, cơ hội điều trị khỏi bệnh sẽ cao hơn Việc chẩn đoán ung thư vú có thể dựa vào các dấu hiện lâm sàng như hình thể, kích thước, bề mặt vú thay đổi, xuất hiện khối u, hạch nách…hoặc dựa và các kết quả cận lâm sàng như siêu âm, chụp X - quang nhũ ảnh, chụp cắt lớp vi tính (chụp CT),

kỹ thuật chụp xạ hình cắt lớp (PET – CT), kỹ thuật chọc hút bằng kim nhỏ (FNA) Một trong những tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán ung thư là sinh thiết tế bào và mô bệnh học

Ung thư vú không phải chỉ có một dạng đơn thuần mà có nhiều phân typ khác nhau về đặc điểm lâm sàng, giải phẫu và sinh học phân tử, gây khó khăn trong việc điều trị và tiên lượng [25] Do vậy, việc phát hiện sớm và chẩn đoán chính xác phân loại ung thư vú có ý nghĩa quan trọng trong việc định hướng điều trị và tiên lượng mức độ tiến triển của bệnh Một trong những phương pháp hỗ trợ cho việc chẩn đoán và phân typ ung thư chính là kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch được biết đến năm 1941 và đến nay nó được sử dụng như một công cụ hữu hiệu trong công nghệ y sinh và đặc biệt trong chẩn đoán ung thư

Kỹ thuật này cho phép quan sát được sự hiện diện của kháng nguyên trên lát cắt mô giúp các nhà bệnh học có thể quan sát và đánh giá được cả hai phương diện hình thái học và phenotype miễn dịch trên mô hay tế bào.Theo đó, phân loại chính xác nguồn gốc tế bào ung thư [45]

Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An là một trong những bênh viện trên địa bàn tỉnh Nghệ An chuyên sâu trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh các bệnh ung thư với

nhiều phương pháp, kỹ thuật hiện đại Trong đó, kỹ thuật hóa mô miễn dịch mới được đưa vào triển khai và ứng dụng Để góp phần vào việc cung cấp, bổ sung thêm dẫn liệu xác đáng cho lĩnh vực này và giúp cho việc tiên lượng và điều trị bệnh

thuận lợi, chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Ứng dụng hóa mô miễn dịch

trong nghiên cứu ung thư vú tại bệnh viện Ung bướu Nghệ An”

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đánh giá sự biểu hiện của các marker phân tử thông qua hóa mô miễn dịch để

hỗ trợ việc chẩn đoán, phân loại ung thư biểu mô tuyến vú, nhằm tiên lượng và định hướng điều trị cho những bệnh nhân ung thư vú

III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Nghiên cứu các đặc điểm chung về ung thư vú

- Tuổi mắc bệnh, giới, vị trí u, kích thước u, tình trạng di căn hạch nách

- Xác đinh loại mô bệnh học và độ mô học của ung thư biểu mô tuyến vú xâm nhập

2 Nghiên cứu hóa mô miễn dịch

- Quy trình kĩ thuật hóa mô miễn dịch tại bệnh viện Ung bướu Nghệ An

- Đánh giá sự biểu hiện của 3 marker chính: ER (Estrogene receptor), PR (Progesterone receptor), Her-2/neu (Human epidermal growth factor receptor 2)

- Đánh giá mối tương quan giữa sự biểu hiện của các marker với nhau và với các yếu tố lâm sàng

- Phân nhóm phân tử ung thư vú dựa vào sự biểu hiện của các marker và định hướng điều trị

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ung thư vú trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Trên thế giới

Ung thư vú là căn bệnh phức tạp, để lại những hậu quả nghiệm trọng đối với bệnh nhân Trong nhiều thập kỷ qua, việc nghiên cứu về các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và đặc biệt về sinh học phân tử UTV vẫn đang là những thách thức lớn đối với các nhà nhà giải phẫu học Năm 1925, trên cơ sở nghiên cứu về bệnh học vi thể, Greenhough lần đầu tiên phân tích mức độ biệt hóa tế bào UTV thành 3 mức độ

ác tính và chỉ ra được mối liên quan rõ rệt giữa mức độ ác tính với kết quả lâm sàng [24] Trên cơ sở đó, nhiều hệ thống phân độ mô học ra đời Năm 1957, Bloom and Richardson đã phân độ mô học trên 1409 đối tượng bệnh nhân mắc UTV và 359 bệnh nhân được theo dõi đánh giá tiên lượng trong 15 năm [31] Hệ thống này vẫn được áp dụng trong các nghiên cứu ung thư vú sau này Đồng thời, dựa vào hình thái tổng thể của các tế bào biểu mô bao gồm bào tương, chất nhân, khả năng bắt màu của nhân và bào tương, tỷ lệ nhân/ tế bào chất và sự sắp xếp của chúng trên tổ chức mô tuyến vú, nhiều hệ thống phân loại ung thư biểu mô tuyến vú ra đời, như phân loại của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 1968), Azzopardi và cs (1979), WHO(1981; 2003) Nhiều tác giả đã nghiên cứu phân loại mô học và độ mô học của ung thư biểu mô tuyến vú với mục đích để có một chẩn đoán chính xác về hình thái học của khối u, cung cấp những yếu tố tiên lượng quan trọng nhằm mục đích điều trị [24], [71]

Việc chẩn đoán và tiên lượng các bệnh nhân ung thư vú dựa trên các tiêu chuẩn hình thái học trên nhưng chưa đủ để cho phép đánh giá tiên lượng chính xác cho từng bệnh nhân Sự ra đời của hóa mô miễn dịch và áp dụng trong lĩnh vực y sinh giúp xác định các dấu chứng sinh học có giá trị trong tiên lượng và điều trị UTV như estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) cũng đã thu thút được nhiều nhà khoa học quan tâm Các nghiên cứu thường tập trung vào việc đánh giá vai trò các các protein thụ thể nội tiết này đối với UTV, đồng thời đánh giá mối liên quan của các thụ thể này với các yếu tố tiên lượng kinh điển khác và hướng dẫn cho điều trị nội tiết (Mason và cs (1983), William và cs (1986), Castagnetta và cs (1992), Aldred và cs (1998)…)

Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì Her-2/neu trong ung thư vú cũng được quan tâm nghiên cứu kỹ về cơ chế hoạt động, ý nghĩa tiên lượng và mối liên quan

với các thụ thể estrogen và progesterone Nghiên cứu của Slamon và cs năm 1987 cho thấy tương quan giữa sự khuếch đại gen Her2 và thời gian tái phát bệnh, những bệnh nhân có sự biểu hiện của gen Her2 sẽ có thời gian sống ngắn hơn các loại UTV khác Trong nghiên cứu của Seshadri và cs (năm 1993), biểu hiện quá mức của Her-2/neu liên quan tới trình trạng ER, PR âm tính; kích thích tố estrogen và progesterone có thể ngăn chặn sự biểu hiện của Her2, do đó các khối u có thụ thể nội tiết dương tính ít có khả năng biểu hiện của Her2 dương tính và giải thích vì sao khối u Her2 dương tính không đáp ứng với điều trị hormone [63], [45] Trong nghiên cứu của Konecny G.E và cs (năm 2004) cho thấy một điều khá thú vị về sự biểu hiện quá mức Her2 có sự tương quan đáng kể với sự biểu hiện của các dấu ấn sinh học khác trong UTV như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF)… Năm 2000,Perou và cs đã thực hiện nghiên cứu biểu hiện gen42 bệnh nhân UTV với 8102 gen đã được khảo sát bằng kỹ thuật DNA microarray trong ung thư

vú Kết quả đã được công bố trên tạp chí Nature cho thấy có thể phân loại UTV

thành các nhóm phân tử khác nhau dựa vào sự khác biệt về biểu hiện gen Từ nghiên cứu ban đầu của Perou, nhiều nghiên cứu đã khảo sát sự biểu hiện gen trên microarray và tìm thấy được sự tương ứng giữa biểu hiện gen và biểu hiện của các dấu chứng sinh học qua phương pháp HMMD Trên cơ sở đó, nhiều công trình đưa

ra phân loại phân tử UTVvà đánh giá các phân nhóm này với tuổi, giai đoạn bệnh,

độ mô học, phương pháp điều trị và đánh giá tỷ lệ rủi ro cũng như thời gian sống của bệnh nhân sau điều trị (Carey LA, Onitilo AA (năm 2009), Fiona M và cs (năm 2010)) [25], [43], [57]

1.1.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư vú có xu hướng tăng dần Việc ứng dụng những thành tựu của công nghệ y sinh, tiếp thu và kế thừa kết quả trên thế giới vào việc nghiên cứu ung thư vú đã đem lại những lợi ích điều trị cho những bệnh nhân mắc UTV Các đề tài đi sâu vào nghiên cứu thực trạng mắc ung thư vú, các yếu tố nguy cơ, các đặc điểm lâm sàng, mô học như: “Nghiên cứu mô học, hóa

mô miễn dịch và siêu cấu trúc ung thư biểu mô vú” của Nguyễn Đăng Đức (1998);

