Bài giảng thí nghiệm vi sinh vật học (nguyễn thanh hòa)

Đ ỊNH NGHĨA¢Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết cho

T HÍ NGHI ỆM VI SINH VẬT HỌC

GV: Nguyễn Thanh Hoà

1

Thí nghiệm vi sinh vật có thể là trải nghiệm lý thú và vui vẻ, tuy nhiên các bạn cần phải chú ý những nguy cơ tiềm ẩn Một số nội quy trong phòng thí nghiệm các bạn phải chú ý như sau:

¢Giữ gìn trật tự, vệ sinh của phòng Bảo đảm sự vô trùng tuyệt đối khi cấy truyền vi sinh vật

¢Tuyệt đối không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm

¢Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây ra quần áo, sách vở, dụng cụ cá nhân

¢Không tự ý sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm khi chưa được phép và chưa được hướng dẫn

¢Kết thúc thí nghiệm và bài thực hành, các dụng cụ, thiết bị, hoá chất vừa sử dụng xong đều phải được vệ sinh theo đúng quy trình và xếp vào nơi quy định

¢Ghi nhật ký sử dụng thiết bị đầy đủ và theo đúng yêu cầu

¢Khi rời phòng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khoá cửa

2

N HỮNG QUY ĐỊNH VỀ AN TOÀN

¢Khi sử dụng hoá chất cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng hoặc tuân theo

những hướng dẫn của kỹ thuật viên, cán bộ phòng thí nghiệm

¢Sinh viên sử dụng áo blouse khi thực hiện thí nghiệm

¢Những hoá chất độc hại phải được xử lý riêng, tuân theo yêu cầu của

quản lý PTN

¢Chất thải sinh học (vi sinh vật) phải được xử lý nhiệt (thanh trùng

121 o C trong 30 phút) trước khi thải ra ngoài môi trường.

¢Chất thải lỏng cần được phân loại (axit, bazơ, dung môi, dung dịch

có kim loại nặng) và chứa vào các thùng đựng chất thải riêng biệt

¢Chất thải rắn (hoá chất, lọ đựng hoá chất) có tính chất độc hại phải

để trong tủ hút và xử lý theo lịch riêng của nhà trường

¢Các dung môi độc hại, dễ bay hơi phải được tiến hành trong tủ hút

¢Trước khi rời phòng thí nghiệm phải rửa sạch tay

B ÀI 1:

C ÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY V I SINH VẬT

A MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

5

I KHÁI NI ỆM CHUNG

1. Mục đích, ý nghĩa:

— Có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinh vật

— Được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên cứu các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật

2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:

— Thành phần phải có :

- Các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ),

- Các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt, ), một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden, )

- Các yếu tố sinh trưởng:

— Phải cân đối về thành phần để đảm bảo các yêu cầu hóa lý như độ ẩm, độ nhớt, áp suất thẩm thấu, pH thích hợp

— Phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng

3.Cách gọi tên : theo tên tác giả hoặc theo nguồn thức ăn N và C

6

II P HÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG

1 Theo thành phần

— Môi trường tự nhiên

— Môi trường tổng hợp

— Môi trường bán tổng hợp

2 Theo mục đích sử dụng

— Môi trường phổ dụng

— Môi trường riêng biệt

— Môi trường chuẩn đoán phân biệt

3 Theo tính chất lý học

— Môi trường lỏng

— Môi trường đặc

— Môi trường xốp

7

III C ÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG

1. Pha chế :

— Cân đong, pha chế chính xác theo đơn

— Thử pH môi trường

— Đóng miệng bình bằng nút bông rồi bọc giấy để tránh bị ướt lúc thanh trùng

— Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người chuẩn bị

2 Lọc : tách cặn bã, bụi bẩn bằng phương pháp

¢ Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc

¢ Lọc bằng lòng trắng trứng

¢ Dùng phễu lọc nóng

8

III CÁCH LÀM MÔI TR ƯỜNG

3. Phân phối môi trường

¢ Môi trường được phân phối vào bình cầu,

bình tam giác, ống nghiệm, sau thanh

trùng vào ống nghiệm hoặc hộp petri

¢ Thạch nghiêng khoảng 5ml

¢ Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm

¢ Hộp petri tráng đều dầy 3mm

9

III C ÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG

4 Khử trùng môi trường : tất cả môi trường đều phải vô

trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm

mà chọn chế độ thanh trùng.

— Phương pháp Pasteur : đun nóng phân đoạn ở nhiệt độ 60-75oC trong 15 đến 30 phút hay ở

80oC trong thời gian 10-15 phút

— Phương pháp Tinđan : thanh trùng ở nhiệt độ cao liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ

— Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa

áp suất

5. Bảo quản và kiểm tra môi trường

10

B C ÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY V I SINH VẬT

1 Đ ỊNH NGHĨA

¢Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu

nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục

đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt

trong đó và thu nhận các canh trường cần

thiết cho nghiên cứu.

