Cơ sở khoa học và ứng dụng của sinh học phân tử trong giám định hài cốt

Tên phương pháp Ưu điểm Nhược điểmGiám định hài cốt bằng kĩ thuật phân tích hệ gen ty thể ● Gen ty thể có cấu trúc dạng vòng bền vững ● Tồn tại lâu dài sau khi tế bào bị phân hủy, được

Cơ sở khoa học và ứng dụng của sinh học phân tử trong giám định

hài cốt

NỘI DUNG

I TỔNG QUAN

II CƠ SỞ KHOA HỌC

1 SƠ ĐỒ PHẢ HỆ VÀ TY THỂ

2 CÁC BƯỚC VÀ KỸ THUẬT DÙNG TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT

3 GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG HVI VÀ HVII

III ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU

• Giúp giải quyết các nhu cầu về dân sự và hành chính.

• Việc giám định hài cốt có ba cách là giám định hình thái, giám định hài cốt bằng kỹ thuật phân tích gen ty thể và giám định qua di vật

Tên phương pháp Ưu điểm Nhược điểm

Giám định qua

hình thái xương ● Xác định khá chính xác độ tuổi và giới tính

hài cốt.

● Đòi hỏi hộp sọ còn nguyên vẹn.

● Không phải lúc nào cũng thành công, đặc biệt là khi các đặc điểm nhận dạng và thông tin trước khi chết không rõ ràng, hồ sơ nha khoa và y tế không có.

Tên phương pháp Ưu điểm Nhược điểm

Giám định hài cốt

bằng kĩ thuật phân

tích hệ gen ty thể

● Gen ty thể có cấu trúc dạng vòng bền vững

● Tồn tại lâu dài sau khi tế bào bị phân hủy, được bảo tồn trong xương và răng.

● Có tỉ lệ thành công và độ chính xác cao.

● Chỉ xác định được khi có dòng mẹ.

-Ty thể là một bào quan của tế bào, là “nhà máy” cung cấp năng lượng cho tế bào Điều đặc biệt là ty thể có hệ gene riêng, độc lập với hệ gen di truyền ở trong nhân Khi thụ tinh, ty thể của người cha tập trung nằm ở phần sát đuôi của tinh trùng và không tham gia vào quá trình thụ tinh

Trong khi đó, tế bào trứng (của người mẹ) lại chứa ty thể tham gia vào quá trình thụ tinh và hình thành phôi thai Chính vì vậy, một đứa trẻ ra đời sẽ chỉ mang ty thể của người mẹ và hưởng các gen ty thể từ đó Nói cách khác, ty thể được truyền theo dòng mẹ

 -Đặc điểm của hệ gen ty thể: Hệ gen này có cấu trúc mạch vòng do đó bền vững hơn hệ gen nhân Trong khi đó, hệ gen nhân có mạch thẳng nên

dễ bị phá huỷ trong điều kiện hài cốt được mai táng sơ sài và lâu năm Trong các mẫu hài cốt, nhất là những mẫu lâu năm, thì chỉ có hệ gen ty thể là còn tồn tại và nằm trong xương Đây chính là nguồn nguyên liệu quan trọng trong việc giám định hài cốt

II.CƠ SỞ KHOA HỌC

SƠ ĐỒ PHẢ HỆ THEO DÒNG TY THỂ

=> Giám định ADN ty thể : Xét nghiệm bằng cách so sánh hệ DNA ty

thể - xét nghiệm theo dòng mẹ- có thể xác định được mối quan hệ của một người trong những mối quan hệ họ hàng đã mất từ rất lâu và tổ tiên thông qua dòng mẹ Nó cũng có thể cung cấp thêm thông tin cho các

hoàn cảnh nghi vấn về quan hệ huyết thống mẹ con nhưng người mẹ

không thể tham gia vào xét nghiệm Xét nghiệm này còn dùng để định danh tính của hài cốt chưa rõ tên Quá trình này được thực hiện theo

quy trình rất chặt chẽ, vô khuẩn, chính xác với máy móc hiện đại với mẫu đối chứng thuận lợi nhất là máu của người thân liên quan tới dòng

mẹ (mẹ đẻ, anh chị em cùng mẹ, con của chị em gái ) bởi hệ gien ty thể của người cha nằm ở đuôi tinh trùng nên không tham gia vào quá trình tạo phôi khi thụ thai.