“Nghiên cứu chuẩn đoán và điều trị ung thư vú giai đoạn I-III ở phụ nữ tại bệnh viện Đa khoa Cần Thơ”của Nguyễn Sào Trung (năm 2007)…

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch đã và đang được triển khai ở một số cơ sở y tế lớn trên cả nước như bệnh viện K Hà Nội, bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Ung bướu Thành phố Hồ Chí Minh, bệnh viện Việt Đức thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học trong nước trong lĩnh vực ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng Tuy số lượng các công trình nghiên cứu không nhiều nhưng đã tập trung nghiên cứu

làm nổi bật được vai trò của HMMD trong ung thư vú: Đánh giá được sự bộc lộ của các marker phân tử ER, PR, Her-2/neu và mối tương quan của chúng nhau và với các yếu tố tiên lượng: tuổi, độ mô học, tình trạng di căn (Nguyễn Sào Trung và cs (2004), Lê Đình Roanh và cs (2004), Đặng Công Thuận (2007, 2011) Một số nghiên cứu tập trung vào sự biểu hiện của gen Her-2/neu thông qua kỹ thuật HMMD và lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH), bước đầu phân loại phân tử ung thư

vú (Hứa Thị Ngọc Hà và cs (2004) và Đoàn Thị Phương Thảo (2011)

Ở Việt Nam, vẫn còn nhiều hạn chế về cơ sở vật chất và số lượng mẫu nên những nghiên cứu về phân loại phân tử và các đánh giá tương quan giữa UTV với hiệu quả điều trị, tỷ lệ sống sót rất ít Hiện nay, kỹ thuật HMMD mới được triển khai tại bệnh viện Ung bướu Nghệ An nên số lượng bệnh nhân được chẩn đoán HMMD còn hạn chế Mặt khác, thời gian để theo dõi bệnh nhân tới điều trị ở bệnh viện còn ngắn, nên đề tài này chỉ dừng lại ở việc đánh giá mối tương quan giữa tình trạng thụ thể nội tiết, mức độ khuếch đại thụ thể Her2 và bước đầu phân nhóm bệnh nhân phù hợp với các phương pháp điều trị để bệnh nhân được hưởng lợi ích từ điều trị nội tiết tố hay thuốc điều trị trúng đích

1.2 Sơ lược về giải phẫu, mô học và sinh lý tuyến vú

Giải phẫu tuyến vú: Tuyến vú là tuyến chế tiết đơn bào gồm 15 – 20 tiểu thuỳ

không đều nhau, đan xen nhau và đều tập trung về núm vú Về cấu tạo, vú chủ yếu

do mô mỡ và mô tuyến vú tạo thành Mô tuyến vú kẹp vào giữa các lớp mỡ Phía sau mô mỡ và mô tuyến vú là cơ ngực Vú có các mô liên kết, mạch máu, sợi thần kinh và bạch huyết Da vùng vú mỏng, bao gồm các nang lông, tuyến bã và các tuyến mồ hôi Quầng vú có hình tròn, màu sẫm, đường kính từ 1,5 - 6,0 cm Quầng

vú co lại và nhô ra khi trời lạnh, khi kích thích cho con bú [3], [27]

Hình 1.1 Cấu tạo vú khỏe mạnh ở người trưởng thành

(Nguồn:http://www.studyblue.com/notes/note/n/breastanatomy/deck/7004653)

Khi bắt đầu có kinh nguyệt, các ống dẫn tự dài ra và phân nhánh, phần mô đệm tăng sản mạnh, đặc biệt ở các nhánh tận tạo ra các chùm, các túi của tiểu thùy

vú Do vậy, tuyến vú phát triển mạnh về kích thước Trong thời kỳ kinh nguyệt có

sự co rút của các ống dẫn, kèm với hiện tượng teo đét và tróc các tế bào biểu mô Sau kinh nguyệt, hiện tượng tăng sản trở nên rõ ràng, có sự phát triển mạnh của các ống dẫn và tăng số lượng tế bào biểu mô, còn mô đệm quanh ống dẫn bị phù với một ít tế bào nhuộm màu nhạt Sự tăng quá mức của các tế bào hình trụ trước khi có kinh được kết thúc bằng hoạt động “chế tiết non” Trong lúc biểu mô tăng sản thì

mô đệm quanh ống dẫn mềm hơn và giảm thiểu thể tích đáng kể, nhất là khi có chế tiết Ngược lại, khi biểu mô thoái triển thì mô liên kết tăng sản và thay thế vùng mà ống dẫn và các tiểu thùy chiếm lúc trước [3]

Trong ba tháng đầu của thai kỳ có sự tăng sản tế bào biểu mô, ống dẫn và tiểu thùy Mô đệm quanh ống dẫn mềm và ít bắt màu hơn Khi thai tới đúng kỳ, các tế bào biểu mô chuyển thành các tế bào mỡ Các tế bào mỡ rơi vào ống sữa cho ra sự chế tiết sữa đầu tiên Khi cho con bú, các tế bào cũng thay đổi do sự thay đổi của các tiểu thùy, dưới ảnh hưởng của hormon progesterone (nội tiết tố hoàng thể), hormon prolactin (nội tiết tố sinh sữa) của tuyến yên Khi cai sữa, các tiểu thùy và ống dẫn thoái triển, teo đét lại trong lúc mô đệm liên kết cũng không phát triển làm cho tuyến vú xẹp và mềm

Các nang tuyến phát triển gần hoàn chỉnh trong thời gian thai kì và bắt đầu tiết sữa khi gần kết thúc thai kì Vào thời kỳ mãn kinh, các tế bào chết tiết của tiểu thùy

và các tế bào biểu mô ống dẫn teo đét dần từ ngoại biên đến núm vú Mô đệm cũng mất bớt tế bào và trở nên dày

Hình 1.2 Cấu trúc vi thể mô vú bình thường

(Nguồn: Junqueira’s Basic Histology: Text and Atlas, 12 th Edition

Http:// www.accessmedicine.com) Hình 1.2 (a): Các nang tuyến phát triển thành các cấu trúc hình cầu bao gồm các tế bào biểu mô khối, bao quanh là các tế bào mô cơ có khả năng co giãn (M) Tỉ

lệ này khác nhau ở toàn bộ vú Vào cuối thai kì các tế bào mỡ (L) rời các đường vân, tích tụ trong mô liên kết nội ống và biệt hóa thành các tế bào plasma (P) tiết ra IgA và chuyển tới tạo sữa có tác dụng miễn dịch từ mẹ sang con Một lượng sữa bắt đầu được tích tụ tại các ống

Hình 1.2(b): Các tế bào tiết từ các tuyến tiết sữa có dạng hình trụ và chứa các hạt lipit có kích thước khác nhau và cũng có thể thấy trong sữa Mô liên kết xuất hiện các cấu trúc có cấu tạo tế bào Các mạch máu và các tế bào lympho vẫn còn có mặt Các tế bào tiết nằm ở vùng xung quanh [27]

Sinh lý của tuyến vú: Những thay đổi mô học của vú bình thường liên quan

đến những biến đổi của nội tiết trong chu kỳ kinh nguyệt Những thay đổi này xảy

ra ở cả mô đệm và phần biểu mô.Trong pha nang, thời điểm giữa chu kì, estrogen được tổng hợp và tiết ra nhiều nhất còn giữa pha hoàng thể, hàm lượng progesterone đạt cực đại; các ống tuyến giãn ra, các tế bào biểu mô nang sẽ biệt hoá thành các tế bào tiết

Những thay đổi biểu mô vú do các hormone là nhờ các thụ thể steroid trong tế bào hoặc các thụ thể peptid gắn với màng tế bào Các hormon sinh dục gắn vào các thụ thể đặc hiệu, sẽ có sự thay đổi phân tử, dẫn đến những thay đổi về hình thái cũng như về sinh lý của tuyến vú Trước khi có kinh, thể tích vú trung bình tăng 15-

30 cm3 do nồng độ estrogen nội sinh tăng có tác dụng giống histamin trên vi tuần hoàn vú; tăng phù khoảng giữa các thuỳ và tăng sinh các ống- nang dưới tác dụng của estrogen và progesterone Khi có kinh, có sự giảm đột ngột nồng độ hormone sinh dục lưu hành và hoạt động của biểu mô cũng giảm xuống Sau khi hết kinh, phù nhu mô giảm xuống, sự xẹp biểu mô ngừng lại và bắt đầu một chu kỳ mới với

sự tăng nồng độ estrogen [27]

Những thay đổi tốc độ phát triển mô vú có tính chất chu kỳ liên quan đến sự thay đổi hormon trong pha nang trứng và pha hoàng thể của chu kỳ kinh nguyệt Những thay đổi này có thể đo và quan sát được dựa vào các thông số của tế bào và nhân: mô học, hình thái tế bào (vùng nhân, chu vi, hạt nhiễm sắc, mức độ bắt màu), hình thái nhân, phân bào, bắt giữ Tritiated thymidine, các marker của sự tăng sinh: Ki-67, PCNA, MIB-I [27]

