Bài giảng kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô sẽ phát triển tăng sinh thànhnhiều tế bào mới... NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN thu từ máu cuống rốn

Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp

tế bào động vật

ThS Phan Lữ Chính Nhân

Khái niệm

Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) là quá trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên (subculture) Sau đó, việc nuôi cấy được gọi là thứ cấp (secondary culture)

Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp

KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH

MÔ SƠ CẤP

Là việc nuôi cấy các mảnh mô

in vitro Trong quá trình nuôi

cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ

phát triển lan ra từ vùng mô

sẽ phát triển tăng sinh thànhnhiều tế bào mới

NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP

(mảnh mô ung thư vú)

Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột

Nuôi cấy chọn lọc tế bào Tua (DC)

từ tủy xương chuột

NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN

PHÙ TẾ BÀO ĐƠN

(thu từ máu cuống rốn)

Quy trình nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy

Xử lí mẫu

Nuôi cấy tế bào đơn:

Tách mô thành tế bào đơn

Nuôi cấy mảnh mô:

Cố định mảnh mô

Thu nhận mẫu

• Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.

Bảo quản mẫu

Xử lí mẫu đối với nuôi cấy huyền phù tế bào đơn

Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau

Biện pháp:

– (1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối

– (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên

Cắt nhuyễn

Ép nhuyễn

Tách bằng màng lọc

Biện pháp

cơ học

Phương pháp cắt nhuyễn

Sử dụng lục sơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mô Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch trong

Phương pháp ép nhuyễn

Ép nhuyễn mô: dùng 2

phiến lame ép chặt mảnh

mô để thu tế bào đơn đối với

những mô có liên kết yếu.

Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym

• Quy trình trypsin ấm

• Quy trình trypsin lạnh

Quy trình trypsin ấm

Ủ trong 4 0 C, 6- 18 giờ Loại bỏ trypsin

ủ ống chứa mẫu mô trong 36,5 0 C,

Thu dịch huyền phù

tế bào, xác định mật

độ, tiến hành nuôi

Tách tế bào bằng phương pháp khác

• Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng

• Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề

mặt

Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng

Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào

Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô

Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi

Mảnh mô nổi

Cố định mảnh mô

Mảnh mô sống

Thành công

Nuôi cấy

(1)ủ trong tủ nuôi cấy, 37 0 C

(2) Thay môi trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào

(1) Ly tâm thu tế bào đơn

(2) Tái huyền phù trong

môi trường nuôi

(3) Cho vào bình nuôi cấy

Sau khi cố định mảnh

mô, bổ sung môi trường nuôi cấy

Cấy chuyền

• Hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ

• Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám dính)

• Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

• Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới

Cấy chuyền tế bào bám dính

Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi

Rửa bề mặt bình nuôi với PBS (free Ca 2+

Mg 2+ )

Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi

Rửa bề mặt bình nuôi với PBS (free Ca 2+

Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung

một lượng môi trường có chứa huyết thanh

Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 3000

vòng/phút

Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung

một lượng môi trường có chứa huyết thanh

Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 3000

Nuôi cấy tế bào trong các flask nuôi cấy hay các spinner có thể được duy trì bằng cách pha loãng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi:

(1) Giữ flask thẳng đứng, dùng pipette huyền phù vài lần để tách cụm các tế bào.

(2) Hoặc tách một lượng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trường

Cấy chuyền tế bào huyền phù

Spinner bioreactor

Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào ADSC

Bước 1: Xử lí sơ bộ mẫu

• Nếu mỡ hút, cho trực tiếp

vào bình dạng phễu

• Nếu dạng khối mỡ nguyên thì phải cắt nhuyễn rồi cho vào bình dạng phễu

100mL

mỡ

Bước 2: Rửa mẫu bằng WB1 (2 lần)

• Thêm 50mL WB1 • Ly tâm 400g trong 5 phút

• Cho toàn bộ 30mL (SE+WB3) vào, ủ ở 370 C, 30 phút

• Lắc đều sau mỗi 5 phút

37 0 CBước 3 : Phân tách mẫu

Trước khi ủ

Sau khi ủ

30 phút

Ly tâm 800g trong 10 phút

Trước ly tâm Sau ly tâm

Phần mỡ vàng óng chiếm > 70%

Loại bỏ dịch nổi và mô mỡ thừa,thu cặn tế bào

Dịch nổi

+ mỡ thừa

Cặn tế bào

Thêm 30mL WB3 vào, lắc đều

Ly tâm 800g 5 phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào

Bước 4: Rửa tế bào với WB3

Thu cặn tế bào sau ly tâm

Sau ly tâm Cặn tế bào

Cặn tế bào

Nuôi cấy

Mục đích khác

Tế bào thu từ mô mỡ được nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh

Ứng dụng trị loét chân do tiểu đường

Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh

Bước 1: xử lí sơ bộ mẫu

Chọn chuột thai khoảng 14 ngày tuổi

Giết chuột thai đột ngột bằng cách kéo giãn cột sống

Sát khuẩn chuột thai

bằng cồn 960C

Mổ khoang bụng, và thu nhận hai nhánh tử cung chứa thai chuột

Ngay lập tức chuyển hai nhánh tử cung vào PBS 5X đã được làm ấm ở 37oC.

Bước 2: thu nhận tế bào

Loại bỏ tử cung, màng phôi và mỡ bám xung quanh thai chuột.

Cho thai chuột vào becher rửa bằngPBS 10X khoảng 3 – 4 phút

Chuyển thai chuột sang đĩa Petri, và thu nhận đầu chuột thai.

Rửa sạch đầu chuột thai bằng PBS 5X khoảng 2 – 3 phút trong becher

Chuyển đầu chuột thai sang đĩa Petri,

mổ hộp sọ nhẹ nhàng để thu nhận não chuột

Cắt nhuyễn mô não và chuyển não chuột vào ống

ly tâm 15ml.

Sau đó, huyền phù hóa liên tục mô cắt nhuyễn bằng Pipet pasteur

Tiến hành lọc dung dịch huyền phù với màng lọc tế bào đơn

Thu nhận dung dịch chứa tế bào đơn và đem li tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút

Đổ bỏ hoàn toàn dịch phía trên, thu cặn dưới đáy Facol chứa tế bào đơn

Nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh

a)

d) c)

b)

Nuôi cấy sơ cấp tế bào tủy răng

Tế bào sơ cấp (nuôi tế bào rời)

d2 d7 d12

d15 d19

d21

Tế bào sơ cấp (nuôi mảnh mô)

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người