=> Giám định nhiễm sắc thể X : Nhiễm sắc thể X tuy số gen tìm được

trên đó chỉ tương đương với khoảng 4% tổng số gen của người nhưng

nó đóng vai trò đặc biệt, xét nghiệm nữ-nữ

SƠ ĐỒ PHẢ HỆ THEO DÒNG BỐ ( nts Y)

=> Giám định ADN giới tính Y : tuy hệ gen nhân di truyền theo

dòng cha có mạch thẳng, dễ bị phá huỷ khó tiến hành với các thi xác chôn lâu năm những nó chỉ truyền từ người bố cho con trai

và di truyền qua các thế hệ với độ ổn định lớn nên có nhiều ứng dụng việc truy nhận cha-con trai

1 TY THỂ

a Ty thể là gì?

- Ty thể là một bào quan màng kép của tế bào sinh vật nhân thực,

- Mỗi ty thể đều có màng ngoài và màng trong

(với đặc tính khác nhau), cấu tạo từ lớp phospholipid

kép cùng protein

- Cấu tạo gồm 5 bộ phận: màng ty thể ngoài, xoang

gian màng, màng ty thể trong, xoang mào (tạo thành

từ sự gấp nếp màng trong) và chất nền Ty thể nào bị

tước đi màng ngoài thì gọi là mitoplast

b Hệ gen ty thể (mtDNA-mitochondrial)

● Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân Khá bền vững và ít bị phá hủy hơn so với gen nhân có cấu trúc mạch thẳng dễ bị phân hủy bởi enzyme nội bào hoặc vị khuẩn

● DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép (2 chuỗi: chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L), dạng trần không có histon , có kích thước 16569 bp, gồm 37 gen, trong đó:

- Có 13 gen mã hóa tham gia vào tạo enzyme có vai trò trong chuỗi điện tử phospholyl hóa.

- 22 gen mã hóa tRNA và 2 gen mã hóa rRNA Các RNA này tham gia vào quá trình dịch

mã trong tế bào ti thể và vẫn đảm bảo thông tin di truyền bộ gen của ti thể

Mô hình DNA ty thể ở người

- Vùng điều khiển D – Loop viết tắt là mtDNA: có vùng siêu biến HVI và vùng siêu biến

HVII ( quan trọng nhất) và HVIII

- Cytochrome b hoạt động như chuỗi vận chuyển điện tử

- NADH dehydrogenase subunits xen kẽ các gen mã hóa ARN

- 16S rRNA vai trò cấu trúc, hoạt động như một giàn giáo xác định vị trí của các protein ribosome 

- 12S rRNA thành phần của tiểu đơn vị nhỏ

*** Vùng điều khiển D - Loop (Displacement Loop) của bộ gen ty thể hay DNA ty thể viết tắt là mtDNA (mitochondrial Deoxyribo Nucleic Acid) người với các ưu điểm như di truyền độc lập với DNA nhân, tần số đột biến cao, di truyền theo dòng

mẹ, không tái tổ hợp và số lượng bản sao lớn ,đặc biệt là vùng siêu biến HVI và

vùng siêu biến HVII

=> Mục đích của xét nghiệm ADN là tìm ra sự khác biệt giữa các trình tự nucleotic giữa các cá thể HVI và HVII là những trình tự quan trọng và được phân tích để xác định danh tính của mỗi người Trình tự gen của 2 vùng HVI và HVII có độ đa hình cao nhất, không chứa các gen mã hóa và có tỉ lệ đột biến cao hơn 10 lần so với các vùng gen mã hóa

Trình tự HVIII là một phần cuả vùng gen mã hóa

● Hệ gen ty thể không chứa intron và toàn bộ trình tự đều mã hóa protein

● Chỉ có 1 vùng không mã hóa gọi là vùng kiểm soát hay vùng D-Loop chứa điểm khởi đầu sao chép chuỗi nặng và promoter cho phiên mã chuỗi nặng và chuỗi nhẹ