1.3 Dịch tế học, các yếu tố nguy cơ ung thư vú

1.3.1 Khái niệm về ung thư

Ung thư là sự tăng sản tế bào vô hạn độ và có thể xâm lấn vào các tổ chức xung quanh và di căn đi nơi khác [3], [5]

Ung thư vú là sự tăng sản bất thường của các tế bào biểu mô các nang, ống dẫn sữa, gây phá vỡ cấu trúc mô tuyến vú, xâm lấn mạch máu, mạch bạch huyết từ

đó di căn xa và phát triển tới các hạch, các tổ chức khác trong cơ thể, tiếp tục phá hủy, gây chảy máu và hoại tử và cuối cùng là mang đến sự chết [27]

Hình 1.3 Ung thư biểu mô ống tuyến vú

lệ mắc cao nhất ở các nước châu Âu Châu Phi và châu Á có tỷ lệ mắc thấp nhất [42] Trong những thập kỷ qua, tỷ lệ UTV ngày càng có xu hướng gia tăng Theo thống kê của hiệp hội Ung thư Mỹ, ở người Mỹ năm 1975 tỷ lệ UTV 80/100000, đến năm 1985 tỷ lệ UTV 105/100000, trong năm 1998 tỷ lệ UTV 178/100000 Tại vùng Vaud, Thụy Sĩ, tỷ lệ UTV ở phụ nữ đã tăng từ 2,1/100000 (năm 1977-1979) lên 9,4/100000 (năm 1992-1994) Nghiên cứu của Goelen và cs cho thấy ở Australia tỷ lệ mắc UTV là 37/100000 người, tỷ lệ này tăng theo tuổi (ở nhóm 50-

69 là 78/100000) [3], [42]

Theo báo cáo của Khoo US và cs những năm gần đây, tỷ lệ mắc UTV ở một

số nước châu Á có xu hướng tăng nhanh, đặc biệt ở Nhật Bản, Hồng Kông và Singapore, nơi có lối sống phương Tây hóa Điều này gợi ý tới yếu tố môi trường,

lối sống và đặc biệt là chế độ ăn đóng một vai trò quan trong trong sự phát triển UTV Tỷ lệ mắc UTV ở phụ nữ Hồng Kông hiện là 2,6/1000 phụ nữ trên 40 tuổi và

ở Singapore là 4,8/1000 phụ nữ ở độ tuổi 50-64 tuổi [3]

1.3.2.2 Việt Nam

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi tại Hà Nội là 20,3/100000 người, đứng đầu trong số các loại UTV ở nữ Tỷ lệ này tại TP.Hồ Chí Minh là 17,1/100000 người, đúng hàng thứ hai sau ung thư cổ tử cung Tuổi mắc UTV trung bình ở phụ

nữ Việt Nam tập trung chủ yếu ở độ tuổi 50-59, hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30 Tỷ lệ mắc UTV dao động ít ở độ tuổi ngay trước và sau mãn kinh

Bảng 1.1 Tỷ lệ nữ mắc UTV ở Hà Nội giai đoạn 1996 – 1999

cổ tử cung vào những năm cuối của thế kỷ trước đã trở thành loại ung thư thường gặp nhất từ năm 2003 cho đến nay (Nguyễn Chấn Hùng, 2006)[15]

Trong nhiều năm qua đã có nhiều nghiên cứu về nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh và hiệu quả điều trị UTV Trong đó việc phát hiện sớm UTV bằng nhiều phương pháp (chụp tia X vú, siêu âm, xét nghiệm công thức máu…), đặc biệt xét nghiệm mô bệnh học được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán ung thư nói chung và UTV nói riêng Ngày nay hóa mô miễn dịch đã đóng vai trò hỗ trợ quan trọng cho mô bệnh học trong việc phân loại, xác định nguồn gốc, tiên lượng kết quả

nhằm góp phần định hướng điều trị và làm giảm tỷ lệ tử vong

1.3.3 Các yếu tố nguy cơ

Những yếu tố có khả năng gây ra biến đổi ở người phụ nữ dẫn đến sự phát triển thành các khối ung thư được gọi chung là các yếu tố nguy cơ

1.3.3.1 Yếu tố cơ địa

Có sự khác biệt về tỷ lệ mắc và tử vong do UTV giữa các nước Nguy cơ mắc bệnh cao đối với phụ nữ ở Bắc Mỹ; Bắc Âu cao hơn ở châu Á và châu Phi Tỷ lệ

mắc và tỷ lệ tử vong ở Mỹ cao hơn ở Nhật Bản gấp năm lần Sự khác biệt này có thể do môi trường hơn là sự di truyền qua các thế hệ hay người di cư từ khu vực có

tỷ lệ mắc thấp đến khu vực có tỷ lệ mắc cao Chế độ ăn uống, kiểu sinh sản và thói quen

chăm sóc cũng được xem là các yếu tố có liên quan tới cơ chế sinh bệnh UTV [54]

1.3.3.2 Tiền sử sinh sản

Tuổi có kinh, tuổi mãn kinh và tiền sử mang thai là những yếu tố liên quan chặt chẽ với UTV UTV không phổ biến ở phụ nữ trước 30 tuổi, có nguy cơ tăng

cao ở độ tuổi trước và sau thời kì mãn kinh [3], [53]

1.3.3.3 Yếu tố di truyền và tiền sử gia đình

Khoảng 5% đến 10 % UTV có liên quan đến đột biến các gen di truyền Cụ thể, phụ nữ có khả năng mang một gen nhạy cảm với bệnh ung thư vú cao sẽ tiến triển thành ung thư vú trước thời kì mãn kinh Khoảng một nửa số phụ nữ bị UTV

di truyền bởi sự đột biến của gen BRCA1 (nằm trên nhiễm sắc thể 17q21) và một phần ba do đột biến gen BRCA2 (trên nhiễm sắc thể l3q12 -13) Đây là các gen lớn, phức tạp, không tương đồng với nhau và với các gen khác Chúng hoạt động như các gen ức chế khối u UTV phát sinh khi cả hai alen không hoạt động hoặc một trong hai bị lỗi do đột biến giao tử và sau đó là đột biến soma u [3], [53]

Nguy cơ bị UTV tăng từ 1,5 – 3 lần nếu người phụ nữ có mẹ hoặc em gái mắc bệnh này Đặc biệt khi phụ nữ có mẹ và các chị em gái bị UTV ở tuổi tiền mãn kinh, thì nguy cơ mắc UTV của họ gần như tuyệt đối Như vậy yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong nguy cơ mắc UTV

1.3.3.4 Ảnh hưởng của Hormone

Hàm lượng estrogen nội sinh quá mức, chính xác hơn là sự mất cân bằng nồng

độ hormone có ý nghĩa quan trọng Estrogen kích thích các nhân tố tăng trưởng của các tế bào biểu mô vú bình thường và các tế bào ung thư chế tiết Các nhân tố progesterone và estrogen thường hiện diện ở các tế bào biểu mô và ở các tế bào u, tương tác với yếu tố hoạt hóa tăng trưởng như nhân tố chuyển hóa tăng trưởng α, nhân tố tăng trưởng tiểu cầu, nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi…dẫn tới sự phát sinh khối u [49], [68]

1.3.3.5 Các yếu tố môi trường

Các yếu tố môi trường bao gồm thực phẩm, thuốc reserpin, cafein, rượu, thuốc xịt tóc…đặc biệt sự chiếu xạ và estrogen ngoại sinh Ảnh hưởng của yếu tố môi trường tới tỷ lệ mắc UTV khác nhau tùy thuộc vào nhóm hormone di truyền và sự khác biệt về điều kiện địa lý khác [54]

1.3.3.6 Sự bức xạ ion hóa

Sự bức xạ ion hóa làm tăng nguy cơ mắc UTV Điều này phụ thuộc vào lượng bức xạ, thời gian chiếu bức xạ và độ tuổi Chỉ những phụ nữ ở độ tuổi dưới 30 tuổi hoặc trong thời kì phát triển vú có nguy cơ bị ảnh hưởng cao [61]

1.3.3.7 Sử dụng thuốc tránh thai và điều trị các hormone thay thế

Nếu dùng thuốc tránh thai trên tám năm, nguy cơ mắc UTV tăng 1,7 lần, còn nếu dùng trên mười năm thì nguy cơ tăng 4,1 lần Dùng hormone thay thế ở phụ nữ mãn kinh là an toàn khi dùng trong thời gian ngắn Nhưng dùng với liều trung bình trong thời gian từ 10 – 20 năm nguy cơ mắc UTV tăng từ 1,5 – 2,0 lần [61]

1.4 Đặc điểm sinh học phân tử của ung thư vú

Có rất nhiều yếu tố tác động vào sự phát sinh và tiến triển của UTV bao gồm

sự kết hợp của yếu tố nội tiết, yếu tố phát triển, và đặc biệt sự biểu hiện của một số gen Các gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển ung thư bao gồm sự phân chia tế bào, biệt hóa, tạo mạch máu xâm lấn và chết tế bào Quá trình này liên quan chặt chẽ tới tổn thương của hai nhóm gen: gen sinh ung thư (Oncogen) và gen

