cơ sở khoa học và ứng dụng của sinh học phân tử vào xét nghiệm huyết thống

 Kary Mullis mô tả năm 1983 và đoạt giải Nobel Prize hóa học 1993 PCR là phản ứng khuếch đại tạo ra nhiều bản sao 1 đoạn DNA bằng enzim polymerase thực hiện trong ống nghiệm có độ nhạy

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT

THỐNG

Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS Khuất Hữu Thanh

I CƠ SỞ KHOA HỌC SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG.

II CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ VÀO XÉT NGHIỆM HUYẾT THỐNG.

1 PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PHẢN ỨNG PCR.

2 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN.

3 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ.

Trong cơ thể mỗi người chúng ta chứa hàng tỷ tế bào Những tế bào này hầu hết đều có nhân

( trừ một số tế bào không có nhân, ví dụ như tiểu cầu) Nhân của tế bào mang vật liệu di

truyền ( còn được gọi là gen) nằm trên các nhiễm sắc thể (NST).

Theo quy luật di truyền, mỗi đứa trẻ sinh ra đều được thừa hưởng 23 nhiễm sắc thể đơn từ

cha và 23 nhiễm sắc thể đơn từ mẹ, tạo thành 23 cặp nhiễm sắc thể tồn tại theo suốt cuộc đời

Mỗi người mang một dấu vết di truyền riêng biệt

- Xác định DNA được thực hiện bằng việc phân tích DNA của hai cá nhân (có nghi ngờ quan hệ huyết

thống) để xác định thông tin di truyền của họ.

Việc so sánh các thông tin di truyền sẽ xác định được mối quan hệ huyết thống của họ.

Hệ gen là tập hợp toàn bộ các gen

Hệ gen người

- Dựa vào nhiễm sắc thể Y

Đàn ông sẽ truyền nhiễm sắc thể Y cho con trai của họ qua nhiều đời, chính vì vậy xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào nhiễm sắc thể Y theo dòng nội.

- Dựa vào nhiễm sắc thể X

Dựa vào cơ sở khoa học, người nam mang gene XY, người mẹ mang gene XX, khi sinh ra người con gái, một nhiễm sắc thể X sẽ được thừa hưởng từ mẹ và một nhiễm sắc thể X được thừa hưởng từ cha Do người cha cũng truyền nhiễm sắc thể X cho các người con gái nên xét nghiệm dựa vào nhiễm sắc thể X sẽ kết luận được.

- Dựa vào DNA ty thể

DNA ty thể được truyền từ mẹ sang con (cả trai và gái) qua nhiều thế hệ và ít có đột biến.

Các trường hợp xét nghiệm DNA

Các trường hợp xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào NST Y

- Anh – em trai muốn xét nghiệm mối quan hệ huyết thống trong trường hợp không có mẫu xét

nghiệm của người cha đẻ.

- Ông nội – cháu trai trong trường hợp không có mẫu của người cha đẻ.

- Bác trai (chú) – cháu trai trong trường hợp không lấy được mẫu xét nghiệm của người cha đẻ.

- Anh – em trai con bác ruột – chú ruột.

- Những trường hợp cách xa qua nhiều thế hệ như: Ông nội – cha – con trai – cháu trai… đều có thể

cho được kết quả xét nghiệm chính xác.

Xét nghiệm được thực hiện để kiểm tra hai người có cùng cha hay không

s

Các trường hợp tiến hành xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào NST X

• Chị – em gái khác mẹ, kiểm tra DNA có cùng cha hay

không

• Chị – em gái cùng mẹ, kiểm tra DNA có cùng cha hay

không (Trường hợp này khuyến khích người mẹ tham gia

xét nghiệm)

• Bà nội – cháu gái có nghi vấn mối quan hệ huyết thống

Những trường hợp tiến hành xét nghiệm DNA huyết thống dựa vào DNA ty thể

• Dám định hài cốt liệt sĩ

• Mẹ – con gái có nghi vấn về mối quan hệ huyết thống.

• Bà ngoại – cháu gái có mối quan hệ huyết thống hay không.

• Dì – cháu gái, bác gái (chị gái ruột của mẹ) – cháu gái,…

• Xét nghiệm DNA huyết thống anh trai – em gái

• Chị – em gái có nghi vấn cùng mẹ.

• Người anh trai và em gái có cùng người mẹ đẻ nhưng muốn xác định có cùng cha đẻ hay không

Xét nghiệm được thực hiện khi người cha giả định không thể cung cấp mẫu làm xét nghiệm Xét

nghiệm khuyến khích sự tham gia của người mẹ để loại trừ DNA của người mẹ ra khỏi hai con

nhằm nâng cao độ xác suất chính xác của xét nghiệm.