● Hệ gen ty thể có thể tồn tại lâu hơn sau khi tế bào bị phá hủy so với hệ gen trong nhân

c Đặc điểm di truyền của mtDNA

● Đặc điểm di truyền của mtDNA là theo dòng mẹ, giống tất cả các DNA

ngoài nhân khác

● Đó là do khi thụ tinh thì hợp tử thừa kế tế bào chất và các bào quan độc

quyền từ tế bào trứng của mẹ, trong đó có mtDNA, còn tinh trùng chỉ góp

vào DNA nhiễm sắc thể và bỏ lại các bào quan, bên ngoài hợp tử

→ Người mẹ truyền hệ gen ty thể cho các con nhưng chỉ con gái bà mới có thể truyền hệ gen này cho thế hệ tiếp theo

2 CÁC BƯỚC TRONG GIÁM ĐỊNH HÀI CỐT

Lấy từ 1 đến 2 chiếc răng

Tóc (10 sợi có chân tóc)

Móng tay hoặc móng chân (5 mảnh)

Bảo quản trong túi nilon có niêm phong, ngoài bì ghi rõ đề nghị xác định danh tính đối với hài cốt

Bảo quản trong túi nilon đặt trong bì thư, ngoài bì ghi rõ thông tin người được lấy mẫu

‣ Lấy 1 lượng xương

nhỏ trong mẫu hài cốt

để tách chiết DNA

⁕ Chuẩn bị mẫu để thực hiện phản ứng

PCR

Mục đích : Phân giải tối ưu mẫu xương để giải phóng DNA ty

thể

Ly tâm tốc độ cao

mẫu

Ly tâm lạnh hỗn hợp với tốc độ 1500 v/ph

MỌI CÔNG ĐOẠN ĐỀU THỰC HIỆN TRONG MÔI TRƯỜNG INVITRO VÀ VÔ TRÙNG

Thu và hòa tan DNA trong nước

khử ion

B Khuếch đại DNA ty thể

● Một đoạn gen đặc hiệu HV1 nằm trong

vùng D-Loop của ADN ty thể được nhân bản bằng máy PCR để tạo ra hàng tỷ bản sao,

phục vụ cho khâu tách dòng gen

Sử dụng phần mềm Primer premier 6.0 để thiết kế hai cặp mồi (primer) cho trình tự HVI và HVII của bộ gen ty thể dựa trên trình tự rCRS của Andrews đã được công

bố vào năm 1999 Xác định hàm lượng của trình tự HVI, HVII bằng phân tử gắn huỳnh quang EvaGreen vào dsDNA Dùng bộ kit Kapa 2G Robust Hotstart

Readymix (2X) xây dựng phản ứng định lượng với 5 đường chuẩn và thực hiện

phản ứng Real - Time PCR trên máy LightCycler® Nano Real - Time PCR System của hãng Roche Chu trình luân kỳ nhiệt theo Bảng 1

Công đoạn Nhiệt độ ( 0 C) Tốc độ gia nhiệt (giây) Thời gian (giây)

Chương trình PCR (35 ÷ 40 chu kỳ) Tiền biến tính 95 5,0 180 Biến tình 90 2,5 5

Bắt cặp 55 2,5 15 Kéo dài mạch 72 2,5 10 Kéo dài sau cùng 95 5,0 120

Phân tích đỉnh chảy Giai đoạn đầu 60 4,0 15 Giai đoạn cuối 90 0,5 15

Tên mồi Khuếch đại

vùng siêu biến

Trình tự mồi

Khuếch đại gen:

Sau khi tách chiết AND ti thể, kiểm tra

nồng độ ADN, tiến hành phản ứng PCR

bằng cặp các mồi trên 2 vùng siêu biến

HVI, HVII của ADN ti thể:

Đối với những mẫu xương lâu năm, ADN ti thể bị phân hủy thành những đoạn ngắn thì có thể sử dụng thêm những cặp mồi khác để phân tích những đoạn gen ngắn hơn sau đây:

C GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG HVI, HVII CỦA DNA TY THỂ NGƯỜI

- Đánh giá chất lượng và phân loại mẫu

- Tiền trích ly

- Trích ly DNA bằng hạt từ

- Khuyech đại trình tự vùng HVI và

HVII bằng phương pháp Real – Time PCR

- Tinh sạch sản phẩm PCR

- Điện di

- Giải trình tự HVI và HVII

- Phân tích điểm đa hình

- Kết quả và thảo luận

=> Một số thông tin về các phương

pháp này:

⁕ Phương pháp 1: Phương pháp của Frederick Sanger (phương pháp dideoxy)