¢Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh

trường vi sinh vật từ môi trường này sang

môi trường khác với mục đích nhận giống

và giữ giống.

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối.

Các dụng cụ cần thiết: que cấy nhọn hoặc

vòng, pipet, que trang,

13

a Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: tiến hành

từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng).

14

b Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng

— Theo hình chữ chi

— Theo hình vòng xoắn

— Theo những đường song song

— Theo một đường thẳng

c Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng

d Cấy trên thạch hộp

— Hình chữ chi trên toàn mặt thạch

— Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp

— Theo các đường song song

— Chấm điểm

15

Phương pháp cấy trên hộp thạch

16

2 C ÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY

Phương pháp cấy trên thạch hộp

17

e Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ

— Dùng pipet lấy một lượng canh trường thả trên mặt thạch rồi dung que trang dàn đều giọt canh trường trên mặt thạch

— Cấy bề sau

ü Giống – ống nghiệm – hộp thạch

ü Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trường

18

Pipet

(raylab.co.nz)

Hộp petri

(wikipedia.org)

Cốc đong

(clarelibrary.ie)

Que cấy

Cốc đong, ống nghiệm Chổi rửa

C ÁC THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM

21

B ÀI 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

22

A PHÂN LẬP VI SINH VẬT

23

¢Canh trường tập trung : là canh trường trong đó một loài (có khi vài loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng.

(môi trường hoặc điều kiện chỉ thích hợp cho một loài vi sinh vật nhất định, còn các loài khác thì không thể hoặc khó phát triển)

24

II C ANH TRƯỜNG THUẦN KHIẾT

¢Canh trường thuần khiết : là canh trường mà tất cả các

vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế bào ban đầu

từ canh trường tập trung.

vPhương pháp pha loãng môi trường lỏng

vPhương pháp gieo cấy trên môi trường đặc

vPhương pháp tách từng tế bào

25

Ví dụ : Pha loãng Pasteur

Cách thực hiện :

1.Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã

vô khuẩn 2.Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất

3.Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai

4.Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn

5.Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất Tế bào này sẽ là tổ tiên cho canh trường thuần khiết

26

¢Nguyên tắc : tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên môi trường

đặc

¢Cách tiến hành :

1 Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng trong các

ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô

trùng

2 Đem vật phẩm đã pha loãng cấy trên môi trường thạch hộp đã vô

khuẩn

3 Nuôi ở điều kiện thích hợp

4 Sau 1 - 2 ngày, quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt,

dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền

lên ống thạch

5 Nuôi ở nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết

¢Phương pháp tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cao

— Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính protease cao

— Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính amylase cao

— Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cellulase cao

— Tuyển chọn chủng VSV có khả năng chịu mặn

— Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng VSV

C P HƯƠNG PHÁP TÁCH TỪNG TẾ BÀO

¢Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương

đối lớn (nấm men, bào tử nấm mốc)

¢Cách tiến hành : có 2 cách

1 Tách từng giọt chỉ chứa một

tế bào có kiểm tra bằng kính

hiển vi

2 Tách từng tế bào nhờ dụng

cụ vi thao tác

(micromanipulateur)

Micromanipulateur

(www.lavallab.com) 29

T ÁCH TỪNG GIỌT CHỈ CHỨA MỘT TẾ BÀO CÓ KIỂM TRA BẰNG KÍNH HIỂN VI

1 Pha loãng Pasteur ( đến mức mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai

tế bào vi sinh vật)

2 Dùng que cấy nhọn chấm từng giọt nhỏ canh trường đã pha loãng lên lá kính vô khuẩn Chấm thành ba bốn hàng và các giọt cách xa nhau vừa phải để dễ quan sát.

3 Nhanh chóng xoay lá kính cho các giọt xuống dưới rồi đặt lên phiến kính lõm, bôi vazơlin quanh mép lá kính, giữ không cho các giọt bị khô

4 Quan sát dưới kính hiển vi và đánh dấu những giọt chỉ có một

tế bào

5 Đặt các phiến kính vào hộp petri có lót bông hoặc giấy lọc tẩm nước, đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp

30

1 Pha loãng vật phẩm nghiên cứu, lấy 1 giọt cho

vào ống thạch, lắc đều

2 Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói

trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín

đầu nhỏ của pipet

3 Nuôi trong tủ ấm 1 – 2 ngày

4 Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có

khuẩn lạc riêng biệt cho vào môi trường nuôi

cấy thích hợp

III Phân lập vi sinh vật yếm khí

1 Dùng pipet Pasteur

31

III P HÂN LẬP VI SINH VẬT YẾM KHÍ

2 DÙNG HỘP PETRI LỘN NGƯỢC

nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng paraphin bôi xung quanh mép hộp (Hộp petri

đã vô trùng và đặt lộn ngược trước)

thạch có khuẩn lạc đem cấy vào môi trường thích hợp

32

B ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

33

I Đ ỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP

¢Định nghĩa: là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu

¢Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng

¢Nhược điểm : Kém chính xác vì khi đếm như vậy ta đếm cả những tế bào

đã chết trước lúc làm tiêu bản.