áp chế ung thư (tumor suppressor gene) Cả hai gen này luôn tồn tại trong tế bào bình thường và đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản của tế bào, sự biệt hóa tế bào, quá trình chết theo chương trình của tế bào (appotosis) Đồng thời cả hai nhóm gen này liên kết chặt chẽ trong quá trình sinh ung thư giúp cho sự ổn định sinh học cơ thể [60]

1.4.1 Protooncogen

Protooncogen là các gen mà bình thường có vai trò kiểm soát sự sinh sản và sự biệt hóa của các tế bào Sản phẩm của chúng điều hòa sự sinh trưởng và phân chia bình thường của các tế bào Khi protooncogen bị đột biến thành các oncogen (gen sinh ung thư), gây mất kiểm soát sự sinh sản của tế bào dẫn đến ung thư [3], [60] Gen sinh ung thư của vú thuộc nhóm các thụ thể yếu tố tăng trưởng Bất kì đột biến hoạt hóa nào xảy ra trong gen đều có thể làm gia tăng dẫn truyền tín hiệu làm cho tế bào đi vào chu kì không hợp lý, liên quan tới sự sinh ung thư qua gia tăng biểu hiện cyclin trong tế bào u Còn các gen kháng ung thư như BRCA 1, BRCA 2, p53…mã hóa cho những protein kiểm soát phân bào theo hướng ức chế, làm chu kì phân bào bị dừng đột ngột ở một pha nào đó, thường là pha G1 Các gen kháng ung thư này còn có chức năng làm biệt hóa tế bào, hoặc mã hóa tế bào chết theo chương trình Khi các gen kháng ung thư bị bất hoạt do đột biến sẽ làm biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính [60]

Việc phát hiện ra các yếu tố sinh học ung thư và tìm hiểu ra cơ chế dẫn truyền tín hiệu tế bào, từ đó chỉ ra các điểm đích và làm cơ sở sinh học cho phương pháp điều trị mới là liệu pháp nhắm trúng đích (targeted therapy)

1.4.2 Các yếu tố thụ thể nội tiết progesterone và estrogen

Thụ thể estrogen (Estrogen receptor – ER) và progesterone (Progesterone receptor – PR) thuộc họ thụ thể nội tiết steroid, giữ vai trò quan trọng trong sự tiến triển và tiên lượng UTV

Estrogen: Sự phát triển của mô tuyến vú chịu ảnh hưởng bởi nhiều hormone

và các nhân tố tăng trưởng, nhưng ER rất cần thiết, thúc đẩy sự phát triển của mô tuyến vú bình thường và mô tuyến vú ung thư:

- Điều chỉnh sự biểu hiện hay điều hòa hoạt động của protein điều hòa pha G1

- Giữ vai trò như là yếu tố sống sót ở những tế bào có ER+

- Giữ vai trò như là yếu tố điều hòa sự biệt hóa

Có 3 thời điểm thay đổi nồng độ chế tiết estrogen trong đời sống phụ nữ gắn liền với nguy cơ UTV là tuổi có kinh, tuổi sinh con đầu lòng đủ tháng và tuổi mãn kinh Khoảng 2/3 trường hợp ung thư vú có ER(+), nhưng u này có khuynh hướng phát triển chậm, biệt hóa tốt hơn và sau điều trị, thời gian sống không còn bệnh ung thư dài hơn [58].Khoảng 50%-70% bệnh nhân bị tái phát có tiền sử ER(+), được điều trị nội tiết tố so với chỉ 5% bệnh nhân có khối u âm tính với ER cho thấy mối tương quan mạnh mẽ giữa sự tăng trưởng của khối u vú với sự hiện diện của ER Tuy nhiên thời gian đáp ứng còn hạn chế do sự tiến triển của ER không phụ thuộc vào tình trạng khối u Bệnh nhân có ER(+) có diễn biến lâm sàng, tiên lượng tốt hơn

và thời gian sống không còn bệnh dài hơn bệnh nhân có ER(-) Vì vậy, việc xác định lượng ER có trong mô UTV rất cần thiết trong việc lựa chọn chế độ điều trị khi có

di căn hoặc dự đoán tiên lượng [58]

Progesterone: Trong mô tuyến vú bình thường, khoảng 15-30% tế bào biểu

mô vú có sự biểu hiện PR Các nghiên cứu cho rằng progesterone gián tiếp kiểm soát số lượng và hoạt động của tế bào vú bình thường thông qua tín hiệu cận tiết từ các chất truyền tin được chế tiết bởi các tế bào biểu mô tuyến vú lân cận có PR(+) Trong ung thư giai đoạn tiền ác tính và tiền xâm lấn, sự biểu hiện của PR tăng lên không điển hình [70] Khoảng 60% UTV xâm lấn có PR(+) Sự hiện diện hay vắng mặt của các thụ thể progesterone có ý nghĩa trong việc tiên đoán đáp ứng điều trị nội tiết đồng thời phản ánh vai trò quan trọng của ER trong hoạt động sao mã của PR Khoảng 50% trường hợp ung thư vú có đồng thời cả ER(+), và PR(+) Nếu cả hai dương tính thì tỷ lệ đáp ứng điều trị nội tiết là 75% Ngược lại, ER(+) và PR(-), tỷ lệ

đáp ứng khoảng 27% Trong trường hợp ER(-), nhưng PR(+), tỷ lệ điều trị đáp ứng nội tiết là 46% Hầu hết những trường hợp ER(-), PR(-) không đáp ứng với điều trị nội tiết [26]

1.4.3 Gene sinh ung thư Her2/neu (ERB_B2)

Cho đến nay, có 4 gen Her đã được phát hiện, mỗi gen nằm trên 1 nhiễm sắc thể khác nhau Gen Her2 là tiền gen sinh ung thư, mang tính trội, nằm trên nhánh dài của NST số 17, tại vị trí số 21, kí hiệu 17q21 Gen Her2 là gen mang nhiệm vụ chính điều hòa sự phát triển của tế bào biểu mô Sản phẩm của gen Her là thụ thể, là một loại glycoprotein màng tế bào có 1255 amino acid, trọng lượng phân tử là 185kd, kí hiệu 185Her [38], [52], [62] Trong cả tế bào thường và tế bào ung thư, các thụ thể này chịu trách nhiệm chuyển tín hiệu từ bên ngoài tế bào thành các tín hiệu bên trong tế bào tác động đến sự tăng trưởng, phát triển và sống còn của các tế bào Khi con đường truyền tín hiệu Her được kích hoạt không phù hợp gây ra sự tăng

trưởng và lây lan của tế bào ung thư Hiện nay thụ thể này được quan tâm nhiều

trong bệnh ung thư vú vì có liên quan đến sinh bệnh học, cũng như tiến triển, tiên lượng và đáp ứng điều trị của bệnh Tế bào tuyến vú bình thường có hai gen Her2 và khoảng 50000 thụ thể Her2 trên màng tế bào Khi có khuếch đại gen Her2, số lượng thụ thể Her2 ở màng tế bào có thể tăng đến hơn một triệu [38], [52] Sự khuếch đại gen Her2 trong nhân dẫn đến sự tăng sao mã mRNA, tăng tổng hợp thụ thể Her2 ở màng tế bào, tăng kích hoạt dòng thác phân bào Họ thụ thể Her2 gồm bốn thành viên Her1, Her2, Her3, Her4 Tất cả các thụ thể này đều định vị trên mạng tế bào và

có cấu trúc tương tự nhau, đoạn ngoại bào giàu cystein giữ vai trò gắn kết phối tử các chất truyền tin, đoạn xuyên màng có tính kỵ nước và đoạn nội bào mang hoạt tính enzyme tyrosine kinase Đoạn nội bào của Her3 có hoạt tính của enzyme tyrosine kinase rất yếu Sự hoạt hóa các thụ thể là một quá trình phức tạp, thông qua kích hoạt enzyme tyrosine kinase sẽ tạo ra sự dẫn truyền tín hiệu vào nhân, hoạt hóa các gen và khởi động tiến trình phân bào [60]

Các thụ thể Her tồn tại ở dạng đơn phân tử, ở trạng thái “đóng” trên màng tế bào Để chuyển các tín hiệu ngoại bào thành tín hiệu nội bào, trước hết, từng thành viên trong họ thụ thể Her được gắn với phối tử chất truyền tin để chuyển từ trạng thái “đóng” sáng “mở” Riêng thụ thể Her2 luôn trong cấu trúc “mở” Sự hoạt hóa thụ thể Her phụ thuộc vào sự hiện diện của các chất truyền tin đặc hiệu và chính các thụ thể trong họ Her [73] Sau khi gắn kết với chất truyền tin, bốn thụ thể Her khác nhau có thể bắt cặp với nhau thành từng cặp đồng loại Her1- Her1, Her2- Her2 hoặc dị loại Her- Her2, Her2- Her3 nhưng cặp không có chứa Her2 rất hiếm hoặc không bao giờ tồn tại như Her3- Her4 Sự bắt cặp của 4 thụ thể Her tạo ra khoảng