Nguyên lí giám định DNA

• Cáclocut đa hình (1%)

• Cáclocut trên NST thường

• Cáclocut trên NST giới tính

Locut là vị trí của đoạn ADN có chức năng di truyền nhất định ở trên nhiễm sắc thể

10 đoạn lặp đầu tiên của alen 18

1. TCAGC CCA-A GG-AA G

2. ACAGA CCACA GGCAA G

3. GAGGA CCACC GGAAA G

4. GAAGA CCACC GGAAA G

5. GAAGA CCACC GGAAA G

6. GAAGA CCACA GGCAA G

7. GAGGA CCACC GGAAA G

8. GAGGA CCACC GGCAA G

9. GAGGA CCACC GGCAA G

10.GAGGA CCACC AGGAA G

LỰA CHỌN LOCUT CHO XÉT NGHIỆM DNA

BƯỚC 1: LẤY MẪU DNA

BƯỚC 2: TÁCH CHIẾT DNA

BƯỚC 3: NHÂN BỘI KHUẾCH ĐẠI DNA

BƯỚC 4: ĐIỆN DI PHÂN TÍCH DNA

BƯỚC 5: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ DNA

1 PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR.

BƯỚC 1: LẤY MẪU DNA

BƯỚC 2: TÁCH CHIẾT DNA

NGUYÊN LÍ: Tách chiết DNA truyền thống gồm 3 bước

cơ bản sau

Bước 1: Phá màng

Bước 2:Loại bỏ protein

Bước 3: Kết tủa và thu DNA

TÁCH CHIẾT DNA TRUYỀN THỐNG

BƯỚC 1: phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào trong dung dịch chất tẩy ( SDS) và

proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường

đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

BƯỚC 2: Loại bỏ protein

Dùng hỗn hợp phenol/Chloroform làm biến tính protein do đó protein bị kết

tủa khi gặp phenol còn DNA thì không.Khi li tâm phenol/Chloroform nặng sẽ

bị lắng xuống dưới, protein sẽ nằm ở ranh giới giữa nước và phenol, DNA

nằm ở pha nước phía trên, thu pha nước để tiến hành bước tiếp theo.

BƯỚC 3: Kết tủa và thu DNA

Dùng ethanol hoặc Isopropanol để kết tủa DNA trong dung dịch Sau đó li

tâm thu cặn DNA, rửa cặn thu được trong Ethanol 70% một hoặc hai lần để

làm sạch và để cho bay hơi cồn thu được dịch DNA.

TÁCH CHIẾT DNA HIỆN ĐẠI

Bộ KIT áp dụng công nghệ tách bằng từ tính tiên

tiến.Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử

dụng kit tách chiết DNA giúp quy trình tách chiết

được diễn ra tự động, đơn giản hơn Ưu điểm của

phương pháp này là mẫu nhỏ nhưng sản phẩm DNA

thu được là rất lớn

BƯỚC 3: KHUẾCH ĐẠI DNA.

PHẢN ỨNG PCR.

 Kary Mullis mô tả năm 1983 và đoạt giải Nobel Prize hóa học 1993

PCR là phản ứng khuếch đại( tạo ra nhiều bản sao) 1 đoạn DNA bằng enzim polymerase thực hiện trong ống nghiệm có độ nhạy cao mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều

Nguyên Liệu Cho Phản Ứng

1 DNA đích (đoạn DNA quan tâm)

Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp,…

Tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung… ).[C]≤ 1µg (0,1-1µg)

Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường<1kb)

2 Mồi ( primers)

Đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ sung với đoạn DNA đích 5’-ACT TTC ACC AGC GTT TCT GG- 3’

Mồi xuôi, mồi ngược (F, R)

Tm (Metting Temperature): 52-58 ⁰C

Tm= 4* (số C+ số G)+ 2*(số A+ số T) ⁰C

Ta: Tm-5 ⁰C

[C]: 0,1-0,5µM

3 DNA polymerase

Enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợ DNA mới, kỹ thuật đơn giản, đặc hiệu [C]: 1-2,5 units

Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích

-Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt:

Themus aquaticus (taq polymerase), Themus themophilus(rTth), Themus lithoralis( Vent)…

-Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp

như Ampli Taq, Vent(exo)

-Tổng hợp men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai

(proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease)

Như Uitima, Vent, Deep Vent, Pfu

4.dNTP (deoxy ribonucleotid):

dATP, dGTP,dCTP, Dttp[C]: 20-200µM

5.Ion Mg⁺⁺ -cofactor của enzyme

MgCl2: 1,5 mM(0.75-4 mM)

6.Dung dịch đệm

pH 8,3-8,8

CÁC GIAI ĐOẠN CHÍNH CỦA PHẢN ỨNG PCR

- Giai đoạn 1: Biến tính phân tử DNA.