⁕ Phương pháp 2: Phương pháp của Illumine

Phương pháp 3: Pyrosequencing

⁕

Giải trình tự HVI và HVII

Điện di mao quản trên hệ thống 3130 Genetic Analyzer (hãng Life Technologies) để giải trình tự vùng HVI và HVII của các mẫu với BigDye Terminator v 3.1/v 1.1 Cycle Sequencing Kit Phương pháp điện di mao quản hoạt động dựa trên nguyên tắc giải trình tự tự động dùng ddNTP của Sanger, đây là phản ứng Cycle Sequencing thực hiện cùng lúc 4 phản ứng của phương pháp Sanger trong 1 tube Đối với giải trình tự vùng HVI và HVII của mtDNA,

hệ thống ghi nhận sự sai khác 1 nucleotide

Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự vùng HVI

- Dựa vào đặc điểm của hai vùng trình tự HVI, HVII của mtDNA người là vùng chứa các SNP đặc trưng

- Với sự phân bố các SNP trên trình tự HVI (Hình 1), cho thấy trong 342 nucleotide vùng HVI tổng cộng có 32 SNP, chiếm tỷ lệ 9,4 % tổng số nucleotide

- Base cytosine ở vị trí 16223 biến thành thymine chiếm tỷ

lệ nhiều nhất là 43,5 % so với tổng số, base cytosine ở vị trí 16223 biến thành thymine chiếm tỷ lệ nhiều nhất là 43,5

% so với tổng số

Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự vùng HVII

- Sự phân bố các SNP ở trình tự HVII cho thấy,

trong 268 nucleotide đã có

23 SNP, chiếm tỷ lệ 8,6 %

Xác định trình tự nucleotide sau đó phân tích gen

2 ỨNG DỤNG

● Giám định hài cốt nhận dạng cá thể một trong những mục tiêu chính của

lĩnh vực khoa học pháp y phục vụ cho thực thi pháp luật, là giám định y khoa

và các mục tiêu nhân đạo của xã hội

● Do hậu quả của thiên tai, thảm họa hàng loạt, chiến tranh…khiến cho số lượng thi thể, hài cốt cần nhận diện có thể lên tới hàng chục nghìn vụ mỗi năm.

3 THÀNH TỰU

● Hiện nay Việt Nam có hơn 350.000 liệt sĩ vô danh

● Ở Mỹ có hàng chục nghìn lính Mỹ bị mất tích qua các cuộc chiến tranh thế giới lần thứ 2, chiến tranh xâm lược Việt Nam…

Giám định hài cốt giúp tìm ra danh tính của các liệt sĩ, trả lại thân thế cho các liệt sĩ vô danh

Những mẫu hài cốt liệt sĩ chưa được định danh hoặc còn nghi vần đều được

phân tích và lưu vào ngân hàng dữ liệu, kèm theo các thông tin về địa điểm khai quật

● Trong việc phá án, giám định hài cốt giúp tìm ra danh tính nạn nhân

Các kết quả của giám định viên là chứng cứ pháp lý phục vụ cho công tác truy xét, điều tra theo dấu vết để nhanh chóng tìm ra hung thủ, minh oan cho người không phạm tội Phòng ngừa tội phạm

● Nhận dạng nạn nhân trong các thảm họa thiên tai

Tìm ra danh tính nạn nhân

● Sử dụng các mẫu xương người chết từ 500 đến 1200 năm về trước các các

giả đã tách chiết được phân tử ADN nguyên vẹn đảm bảo cho việc nhân bản và nghiên cứu các gen của người tiền sử ( Hagelberg: 1989,

hanni:1995, Kalmar: 2000)

Xác định thân thế Minh chứng cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học

Danh mục tài liệu tham khảo

• Nguyễn Trọng Toàn (2003), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN trong việc xác định

hài cốt liệt sĩ, Viện Pháp Y quân đội.

• Nghiêm Xuân Dũng (2007), “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển kỹ thuật phân tích

ADN phục vụ chẩn đoán hình sự”, Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài cấp

nhà nước KC 04.31.

• PGS.TS Khuất Hữu Thanh (2003) Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen

U8_pFr-n_ljmXCG3ML1TJAEixCPIzh0Xf_tlg-FOWPClPxr5kE7QlRo