10 cặp thụ thể Her khác nhau Cặp thụ thể dị loại bền vững hơn cặp thụ thể đồng loại Việc bắt cặp với nhau của các thành viên trong họ là rất cần thiết cho sự hoạt hóa chuỗi tín hiệu về phía nhân tế bào Trong nghiên cứu về con đường truyền tin của ung thư vú, đóng vai trò quan trọng là cặp dị loại Her2- Her3 được xem là cặp tín hiệu đặc biệt mạnh trong các trường hợp UTV có Her2 dương tính ở giai đoạn đầu [60]

Khi thụ thể Her2 biểu hiện quá mức trong tế bào ung thư, sẽ làm gia tăng sự hình thành các cặp thụ thể dị loại có Her2, kéo theo tăng khả năng gắn kết giữa chất truyền tin và thụ thế gây kích hoạt phân bào, đồng thời làm tăng tần suất truyền tin nội bào sẽ gây tăng dòng thác phân bào Phối hợp hai đặc điểm trên là một trong những cơ chế quan trọng của hiện tượng sinh ung thư

Hình 1.4 Cấu trúc không gian thụ thể Her2 và sự kết cặp của các

thành viên thuộc họ thụ thể Her2

(Nguồn http://www.biooncology.com/)

Cơ chế bắt cặp của các thụ thể rất quan trọng vì các cặp thụ thể khác nhau sẽ

hỗ trợ hệ thống truyền tin tạo ra các thông tin sinh học đa dạng, khác nhau Trong

đó, mặc dù thụ thể Her2 không có chất truyền tin đặc hiệu nhưng lại giữ vai trò quan trọng trong cả hệ thống truyền tin Her2 Con đường truyền tín hiệu chính bao gồm: con đường Ras/activated protein kinase, PI3K/Akt, con đường chuyển đổi tín hiệu

và kích hoạt sao chép, tất cả con đường đều tác động lên sự phát triển, sự sống còn,

sự di chuyển và sự bám dính tế bào ung thư [60], [73 ]

Hình 1.5 Yếu tố tăng trưởng thượng bì (EGFR) và thụ thể Her2 trên tế bào

(Nguồnhttp://www.biooncology.com/)

Cơ sở miễn dịch trị liệu ung thư vú: Do đặc điểm của các cặp thụ thể dị loại

có Her2 và cấu tạo của chất truyền tin nên phức hợp thụ thể Her chất truyền tin tồn tại lâu hơn, kích thích phân bào bất thường Trong khi các cặp thụ thể khác chỉ dẫn truyền tín hiệu kích thích phân bào bình thường nên không hình thành u nên Her2 là mục tiêu nhắm đến trong điều trị UTV Các đích nhắm đến có thể là miền ngoại bào của Her2; các thụ thể bắt cặp có chứa Her2 đặc biệt là cặp dị loại Her2- Her3; hoặc nhắm tới miền nội bào và đường truyền tín hiệu vào phía phân tử AND [34]

Kháng thể đơn dòng Her2 có tác dụng ức chế chức năng của các thụ thể Her2 Phức hợp kháng thể kháng Her2 và thụ thể Her2 ở màng tế bào được chuyển nhanh vào bào tương của tế bào ung thư và bị phân hủy sau đó Kháng thể đặc hiệu kháng Her2 gây gia tăng hoạt động nhập bào để chuyển thụ thể Her2 ra khỏi màng tế bào, phá hủy phân tử thụ thể Her2 trong tiểu thể của chính các tế bào ung thư Một khi bị tách khỏi màng tế bào, thụ thể Her2 không còn tương tác với các thụ thể khác trong

họ Her, cặp thụ thể dị loại có mang Her2 không còn nữa nên khả năng kích hoạt phân bào trong khối tế bào u còn rất yếu [34]

1.5 Phân loại ung thư biểu mô tuyến vú

Trong nhiều thập kỷ qua, đã có nhiều tác giả nghiên cứu phân loại mô học của ung thư biểu mô tuyến vú với mục đích có một chẩn đoán chính xác về hình thái học của khối u, cung cấp những yếu tố tiên lượng quan trọng nhằm mục đích điều trị như : Hệ thống phân loại UTBM tuyến vú của tổ chức y tế thế giới (WHO) 1968, Azzopardi và cs 1979, hệ thống phân loại của Rosen và Obermas, phân loại UTBM tuyến vú của WHO 2003 Tài liệu này chỉ trình bày phân loại TNM (Tumor- Nodes- Metastasis) ung thư biểu mô tuyến vú và hệ thống phân loại UTBM tuyến vú của WHO 2003

1.5.1 Phân loại TNM ung thư biểu mô tuyến vú

T (Tumor): u nguyên phát gồm:

Tx: Không thể xác định được

TO: Không có bằng chứng về u nguyên phát

Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ

Tis: (DCIS): Ung thư biểu mô ống tại chỗ

Tis (LCIS): Ưng thư biểu mô tiểu thuỳ tại chỗ

Tis (Paget): Bệnh Paget tuyến vú không có u

TI: U có kích thước 2cm hoặc nhỏ hơn

TI mic: Vi xâm nhập: u xâm nhập đường kính lớn nhất 0,1 cm hoặc nhỏ hơn Tla: U có đường kính lớn nhất lớn hơn 0,1 cm nhưng nhỏ hơn 0,5 cm

Tla: Ucó đường kính lớn nhất lớn hơn 0,5 cm nhưng nhỏ hon 1 cm

Tlc: Ucó đường kính lớn nhất lớn hơn 1 cm nhưng nhỏ hơn 2 cm

T2: U có kích thước lớn nhất trên 2 cm, nhưng không vượt quá 5 cm

T3: U có kích thước lớn nhất trên 5 cm

T4: U bất kỳ kích thước nào có lan trực tiếp vào thành ngực hoặc đã được

mô tả từ T4a đến T4d

T4a: Lan tràn tới thành ngực

T4b: Phù (bao gồm da cam) hoặc loét da vú hoặc các u da hình sao ở cùng một vú

T4c: Cả T4a và T4b

T4d: Ung thư biểu mô viêm

N (Nodes): Hạch bạch huyết vùng

Nx: Hạch bạch huyết vùng không đánh giá được (đã lấy bỏ trước đây)

NO: Không di căn hạch bạch huyết vùng

NI: Di căn hạch bạch huyết vùng cùng bên có thể di động được

N2: Di căn các hạch bạch huyết nách cùng bên cố định hoặc di căn hạch vú trong cùng bên rõ ràng trên lâm sàng khi không có bằng chứng di căn hạch nách rõ trên lâm sàng

N2a: Di căn hạch nách cố định với các hạch khác hoặc các cấu trúc khác N2b: Chỉ có di căn hạch vú trong rõ ràng trên lâm sàng và không có các di căn hạch nách rõ ràng trên lâm sàng

N3: Di căn tới hạch bạch huyết dưới xương đòn có hoặc hoặc không có xâm nhập hạch nách, hoặc di căn các hạch vú trong cùng bên rõ ràng trên lâm sàng khi

có các di căn hạch nách rõ ràng trên lâm sàng, hoặc di căn (các) hạch thượng đòn cùng bên có hoặc không có di căn hạch vú hoặc hạch nách

N3a: Di căn hạch dưới đòn

N3b: Di căn hạch vú trong và hạch nách

N3c: Di căn các hạch thượng đòn

M (Metastasis): Di căn xa:

Mx: Di căn xa không thể xác định được

MO: Không có di căn xa

Ml: Có di căn xa

Bảng 1.2 Phân loại ung thư vú theo giai đoạn TNM

Giai đoạn IIIA T1 N2 M0

1.5.2 Phân loại mô học các ung thư biểu mô vú theo WHO năm 2003

Năm 2003, một phân loại mô học các u vú của Tố chức y tế thế giới (WHO)

đã được công bố Phân loại các ung thư vú theo bảng phân loại mới này như sau:

Bảng 1.2 Phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (2003)

Ung thư biểu mô với hình ảnh ung thư biểu

mô màng đệm Ung thư biểu mô với hình ảnh tế bào hắc tố

2 Ung thư biểu mô tiểu thùy xâm nhập

3 Ung thư biểu mô ống nhỏ 8211/3 (Carcinoma thể ống xâm nhập nhỏ)

4 Ung thư biểu mô tủy 8510/3

5 Ung thư biểu mô nhầy và các u khác với

Ung thư biểu mô thần kinh nội tiết đặc

U carcinoid không điển hình 8249/3 Ung thư biểu mô tế bào nhỏ/ ung thư biểu mô

tế bào hạt lúa mạch 8041/3 Ung thư biểu mô thần kinh nội tiết tế bào lớn 8013/3

6 Ung thư biểu mô nhú xâm nhập 8507/3

7 Ung thư biểu mô vi nhú xâm nhập 8507/3

8 Ung thư biểu mô tuyến tiết rụng đầu

8401/3

9 Ung thư biểu mô dị sản 8575/3

Ung thư biểu mô dị sản biểu mô đơn thuần 8575/3

Ung thư biểu mô tế bào vảy 8070/3 Ung thư biểu mô tuyến dị sản tế bào thoi 8572/3