- Giai đoạn 2: Bắt cặp với đoạn mồi.

- Giai đoạn 3: Kéo dài mạch DNA đích.

GIAI ĐOẠN 1: BIẾN TÍNH

- Mục đích: phá vỡ cầu nối Hydrogen

nối hai mạch đơn DNA => tách DNA

về dạng mạch đơn

- Nhiệt độ biến tính thường ở khoảng

92-96 độ C

GIAI ĐOẠN 2: BẮT CẶP MỒI

- Mục đích: các mồi bám vào mạch DNA

đơn

- Sử dụng 2 loại mồi: mồi xuôi, mồi ngược

- Nhiệt độ: hạ xuống 45-55 độ C phụ thuộc

vào nhiệt độ biến tính của mồi

GIAI ĐOẠN 3: KÉO DÀI

- Mục đích: Enzym DNA Polymerase gắn tiếp vào sợi trống

Nó bám và hoạt động dọc theo mạch DNA liên kết các Nucleotid của mạch khuôn và môi trường kéo dài mạch

- Nhiệt độ tối ưu khoảng 72 độ C

BƯỚC 4: ĐIỆN DI PHÂN TÍCH DNA

*Điện di: là sự chuyển động của các phân tử huyền phù hoặc keo ở dạng ion dưới tác của điện trường

*Nguyên lí điện di :trong một điện trường các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng

của chúng Nếu hai phân tử có cùng khối lượng phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn.

*Đối với DNA : dùng gel argarose.

*Mục đích: phát hiện kích thước các đoạn STRs được khuếch đại

NHUỘM MÀU :Chất lượng điện di và kết quả nhân DNA đặc hiệu chỉ có thể thể hiện

rõ trên bản gel với quy trình nhuộm DNA được tối ưu hóa và phương pháp nhuộm thích hợp

Thuốc nhuộm : ethidium bromide, GelRed, GelGreen

Các đoạn DNA sau khi nhuộm sẽ có độ dài ngắn khác nhau thể hiện rõ trên bản gel

có thể quan sát bằng mắt thường và đo đếm , có thể xác định được trình tự DNA.

Phân tích thống kê dựa trên tần số allen của các locus STR trong quần thể để tính được xác suất và suy ra quan hệ huyết thống.

BƯỚC 5: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ DNA

2 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

1. Giải trình tự gen là gì?

Giải trình tự gen là kỹ thuật được thực hiện để xác định trình tự nucleotide của một gen cụ thể Nếu cả một hệ gen được giải trình tự, nó sẽ được gọi là Giải trình tự hệ gen

KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

2 Các kỹ thuật giải trình tự gen

Ban đầu, giải trình tự gen được tiến hành bằng các phương pháp hóa học sử dụng các hóa chất độc hại như Pyridine; kỹ thuật này đã sớm bị ngưng lại vì bản chất độc hại của thí nghiệm

Hiện tại, giải trình tự gen hầu như được thực hiện bởi hai kỹ thuật:

- Kỹ thuật giải trình tự Sanger - tận dụng cách phân tách trình tự bằng axit deoxyribonucleit

- Kỹ thuật giải trình tự Sanger tự động sử dụng thiết bị dò tìm để phát hiện các tín hiệu huỳnh

quang và truyền tải kết quả

2.1 Kỹ thật Sunger.

Lịch sử:

Phương pháp này được Sunger và các cộng sự phát hiện vào năm 1977 Ngày nay phương

pháp này càng được hoàn thiện và đẽ dàng thực hiện tại phòng thí nghiệm

Nguyên tắc:

• Trình tự nucleotide của chuỗi đơn DNA được xác định bằng phương pháp kéo dài chuỗi

bổ sung dưới tác dụng của enzyme

• Sự tổng hợp chuỗi này sẽ kết thúc tại vị trí nucleotide đặc hiệu

• Các đoạn polynucleotide có chiều dài khác nhau được phân tách bằng điện di trên gel

• Đọc trình tự DNA

Frederick Sanger (1918 - 2013)  

2.1 Kỹ thuật Sunger.

Thành phần của phản ứng:

• Một enzyme DNA polymerase: xúc tác phản ứng kéo dài mạch;

• Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởi đầu cho polymerase;

• Trình tự DNA

• 4 loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

• 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị phóng xạ (Các dideoxy nucleotide tương  tự các nucloeotide hoặc deoxy thông thường Tuy nhiên, chúng thiếu nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường)

2.1 Kỹ thuật Sunger.

Bước 1: Chuẩn bị DNA đích.

