các enzyme sử dụng trong sinh học phân tử

OÔng cho rằng: Có những enzyme đặc biệt, hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có thể phân biệt được DNA của mình và DNA lạ của phage.. O Những enzyme này hạn chế khả năng sinh sản của

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PH ẨM TP.HCM

KHOA CNSH & KTMT

GVHD: Th.S Trần Quỳnh Hoa

NHÓM 4CÁC ENZYME SỬ DỤNG TRONG

SINH HỌC PHÂN TỬ

Enzim Giới Hạn (Restriction

enzyme)

Lịch sử phát hiện

ORE được phát hiện lần đầu tiên bởi Werner Arber(Thụy Điển)

OÔng cho rằng: Có những enzyme đặc biệt, hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có thể phân biệt được DNA của mình và DNA lạ của

phage

O Những enzyme này hạn chế khả năng sinh sản của phage trong tế bào

vi khuẩn bằng cách cắt DNA của phage thành những đoạn nhỏ

Định nghĩa

Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE)

O Là một enzyme thuộc enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu

OPhân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases

O Cắt AND ở những đoạn xác định thành những đoạn ngắn

Thí nghiệm có thể mô tả như sau:

Cho phage xâm nhiễm vào hai chủng vi khuẩn A và B, các vi khuẩn này được nuôi cấy trong môi trường thích hợp Sau khi thu hồi và phân tích DNA của phage

Ở chủng vi khuẩn A: xuất hiện nhiều AND của phage còn nguyên vẹn nhưng tế bào của vi khuẩn bị phá vỡ (do sự nhân lên của phage trong tế bào vi khuẩn)

Ở chủng B: Tế bào vi khuẩn không bị phá vỡ nhưng AND phage bị

cắt thành những đoạn có kích thước xác định (Trong trường hợp này, AND của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập vào vi khuẩn)

=> Phần lớn các loài vi khuẩn có hệ thống chuyên biệt hạn chế biến đổi để bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của AND lạ

Phân loại

RE chia thành 3 loại:

OLoại I: Khi Enzime nhận biết trình tự, nó sẽ di chuyển trên

phân tử DNA, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotid

OLoại II: Enzime nhận biết trình tự và cắt ngay trên vị trí đó

OLoại III: Enzime nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí

cách đó khoảng 20 nucleotid

Các loại RE trong nhóm IIa)Trình tự nhận biết của RE

Mỗi một enzim nhận một đoạn nucleotid khác nhau gọi là trình tự nhận biết,đoạn đọc ngược xuôi

Chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palinromic), hai mạch hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều từ 5’ đến 3’ở mỗi sợi đơn

 Ví dụ: Restriction endonuclease EcoR I (từ Ecoli) có trình tự nhận biết:

… G A A T T C… ….G… …A A T T C…

… C T T A A G… …C T T A A… …G…

Các kiểu cắt

Cắt có đầu bằng:

RE cắt 2 mạch DNA tại cùng một điểm => đoạn DNA có đầu bằng (blunt ends) không có khả năng kết hộ trở lại, nối các đoạn DNA bằng enzyme T4 ligase

Ví dụ, enzyme Sma I nhận biết đoạn đặc hiệu có 6 cặp

nucleotid, cắt ở giai đoạn nhận biết tạo đầu bằng:

Các kiểu cắt

 Cắt đầu so le hay đầu dính(cohevse ends)

ORE cắt mạch DNA ở vị trí lệch, có thể tự nối lại với nhau không cần sự

có mặt của enzim nối DNA ligase

OVí dụ : enzim EcoR I nhận biết đoạn đặc hiệu có 6 căp nucleotid , cắt

ở các vị trí khác nhau ở hai mạch đơn DNA tạo các đầu cắt sole

Điều kiện hoạt động của RE

OMỗi loại RE có hoạt tính cao ở những điều kiện nhất định

MỘT SỐ QUY TẮC CẦN LƯU Ý KHI THIẾT LẬP MỘT PHẢN ỨNG THỦY GIẢI BỞI

RE giữ hoạt tính 50% Glycerol,bảo quản ở-20oC.Khi tiến hành thủy giải chỉ lấy

RE vào phút chót sau khi đã cho đủ các thành phần khác

Thể tích càng nhỏ tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa Enzim- cơ chất

Ứng dụng của enzim giới hạn trong công

nghệ gen

O Cho phép cắt bỏ BNST khổng lồ thao tác gen dễ dàng hơn

OTạo ra một số lượng lớn các bản sao của một trình tự DNA xác định

CÁC ENZYME THÔNG DỤNG KHÁC

 Các polymerase

 Các ligase

 Các nuclease

I CÁC POLYMERASE:

• DNA polymease I (DNA pol I)

- Có vai trò trong cơ chế sữa sai trong sao chép vi khuẩn, tổng hợp theo chiều

- Là một enzyme được tách chiết từ một vi khuẩn từ suối nước nóng Không bị phá

hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản

ứng

• Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase)

- Do retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào kí chủ

- Tổng hợp nên một mạch DNA bổ sung(cDNA) từ khuôn RNA theo chiều 5’- 3’ khi có mặt mồi

• Terminal transferase

- Được trích ly từ tuyến ức của bê

- Phản ứng xúc tác gắn các deocxynucleotidevafo đầu 3’OH tự do của phân tử DNA

• Các RNA polymerase

- Xúc tác tổng hợp RNA từ một mạch của một DNA mạch đôi theo chiều 5’-3’.Tổng hợp không cần mồi nhưng khuôn DNA phải mang 1 promoter đặc trưng

II CÁC LIGASE

Các enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) Được sử dụng kết hợp hai enzym khác là T4 polynucleotide kinase và Alkaline phosphatase.

• E.coli DNA ligase

- Emzym được trích ly từ E.coli và xúc tác phản ứng nối 2 trình tự DNA có đầu so le

Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli Ngoài chức năng với ligase trích từ E coli còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng.

• T4 DNA ligase

Được trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, xúc tác sự nối 2 trình tự RNA bằng liên kết

phosphodiester Sử dụng để đánh dấu phóng xạ đầu 3’ của các phân tử RNA dùng làm mẫu dò phân tử

• T4 RNA ligase

Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli.

Enzym này xúc tác cho sự chuyển nhóm

γ- phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA

• T4 Polynucleotide kinase

• Alkaline phosphate

Được ly trích từ E.coli hay ruột bê, enzym xúc tác sự loại bỏ nhóm 5’ phosphate của DNA, RNA và các nucleotide tự do

III.CÁC NUCLEASE

Đây là nhóm enzyme phân cắt DNA (Dnase) và RNA (RNase)

• DNase 1

- Enzyme có nguồn gốc từ tụy tạng bò, có vai trò xúc tác các phản ứng thủy giải liên kết

nằm ngay sau một pyrimidine trên chuỗi DNA mạch đơn hay mạch đôi

• nuclease s1

- Enzyme được trích ly từ Aspergillus oryzae, có khả năng phân hủy các DNA mạch đơn DNA mạch đôi, phân tử lai DNA : RNA không bị enzyme phân cắt, trừ những đoạn mạch đơn trên các phân tử này

• Exonuclease iii

- Là enzyme tách chiết từ E.coli, xúc tác các phản ứng thủy giải tuần tự các nucleotide từ đầu 3’OH tự do của một DNA, theo chiều 3’ → 5’  hình thành nên một vòng mạch đơn dài trên một DNA mạch đôi

• rnase h

- Có khả năng loại bỏ RNA trong một phân tử lai RNA : DNA và thường được dùng để loại

bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ 2 của cDNA hình thành một DNA mạch đôi

CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC

BẠN

THE END