Ung thư biểu mô tuyến vảy 8560/3 Ung thư biểu mô nhầy biểu bì 8430/3 Ung thư biểu mô dị sản hỗn hợp biểu mô/ trung mô 8573/3

10 Ung thư biểu mô giàu lipid 8314/3

11 Ung thư biểu mô chế tiết 8502/3

12 Ung thư biểu mô tế bào hạt (Oncocytic

16 Ung thư biểu mô tuyến bã 8410/3

17 Ung thư biểu mô viêm 8530/3

18 U tiểu thùy Ung thư biểu mô tiểu thùy tại chỗ 8520/2

19 Tổn thương tăng sinh nội ống Ung thư biểu mô ống tại chỗ 8500/2

20 Ung thư biểu mô vi xâm nhập

21 Các u nhú nội ống Ung thư biểu mô nhú nội ống 8503/2

Ung thư biểu mô nhú nội nang 8504/2

Hệ thống phân loại mới của WHO (2003) chi tiết hơn các hệ thống phân loại

mô học trước đó, đặc biệt đưa vào nhiều tuýp đặc biệt và mỗi nhóm đều được mã hóa theo mã hóa bệnh quốc tế Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bảng hệ thống phân loại của WHO (2003) làm cơ sở để phân loại UTBM tuyến vú

Tóm lại hệ thống phân loại ung thư biểu mô tuyến vú luôn được sửa đổi và bổ sung Điều đó chứng minh tính chất phức tạp cả về hình thái tổn thương và diễn biến lâm sàng của bệnh, cũng như tính cấp thiết của việc tiếp tục nghiên cứu về

phân loại mô bệnh học [71]

1.6 Đặc điểm một số loại ung thư biểu mô tuyến vú thường gặp

1.6.1 Ung thư không xâm nhập (bao gồm cả bệnh Paget)

1.6.1.1 Ung thư biểu mô ống tại chỗ (intraduct carcinoma)

Ung thư biểu mô ống tại chỗ là ung thư phát triển từ tế bào biểu mô ống dẫn sữa Các tế bào ung thư mới chỉ phát triển trong lòng ống, chưa xâm nhập phá vỡ màng đáy ra mô đệm xung quanh

Ung thư ít gặp, chiếm 5%, u là cục chắc, nhỏ < 1 cm, hay ở trung tâm vú, có thể phát hiện khi chụp X quang (20%), tuổi mắc thường 40 – 60 Ung thư hay ở vú trái, 30% tiển tiển thành ung thư xâm nhập Điều trị bằng phẫu thuật cắt bỏ, tiên lượng tốt

Vi thể: có 4 loại :

- Ung thư chắc đặc (solid), các tế bào ung thư đầy chặt trong lòng ống

- Ung thư biểu mô trứng cá (comedo), hầu hết tế bào ung thư trung tâm ống bị hoại tử, nặn đùn lên như trứng cá

- Ung thư tuyến ống (cribriform), tế bào ung thư trong lòng ống tạo thành hình giống các ống tuyến

1.6.1.2 Ung thư biểu mô thùy tại chỗ

Đại thể: Ung thư biểu mô thùy tại chỗ còn được gọi là tân sản thùy (lobular

neoplasia) không có đặc điểm riêng trên đại thể vì thường tìm thấy một cách ngẫu nhiên trên những vú được cắt bỏ vì những lý do khác U thường có nhiều trung tâm trong khoảng 70% trường hợp và 2 bên trong khoảng 30-40% trường hợp

Vi thể: Các thùy giãn và bị lấp đầy bởi những tế bào kích thước từ nhỏ đến

trung bình, tròn, tương đối đều với nhân tròn, bình sắc hoặc tăng sắc nhẹ Nhân không điển hình, đa hình thái, nhân chia và hoại tử thành ổ và thay đổi hình dạng của tiểu thùy bị xâm nhập Các ống tận xung quanh có các tế bào giống những tế bào xâm nhập vào tiểu thùy, tạo thành một hàng liên tục dưới dạng biểu mô tiết [22]

1.6.2 Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập

Đại thể: Diện cắt thường chắc, cứng, màu xám hoặc trắng xám hoặc màu vàng

do mô đệm bị xơ hóa đáng kể Khi diện cắt có màu trắng sáng, bị hoại tử, lắng đọng calci hoặc thoái hóa trong Ranh giới không rõ

Vi thể : Khối u tăng sinh các tế bào biểu mô Các tế bào biểu mô tập hợp thành đám Nhân tế bào không đều, kiềm tính, chất nhiễm sắc thô, rải rác có nhân chia, một số hình thành lòng ống thứ phát Mô đệm xơ tăng sinh kèm xâm nhập nhiều tế bào viêm mạn, có những vùng thoái hóa và hoại tử [22]

1.6.3 Ung thư biểu mô tiểu thùy xâm nhập

Đại thể : Kích thước u có thể thay đổi từ vài cm đến chiếm toàn bộ tuyến vú

Đường kính trung bình của u không có sự khác biệt so với ung thư biểu mô thể ống xâm nhập Điển hình là diện cắt u cứng, chắc, ranh giới không rõ Hình thành các cục nhỏ, cứng mà không thể xác định được lành hay ác tính

Vi thể : Khối u tăng sinh các tế bào biểu mô Các tế bào biểu mô sắp xếp thành

dây hoặc thùy nằm trong mô đệm xơ dày Nhân tế bào u tương đối đều, bào tương hẹp, ít nhân chia, một số vùng còn giữ lại các cấu trúc ống hoặc tiểu thùy với các tế bào biểu mô quá sản Mô đệm xơ tăng sinh kèm xâm nhập các tế bào viêm mạn [22]

1.6.4 Ung thư biểu mô ống nhỏ

Đại thể: Ung thư biểu mô thể ống nhỏ thường có hình sao, diện cắt bị co lại trở

thành bị vùi vào mô vú lành bao quanh Hình ảnh đại thể giống tổn thương vú lành

Vi thể: Khối u tăng sinh các tế bào biểu mô, các tế bào biểu mô hình thành các

cấu trúc ống nhỏ Các ống được lót bởi một hàng tế bào có nhân nhỏ, kiềm tính, chất nhiễm sắc thô, ít nhân chia, bào tương hẹp Mô đệm xơ tăng sinh kèm xâm nhập các tế bào viêm mạn

1.6.5 Ung thư biểu mô thể tủy

Đại thể: U chắc vừa phải, một số u nhỏ ranh giới không rõ, diện cắt u bên trong chia thành các thùy, các nếp nhỏ, mềm, màu xám hơn so với các loại ung thư

khác, đôi khi có các điểm màu vàng là do hoại tử u Hiện tượng chảy máu và hoại tử

ít gặp Mức độ hoại tử liên quan trực tiếp đến kích thước khối u Khi có hoại tử, khối u thường hình thành nang

Vi thể: Khối u gồm các tế bào biểu mô kích thước không đều, nhân thô, hạt

nhân rõ, rải rác nhân chia, bào tương hẹp, sắp xếp thành đám, xâm lấn, đè đầy mô đệm, mô đệm xơ hóa, xâm nhiễm nhiều lympho bào [22]

1.6.6 Ung thư biểu mô thể nhầy

Ung thư biểu mô nhày còn gọi là ung thư biểu mô dạng nhầy, dạng keo hay gelatin thường xảy ra ở phụ nữ sau thời kì mãn kinh

Đại thể: U có tiếng kêu “lép bép” khi nắn được tạo thành bởi một khối giống

kem được bao bọc bởi một vách mỏng

Vi thể: Là nhưng đám nhỏ bơi trong một biển chất nhầy, các đám tế bài này có

thể đặc hoặc dạng túi, chất nhầy hoàn toàn ở ngoài tế bào và có thể là loại acid hay trung tính Đôi khi ung thư biểu mô nhầy chỉ chứa toàn chất nhầy Thành phần ung thư biểu mô tại chỗ thường không có [22]

1.7 Đặc điểm độ mô học của ung thư vú

Sự biệt hoá của u được cho là chỉ điểm hình thái của tính chất xâm lấn u Việc xác định độ biệt hoá có thể thực hiện không cần các thiết bị đặc biệt và ở một mức

độ nào đó không phụ thuộc vào tình trạng hạch nách Năm 1957, Bloom Richardson

là những người đầu tiên để xuất phân độ mô học dựa trên hệ thống thang điểm đánh giá 3 yếu tố gồm: mức độ hình thành các ống nhỏ; bất thường về hình dạng và kích thước nhân tế bào; mức độ tăng sắc của nhân và hoạt động phân bào trên tiêu bản cắt nhuộm thông thường Đến đầu năm 1990, Elston& Ellis đã bổ sung phương pháp đánh giá của Richardson& Bloom ở trên [31], [40], [41] Bảng phân loại bổ sung này được WHO (2003) chấp nhận và sử dụng rộng rãi cho đến nay Phương pháp này cũng dựa vào 3 yếu tố:

(1)Mức độ hình thành ống tuyến (2) Sự đa hình thái nhân

>75% khối u 1 điểm Nhân nhỏ, tương đối đồng dạng 1 điểm 10- 75% khối u 2 điểm Nhân không đều, mức độ vừa 2 điểm

Dựa vào thang điểm trên, độ mô học được chia làm 3 phân độ:

học và độ ác tính mô học là các yếu tố lâm sàng có giá trị tiên lượng bệnh [44] 1.8 Phân loại các nhóm phân tử ung thư vú

Trong nhiều thập niên qua, một thách thức lớn trong nghiên cứu bệnh sinh ung thư vú là làm sao xác định được những thay đổi ở mức độ phân tử liên quan tới các giai đoạn khác nhau của sự tiến triển bệnh Cho đến gần đây, nhờ sự tiến

bộ về kỹ thuật di truyền, đã cung cấp sự hiểu biết đầy đủ hơn ở mức độ phân tử của sinh học tế bào UTV Những nghiên cứu về biểu hiện gen đã giúp chúng ta

lý giải về sự không đồng nhất của đặc điểm sinh học và diễn biến lâm sàng của carcinoma ống tuyến vú xâm lấn, đặc biệt là sự tiến triển của UTV

Perou và cs (2000) đã thực hiện nghiên cứu biểu hiện gen trong ung thư vú

và khẳng định rằng có thể phân loại các nhóm phân tử ung thư vú khác nhau dựa vào sự khác biệt biểu hiện gen [57] Tiếp đó, nhiều nghiên cứu đã khảo sát biểu hiện gen bằng phương pháp microarray đã tìm thấy được sự tương ứng giữa biểu hiện gen và biểu hiện của dấu chứng sinh học qua phương pháp HMMD cũng như tương ứng với diễn biến lâm sàng và đề xuất phân nhóm phân tử dựa vào kiểu hình miễn dịch như sơ đồ sau:

Hình 1.6 Sơ đồ các phân nhóm phân tử trong ung thư vú [43]

Đặc điểm phân nhóm phân tử lòng ống: Đây là nhóm có biểu hiện thụ thể nội

tiết và mô hình gen thể hiện sự gợi nhớ kiểu hình của thành phần biểu mô ống tuyến

vú Phân nhóm này bao gồm CK8/18(+) và ER(+) Nhóm này được chia thành hai

nhóm nhỏ: phân nhóm lòng ống A và lòng ống B

Phân nhóm lòng ống A chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong các phân nhóm phân tử khoảng 60%, phân nhóm này liên quan tới chặt chẽ tới sự biểu hiện gen ER/PR, tỷ

lệ phân bào thấp, có thể chỉ điều trị nội tiết đơn thuần [43]

Phân nhóm lòng ống B là phân nhóm biểu hiện đồng thời ER/PR(+) và Her2(+) có tiên lượng xấu hơn phân nhóm lòng ống A, cần kết hợp hóa trị và điều trị nội tiết [43]

Đặc điểm phân nhóm phân tử Her2: Đặc trưng của phân nhóm Her2 là không

biểu hiện thụ thể nội tiết nhưng lại có khuếch đại gen Her2.Về bệnh học lâm sàng, phân nhóm Her2 thường gặp ở nhóm biệt hóa kém, có đột biến gen p53, tỷ lệ hạch

di căn gấp 2 lần phân nhóm lòng ống A Về phương diện điều trị và dự hậu, phân nhóm Her2 có dự hậu xấu Mặc dù vậy phân nhóm Her2 đáp ứng bệnh học hoàn toàn với điều trị hóa tân hỗ trợ có Anthracycline và Taxane cao hơn phân nhóm lòng ống Đặc biệt phân nhóm Her2 có thể điều trị bằng kháng thể đơn dòng kháng Her2 như là biện pháp điều trị nhắm trúng đích phân tử Điều trị bằng kháng thể đơn dòng

ER (-),HER2(-),CK 5/6,hoặc EGFR(-)

Phân nhóm không phân loại

HER2(-) HER2(+

ER (-),HER2(-),CK 5/6,hoặc EGFR(+)

Phân nhóm giống đáy

trastuzumab trên bệnh nhân ung thư vú có Her2(+) làm giảm tỷ lệ tái phát cao và

kéo dài thời gian sống không bệnh [43]

Đặc điểm phân nhóm giống đáy: Sở dĩ phân nhóm này có tên như vậy là vì

biểu hiện gen của phân nhóm này tương tự như biểu hiện gen của tế bào đáy trong các loại biểu mô của cơ thể cũng như biểu hiện gen của tế bào cơ biểu mô tuyến vú [43] Phân nhóm giống đáy không biểu hiện các gen liên quan tới ER, PR, Her2 nhưng lại biểu hiện các gen liên quan mạnh mẽ với các CK5/6 hoặc CK17 và các gen tăng sản Biểu hiện gen của phân nhóm giống đáy liên quan mạnh mẽ tới sự đột biến gen BRCA1, kiểu hình phân nhóm giống đáy là “dấu chỉ điểm” cho những ổ đột biến biểu hiện gen BRCA1 nhưng không có yếu tố gia đình và loại carcinom dạng tủy Kiểu hình bộ ba âm tính ER(-)/PR(-), Her2(-) gồm phân nhóm giống đáy

và phân nhóm không phân loại, chiếm khoảng 16% carcinom vú xâm lấn và thường được xem là đại diện cho phân nhóm giống đáy bởi vì dữ liệu biểu hiện gen của hai nhóm này liên quan chặt chẽ với nhau Hoạt động của gen BRCA1 với chức năng kiểm soát chu kì phân bào và sửa chữa DNA làm cho phân nhóm giống đáy nhạy cảm với những tác nhân gây tổn thương DNA nhưng lại đề kháng với tác nhân gây độc tế bào [43]

Đặc điểm phân nhóm không phân loại: Biểu hiện kiểu hình của gen giống như

mô vú bình thường hoặc là phân nhóm đỉnh tiết nếu biểu hiện thụ thể Androgen [43]

1.9 Hóa mô miễn dịch

1.9.1 Lược sử phát triển

Hóa mô miễn dịch (HMMD) ra đời nhờ việc ứng dụng các nguyên lý và các

kỹ thuật của miễn dịch học vào việc nghiên cứu tế bào và mô Năm 1941, Coons và cộng sự là người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mô Kỹ thuật hóa mô miễn dịch ngày càng phát triển, một số enzym đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1996) và Alkaline phosphatase (Mason và Sammons, 1978) Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử phóng xạ và phản ứng

miễn dịch được nhận biết bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography) [38]

Hóa mô miễn dịch nhằm mục đích không chỉ để xác định xem một mô có biểu hiện hay không một kháng nguyên riêng biệt mà còn xác định tình trạng kháng nguyên của các tế bào riêng biệt trong mô đó và vị trí của kháng nguyên đó trong cấu trúc tế bào HMMD sử dụng các kháng thể đặc hiệu khác nhau về kháng nguyên giữa các tế bào Những sự khác nhau này có thể xác định một cách đặc hiệu

một dòng tế bào, phân định rõ những đặc điểm sinh học của các tế bào khác nhau trong cùng một dòng tế bào, xác định sự khác biệt về chức năng giữa các tế bào và thậm chí có thể được sử dụng để xác định các thay đổi kháng nguyên của tế bào hoặc bản thân sự hiện diện của các yếu tố ngoại lai xâm nhập vào mô [38], [46] Ngày nay, HMMD đã trở thành một kỹ thuật chủ yếu và được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng) (IHC, world, 2005)

1.9.2 Nguyên lý của phương pháp HMMD

* Nguyên lý: Cho kháng thể (KT) đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có kháng

nguyên sẽ có phản ứng kết hợp KN – KT [2]

Hình 1.7 Nguyên lý của phương pháp HMMD

(Nguồn: http://www.cancer.gov/)

Có 2 cách để quan sát được phức hợp này:

+ Miễn dịch huỳnh quang: Cho gắn với một chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

+ Miễn dịch men: Cho gắn với một loại men (peroxidase hoặc alkaline phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học

- Kháng nguyên (KN): Có thể hiện diện ở bào tương, màng tế bào hoặc nhân

- Kháng thể (KT): Là các protein nhận biết và kết nối với KN đặc hiệu, sản xuất từ sự đáp ứng với biểu hiện của KN Có 2 loại KT:

+ KT đa dòng được sản xuất bằng cách gây miễn dịch ở động vật với KN đặc hiệu Sau đó, KT được làm tinh khiết (loại bỏ KT không cần thiết) KT đa dòng có

thể kết hợp với nhiều vị trí của một KN nên độ nhạy cao Nhưng KT đa dòng có thể chứa các KT phản ứng không đặc hiệu với KN nên thường dùng để nhuộm nền + KT đơn dòng được sản xuất bằng kỹ thuật u lai KT đơn dòng được sản xuất

từ một dòng của tế bào u lympho B lai với tế bào ung thư (myeloma) nên tinh khiết

và chỉ phản ứng với một loại KN, do đó ít nhạy cảm hơn so với KT đa dòng [38]