• Sử dụng kỹ thuật PCR nhân bản đoạn gen cần giải trình tự thành hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau

• Sản phẩm của phản ứng khuếch đại được sử dụng trực tiếp vào các bước giải trình tự gen mà không cần cài vào plasmis để giải trình tự như trước đây

=> Kỹ thuật PCR giúp tối ưu hóa các thành phần của phản ứng chu trình nhiệt giải trình tự gen, từ đó tăng tốc độ giải trình tự gen và mở rộng phạm vi ứng dụng

2.1 Kỹ thuật Sunger.

Bước 2: Thực hiện phản ứng giải trình tự.

Được thực hiện trong 4 tube riêng biệt, mỗi tube chứa:

• DNA đích, sợi đơn

• Đoạn mồi

• Enzyme DNA polymerase

• dNTP ( 4 loại)

• ddNTP (1 loại)

2.1 Kỹ thuật Sunger.

Nguyên lý thực hiện:

Trong hỗn hợp phản ứng bổ sung ddA mỗi khi enzyme DNA polymerase tiếp cận với một vị trí có nucleotit T trên mạch DNA làm khuôn, enzyme này sẽ có hai lựa chọn hoặc là sử dụng dA hoặc ddA để lắp ráp chúng vào mạch DNA đang được tổng hợp.

• Nếu dA được sử dụng => phản ứng kéo dài mạch tiếp tục diễn ra.

• Nếu ddA được sử dụng=> phản ứng sẽ kết thúc tại đây (do các ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí cacbon thứ 3 trên phân tử đường deoxyribose).

Trên đoạn gen cần phân tích có bao nhiêu dT thì sẽ có bấy nhiêu phân đoạn DNA có kích thước khác nhau và đều kết thúc bằng ddA

Tương tự ở các tube còn lại Kết quả được minh họa như hình bên

2.1 Kỹ thuật Sunger.

• Bước 3: Tách sản phẩm trên acrylamid gel.

• Để thực hiện giải trình tự gen người ta thường dùng phương pháp điện

di trên gel acylamid biến tính Với phương pháp đánh dấu mồi hay dNTP bằng các đồng vị phóng xạ 32P hay 35S

• Sau khi điện di người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký

tự ghi, từ đó giải được trình tự DNA

2.1 Kỹ thuật Sunger.

Bước 4: Đọc kết quả và kết luận:

Từ các vạch điện di trên gel của 4 tube, ta có thể xác định được trình tự gen cần phân tích.

=> So sánh trình tự DNA của các mẫu cần so sánh ta kết luận về mối quan hệ huyết thống giữa họ.

2.2 Giải trình tự gen bằng máy tự động.

• Các phòng thí nghiệm hiện nay đều làm phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzyme, nhưng khi làm kỹ thuật giải trình tự lại sử dụng máy tự động thay cho kỹ thuật xạ ký tự ghi trước đây

• Các DNA sản sinh trong ống phản ứng phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm laser

• Cấu tạo của máy tự động gồm hay phần chủ yếu, đó là phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điện di polyscrylamide có thể là một bản gel hay một ống mao quản chứ gel Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quan và một chum tia laser đi qua trước nó

2.2 Giải trình tự gen bằng máy tự động.

2.2 Giải trình tự gen bằng máy tự động.

Nguyên tắc hoạt động của máy là:

• Trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có chùm điện di đi qua vạch laser thì vạch

điện di sẽ phát sáng lên, sự phát sáng này sau đó được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành 1 đỉnh cường độ sáng như biểu đồ

• Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ đo dong của các đỉnh tương

ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA

2.2 Giải trình tự gen bằng máy tự động.

Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP

⇒Nhờ vậy phản ứng giải trình tự chỉ cần thực hiện trên một ống và khi giải trình tự chỉ cần thực hiện điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng như trước đây

⇒ Từ kết quả giải trình tự gen ta suy ra quan hệ huyết thống giữa họ

Các phương pháp lai phân tử

1.Cơ sở của lai phân tử.

Khái niệm về lai phân tử:

+ Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt

độ nóng chảy Tm thì hai mạch sẻ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết H ởhai mạch

+ Sau khi hai mạch tách rời nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ

cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẻ bắt cặp trở lại, hiện tượngnày gọi là sự lai phân tử

Đặc điểm của sự lai phân tử:

+ Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổsung với nhau

+ Các trình tự bổ sung có thể là DNA, RNA dẫn đến sự hình thành các phân

tử DNA – RNA, RNA – RNA hay các phân tử lai DNA – DNA

CÁC KIỂU LAI PHÂN TỬ

2 Phân loại

- Lai trong pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S1 , sắc kí trên hydroxylapatite)

- Lai trên pha rắn ( thường sử dụng hơn) : + Southern blot +Nouthern blot +Western blot +Dot ( slot ) blot

2.1 Lai trong pha lỏng.

• Nguyên tắc:

+Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm

+Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