¢Các phương pháp định lượng trực tiếp :

1. Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu

2. Phương pháp Brit

3. Phương pháp Vinogratxki - Sungina

34

¢Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi

sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như

nấm men, bào tử nấm mốc

Ô màu Kích cỡ Diện tích

Đỏ 1 x 1 mm 1 mm 2

Xanh lục 0.25 x 0.25 mm 0.0625 mm 2

Vàng 0.20 x 0.20 mm 0.04 mm 2

Da trời 0.05 x 0.05 mm 0.0025 mm 2

Buồng đếm hồng cầu

(Hemocytometer) (wikipedia.org)

P HƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

¢Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường

¢Dùng bông tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính

¢Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu)

¢Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau tức là 80 ô vuông nhỏ Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi ô ở vị trí khác nhau) Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô

a.1000.f h.S

trong đó: alà số tế bào trung bình có trong 1 ô

flà hệ số pha loãng của canh trường

hlà bề sâu của lưới đếm

Slà diện tích một ô

1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm3

P HƯƠNG PHÁP B RIT

¢Phạm vi sử dụng : dùng để định lượng vi sinh vật có

trong sữa hay một số vật phẩm lỏng

¢Cách tiến hành:

1) Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng

khi quan sát

2) Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml vật

phẩm nghiên cứu Cho dàn đều lên phiến kính sạch với

diện tích nhất định (2 - 4 cm2).

3) Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen.

4) Để khô và quan sát dưới kính hiển vi và đếm

37

P HƯƠNG PHÁP V INOGRATXKI - S UNGINA

¢Phạm vi sử dụng: dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật phẩm đặc, rắn

¢Cách tiến hành:

1) Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh rồi chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch Lắc đều trong 5 phút và

để yên trong 1 - 2 giây

2) Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một diện tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm2)

3) Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớp thạch mỏng, loãng (0,1%) Lại để khô và cố định bằng cồn tuyệt đối trong 5 phút

4) Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ Trong quá trình nhuộm phải theo dõi để thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi

5) Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu Cách đếm và tính kết quả gần giống như phương pháp Brit

38

II Đ ỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP

¢Định nghĩa: là phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo cấy một lượng

nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức ăn thích hợp, nuôi trong 36 - 48 giờ,

sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu

¢Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn

¢Nhược điểm:

— Tốn thời gian, công sức

— Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc

chênh nhau 10 lần

— Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng

đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành

một khuẩn lạc Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật

có trong vật phẩm nghiên cứu

— Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng

phát triển

39

P HƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC PHÁT TRIỂN TRÊN

MÔI TRƯỜNG THẠCH

¢Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả

¢Cách tiến hành:

1) Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng : pha loãng Pasteur ( tỷ lệ 1:10) 2) Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng

lỏng bằng cách: Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả vào bình tam giác dung tích 250 ml đã chứa sẵn 99 ml nước vô trùng Lắc đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trên.

3) Gieo cấy một lượng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm

pha loãng cuối cùng lên hộp petri đã chứa sẵn môi trường vô trùng

4) Nuôi ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc

5) Đọc kết quả

40

Đ ỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ

¢Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100

cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương

với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí

¢Cách tiến hành:

1)Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định

nghiên cứu

2)Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp

và để vào tủ ấm

3)Sau 24 – 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc

¢Tính toán: đo đường kính hộp petri để tính điện tích rồi suy ra lượng

vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m3không khí theo ước tính của

Omelianxki.

41

B ÀI 3 : KÍNH HIỂN VI

CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT

SỐNG QUAN SÁT NẤM MEN

42

A KÍNH HIỂN VI

Cấu tạo kính hiển vi

Cách sử dụng :

1 Dùng kính tụ quang điều chỉnh ánh sáng

2 Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính

3 Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa

Đặt tiêu bản lên khay kính và mắt nhìn bên ngoài, điều chỉnh tiêu bản để chọn được vùng định quan sát

4 Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính

5 Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng, khi thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét

C ÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

1 Bảo quản sau khi sử dụng kính

¢ Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ

¢ Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau

nhẹ đầu vật kính cho thật sạch

¢ Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu

¢ Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục Xếp khăn lại, đặt lên khay kính

rồi hạ vật kính chạm sát khăn

¢ Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon Chuyển kính vào tủ lớn có hệ

thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn

2 Bảo quản thông thường và định kỳ

¢ Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo

¢ Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính

¢ Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông

¢ Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính

¢ Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay

cầm thân kính, một tay đỡ đế kính

45

B CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT

VI SINH VẬT SỐNG

46

Hình 1:

Cách lấy giống vi sinh vật

47

I T IÊU BẢN GIỌT ÉP

1 Phạm vi sử dụng : cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật

2 Cách làm :

48