* Hệ thống phát hiện

Nhằm mục đích quan sát được phức hợp KN-KT dưới kính hiển vi quang học, dưới dạng các thành tố có màu sắc, giúp người đọc có thể xác định được sự hiện diện của chúng trong tế bào và mô Người ta phải sử dụng các kháng thể được đánh dấu với các chất hiện màu khác nhau như chất huỳnh quang, enzim Đối với phương pháp HMMD enzim đang được áp dụng rộng rãi hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống hiển thị vừa có khả năng bắt màu vừa có khả năng phóng đại phức hợp KN-KT Nguyên lý hệ thống phát hiện này gồm 2 phần:

- KT thứ 2 (secondary antibody) hay còn gọi là kháng thể bắc cầu: Là cầu nối

hệ thống kháng thể thứ nhất (primary antibody) với hệ thống phóng đại và bắt màu Thực chất đây là kháng thể chống globulin miễn dịch (Ig) của động vật sản xuất ra kháng thể thứ nhất Nếu kháng thể thứ nhất là IgG của chuột thì kháng thể thứ hai phải là kháng thể của thỏ hoặc của dê chống chuột Nếu sử dụng phương pháp biotin-streptavidin hoặc avidin-biotin complex (ABC), kháng thể thứ hai phải được gắn với biotin

- Hệ thống phóng đại và bắt màu gồm một enzim và chất màu (chromogen) Hai loại enzim được dùng phổ biến là peroxidase chiết xuất từ cây cải ngựa (horseradish peroxidase, HRP) và alkakine phosphatase (AP) chiết xuất từ vi khuẩn E.Coli Enzim sẽ được gắn vào kháng thể thứ 2 hoặc gắn trực tiếp vào kháng thể hoặc bằng cầu nối hóa học avidin-biotin, hoặc protein A tụ cầu khuẩn Hiện nay người ta thường gắn enzim với phức hợp biotin-avidin Chất màu cho phép xác định

có hay không sự hiện diện của kháng nguyên trong tế bào và mô dưới kính hiển vi quang học Tùy theo mục đích tiến hành kỹ thuật, người ta có thể sử dụng chất tạo màu khác nhau Hợp chất diaminobenzidin (DAB) được sử dụng nhiều vì sản phẩm

có màu nâu khá bện vững Nếu chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu, không cần lưu trữ tiêu bản quá lâu, người ta thường sử dụng hợp chất 3 amono-9-ethylcarbazole (EAC), tạo sản phẩm màu đỏ, dễ bị phai màu hơn [1], [38]

1.9.3 Các kỹ thuật nhuộm miễn dịch men

- Miễn dịch mentrực tiếp: KN mô kết hợp với KT thứ nhất có gắn men

Phương pháp đơn giản, nhanh, đặc hiệu nhưng ít nhạy do thiếu hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết

- Miễn dịch men giántiếp: KN mô + KT thứ nhất + KT thứ hai gắn với hệ

thống phóng đại dấu hiệu nhận biết Phương pháp này có ưu điểm:

+ Dùng nhiều loại KT thứ nhất khác nhau

+ Hệ thống phóng đại chỉ gắn với KT2 và có thể tạo ra nhiều vị trí gắn phức hợp nhận biết trên KT thứ 2,

+ KT thứ nhất thường được pha loãng hơn do đó giảm độ nhuộm nền hơn

Một chất được định vị trong mô phải có các tiêu chuẩn sau:

- Tinh chế dưới dạng KN tương đối thuần khiết (để sản xuất KT đặc hiệu)

- Sự bảo toàn (ít nhất một phần) của chất KN muốn định vị trong quá trình thao tác kỹ thuật mô học và HMMD

1.9.5 Ý nghĩa

HMMD có thể xác định những đặc tính sau của mô:

- Xác định nguồn gốc mô học

- Xác định số lượng thành phần tế bào trong quá trình phát triển bệnh

- Nồng độ thực tế của KN trong tế bào u, đồng thời có thể xác định được độ ác tính cũng như sự đáp ứng của khối u trong quá trình điều trị

- Xác định vị trí KN và sự phân bố của nó trong tế bào và tổ chức, từ đó xác định tiêu chuẩn mới cho chẩn đoán và đánh giá bệnh chính xác hơn [39],[40]

1.9.6 Vai trò của HMMD trong chẩn đoán ung thư vú

Ung thư vú là bệnh phức tạp, đa dạng về hình thái, đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và sinh học phân tử Do vậy đáp ứng điều trị cũng khác nhau Chẩn đoán

và tiên lượng các bệnh nhân ung thư vú thường dựa trên các tiêu chuẩn hình thái học Tuy nhiên các tiêu chẩn này không đủ để cho phép đánh giá tiên lượng chính xác cho từng bệnh nhân Vì vậy, sự hiểu biết về giải phẫu bệnh mô tuyến vú sử dụng các dấu ấn hóa mô miễn dịch đã phản ánh một số thành phần cấu trúc bản chất

là protein liên quan chặt chẽ với cơ chế bệnh sinh, đó là những thụ thể trong nhân

và ở màng tế bào như p53, Ki67, ER, PR, Her2, các sợi tơ trung gian có bản chất cytokeratin (dấu ấn sinh học) yếu tố này có vai trò quan trọng trong việc tiên lượng bệnh và phán đoán khả năng đáp ứng với hóa trị liệu Các thụ thể này không chỉ biểu hiện trong tế bào UTV mà còn cả tế bào bình thường Tuy nhiên mức độ biểu hiện và ý nghĩa khác nhau Bằng phương pháp HMMD có thể khảo sát được vị trí

và mức độ của các dấu ấn sinh học này ngay trên mô đã được chẩn đoán bằng mô bệnh học thông thường không chỉ tăng độ nhạy phát hiện mà còn giúp tiên lượng tốt hơn Nguy cơ tái phát và di căn tiềm tàng có thể được đánh giá chính xác hơn từ đó cho phép đưa ra các liệu pháp điều trị đích hiệu quả hơn Phân loại hóa mô miễn dịch cung cấp các thông tin điều trị và tiên lượng hữu ích

HMMD không thể thay thế được phương pháp mô bệnh học thông thường nhưng nó cũng thể hiện là một phương pháp có nhiều ưu điểm là tiện lợi, độ nhạy cao, tiêu bản dễ bảo quản sau khi đã phân tích và chỉ cần sử dụng kính hiển vi thông thường khi quan sát Tuy nhiên, các dấu chứng sinh học có bản chất là protein nên nhược điểm của phương pháp này là dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện cố định mẫu, cách xử lý mẫu, thời gian, kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại kháng thể và quan trọng hơn cả là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm bán định lượng, dẫn đến sự chưa đồng đều về giá trị nghiên cứu Vì vậy, cần có thêm nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa để hoàn thiện kĩ thuật HMMD phù hợp với điều kiện của từng cơ sở và đánh giá chính xác hơn vai trò của HMMD đối với UTV nói riêng và các bệnh ung thư nói chung

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu gồm 75 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến vú đã được khám và điều trị tại bệnh viện Ung Bướu Nghệ An từ đầu năm 2013 Số bệnh nhân này đã được xác định về các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học thông thường và phân

loại UTV tại khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An

- Những bệnh nhân chọn nghiên cứu có đầy đủ các tiêu chuẩn sau:

+ Bệnh nhân đồng ý nghiên cứu

+ Có phiếu yêu cầu xét nghiệm mô bệnh học ghi nhận các thông tin: họ tên, tuổi, giới tính, vị trí u, kích thước u và tình trạng di căn hạch

+ Còn khối nến lưu giữ mẫu mô đủ để nghiên cứu mô bệnh học và hóa mô

- Tiêu chuẩn lựa chọn nghiên cứu hóa mô miễn dịch

+ Được mổ cắt toàn bộ tuyến vú theo phẫu thuật Patey

+ Có chẩn đoán mô học là ung thư biểu mô tuyến vú

+ Còn mẫu mô đủ để cắt tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch

+ Còn tính kháng nguyên khi nhuộm HMMD (dựa vào chứng âm và chứng dương)

- Tiêu chuẩn loại trừ

+ Các trường hợp không đủ các tiêu chuẩn trên

+ Các trường hợp tái phát được phẫu thuật lại

2.1.2 Thời gian

Từ tháng 4/2013 đến tháng 6/ 2014: Tiến hành triển khai thực hiện kĩ thuật hóa

mô đối với các đối tượng là ung thư vú và tiếp tục ghi nhận những kết quả thu được

2.1.3 Địa điểm

Tại khoa Giải phẫu bệnh- Tế bào Bệnh viện Ung Bướu Nghệ An- Vinh- Nghệ An

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Các kháng thể, dung dịch đệm rửa, bộc lộ kháng nguyên và hệ thống phát hiện của hãng Dako Cytomation( Đan Mạch)

* Các kháng thể sử dụng: