LIỆU PHÁP GEN

1 Tiêm DNA trần vào khối u bằng syringe2 Chuyển DNA bằng liposome -- DNA được phủ các hạt đạn vàng bắn gen, không dùng trong trường hợp ung thư 3 Các phương tiện sinh học vector như VR

GENE THERAPY

LIỆU PHÁP GEN (LPG)

 LPG là gì?

 LPG được dùng làm gì?

 Làm sao sử dụng LPG? Hay sử dụng LPG như thế nào?

 Việc ứng dụng LPG: thành tựu và thất bại?

 Thuận lợi và hạn chế của LPG?

 …

LIỆU PHÁP GEN (LPG)

 Sửa chữa gen bệnh

 Thay gen bệnh bằng gen lành

 Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh

 Tiêu diệt tế bào (TB) bệnh

LPG - CHUYỂN GEN LÀNH VÀO MÔ BỆNH

Bệnh máu khó đông do thiếu/hư YTĐM số IX ở chó

BT: máu đông trong 8-10 phút

Bệnh: máu đông trong 50-60 phút

TS Kenneth Brinkhous (ĐH North Carolina)

QT CG 1 giờ,

Biểu hiện trong 15 tháng,

Đông máu trong 20 phút

VLDT cần chuyển

Phương

pháp

Chiến lược chuyển

3 VLDT cần chuyển

 Gen lành

 Gen gây chết

 Antisense nucleic acid

Một bộ bao gồm:

Gen Promoter mạnh Gen chọn lọc Plasmid/ VR vector

2 Phương pháp CG

 Vector virus (VR)

 Vector không VR

 PP vật lí: vi tiêm, bắn gen

Ex vivo  In vivo In vivo

CÁC CHIẾN LƯỢC CG

1 VLDT được truyền trực tiếp vào cơ thể bệnh nhân;

2 Khả năng kiểm soát thấp; ít thao tác;

3 Chỉ dành cho những mô không phát

triển in vitro; hoặc những tế bào nuôi in

vitro không thể chuyển trở lại vào cơ

thể

1 Đầu tiên, VLDT được chuyển vào tế

bào được nuôi cấy in vitro

2 Quá trình được kiểm soát ; tế bào CG

được chọn lọc và nuôi cấy tăng sinh;

nhiều thao tác hơn

3 TB thường của tự thân BN; được

ghép trở lại vào cơ thể BN

CÁC PHƯƠNG PHÁP CG

1 Tiêm DNA trần vào khối u bằng syringe

2 Chuyển DNA bằng liposome

DNA được phủ các hạt đạn vàng (bắn gen),

không dùng trong trường hợp ung thư

3 Các phương tiện sinh học (vector) như VR và VK

VR được biến đổi DT sao cho không nhân lên khi ở bên trong cơ thể

chủ

và là phương tiện chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay

CÁC PHƯƠNG PHÁP CG

Các vector chuyển gen

• Vector = tác nhân mang và chuyển vật liệu di truyền vào tế bào

• Vector có thể là

• viral (retroviral, lentiviral, adenoviral, …)

• non-viral (plasmid DNA, liposomes, …)

• Vector & và phương pháp chuyển

• Nâng cao sự biểu hiện gen phù hợp với nhu cầu

• Nâng cao hiệu quả chuyển gen

• Hướng tiếp cận mới

• Kĩ thuật “chỉnh sửa (editing)” gen Sangamo (zinc finger nucleases)

Tiêm DNA trần

LPG DNA trần

Dạng vòng ổn định hơn dạng plasmid không vòng

Chuyển vào trong mạch

Khởi phát PUMD kháng lại

KN khối u không nhận diện

được

Ứng dụng vaccine DNA trần ở bệnh truyền nhiễm

Vaccin DNA

Vài epitope có bản chất peptid

Được nhận diện bởi TB T

Thành phần MD quan trọng của KN sốt rét

protein có tên là thrombospondin related adhesion protein (TRAP).

Vaccin DNA mã hóa cho

phần chèn

có thể nhận diện miễn dịch

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy_DMD)

Chuyển minigen dystrophin ở chuột LDC

Gen: 2.4 Mb, mRNA: 14 kb (lớn quá, không thể dùng vector)

Kiểu hình Becker: chuyển không hoàn thiện trình tự

Xét nghiệm

mô cơ

Sự biểu hiện dystrophin 1 đến 10% ở các sợi cơ của nhóm 1 và 2, 100%

ở nhóm 3

Không PUMD, không tác dụng phụ

Chuyển gen dystrophin ở người

 Cải tiến LPG dùng DNA trần (plasmid

hay non-plasmid)

 Nâng cao tỉ lệ chuyển thành công

 Màng lipid  hiệu quả >>>: tránh thoái

biến DNA

Thuốc trị liệu

Cationic liposome

Các giọt lipid tích điện (+) có thể tương tác với các DNA tích điện (-), bao phủ và chuyển DNA vào TB

Đầu lipid tích điện +

Lipofectin, lipofectamine, lipofectase….

Liposome nhanh chóng bị “xóa sổ” khỏi dòng máu

và bị thu nạp bởi các macrophage ở gan

Các phối tử bề mặt của liposome làm giảm sự thoái biến

(monosialoganglioside hay polyoxyethylene)

Trouble shooting

Liposome

Liposome biến đổihydrophilic polyoxyethylene

Piedmont Máu-gan

Da

Liposome biến đổi

Ruột - Đường uống

Immunoliposome – tác kích chủ động

 Kháng thể của myosin nội bào hướng liposome đến

vùng tim bị nhồi máu

 Kháng thể kháng các phân tử đặc hiệu khối u hướng

liposome đến vị trí khối u

Liposome – phương tiện LPG trong điều trị UT

• Rẻ hơn dùng VR

• Không gây PUMD

• Đặc biệt phù hợp trong trường hợp

chuyển vào mô phổi (bệnh xơ nang)

• Số lượng plasmid DNA cần nhiều

hơn 100 – 1000 lần so với vector

VR

Hiệu quả chuyển gen bằng Liposome

Ω Tháng 1/1995: CFTR-liposome đưa vào cơ thể BN đường mũi

Ω 12 BN, giảm nhẹ ở 20% BN

Ω Hiệu quả tối đa vào ngày thứ 3, giảm nhanh ở ngày 7

Ω Không PUMD

Xơ nang (Cystic fibrosis_CF)

Bệnh DT gây chết ở trẻ sơ sinh (1/2000) Ít gặp ở người Châu Á và Châu Phi

Hư hỏng gen CFTR

(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

rối loạn dẫn truyền Cl- và Na+

Ở TB biểu mô ở nhiều cơ quan

(tăng hấp thu Na+).

Tuyến mồ hôi

(tiết nhiều muối) Tổn thương tụy

(đái tháo đường)

Phổi sx nhiều chất nhầy

( dễ nhiễm khuẩn, ho, tử vong)

Đường tiêu hóa

(táo bón)

Bình thường CF

Phế nang

Xơ nang (Cystic fibrosis_CF)

Pseudomonas aeruginosa >>  neutrophil >>  xơ hóa, tổn thương

Tụy BT CF

ᴥ Các enzyme tụy không thể giải phóng khỏi tuyến  tổn thương

ᴥ Giảm tiết insulin

ᴥ Giảm dung nạp đường  ĐTĐ

Xơ nang (Cystic fibrosis_CF)

Gen CFTR (NST số 7)

27 exons, 1480 aa

ATP binding domain

Retrovirus (RV)

Adenovirus (AV)

Adeno-associated virus

Herpes simplex virus

• Bộ gen RNA, tạo các bản sao DNA mạch đôi, có thể sát nhập vào bộ gen chủ

• HIV, MoMuLV, Rous sarcoma virus

VR mạch đôi DNA gây bệnh nhiễm khuẩn mắt, ruột, đường hô hấp ở người.

Gây cảm lạnh

VR mạch đơn DNA có thể chèn VLDT của chúng vào vị trí chuyên biệt ở NST số 19

VR mạch đôi DNA nhiễm vào TB thần kinh

Vector virus

Chiến lược chung tạo vector virus

Retroviral vector

ɤ Hiệu quả xâm nhiễm cao; là vector thường dùng để điều trị các bệnh phổ biến bằng LPG

ɤ Không thể xâm nhập vào màng nhân  chỉ xâm nhiễm khi TB đang phân chia  phù hợp cho LP điều trị UT

ɤ Gắn chèn vào BG  bền vững và khả năng gây UT

Moloney murine leukaemia virus (Mo-MLV)

₰ Có thể nhiễm vào TB người và chuột;

₰ Chỉ nhân lên trong TB đóng gói;

₰ Vector không hoàn chỉnh  không lây lan;

₰ Đoạn gen < 7.5 kb  không đủ trong một số TH

LPG sử dụng RV vector trong điều trị lâm sàng

Suy giảm MD trầm trọng phối hợp

Severe Combined Immunodoficiency (SCID):

ADA-SCID và X-linked SCID

 Nhiễm khuẩn thường xuyên và điều trị KS không hiệu quả

 Không lớn, thường bị áp xe ở da và các cơ quan

 Nhược lympho bào (lymphopenia) (<200)

 Phân loại

 Đột biến ADA (Adenosine deaminase): SCID liên kết NST 20: 25% trường hợp

 Đột biến thụ thể C-gamma của IL-7: SCID liên kết NST X

 70 nguyên nhân khác (không phải đơn gen)

LPG sử dụng RV vector trong điều trị SCID

 “Bubble”

 Ghép tủy

 LP thay thế enzyme PEG-ADA (ADAGEN): tác dụng tạm thời, đắt, thiếu

máu tán huyết, leukemia

 LPG

• Cuối 1970s: protein ADA được mô tả

• 1983: công bố trình tự gen ADA

• 1990: thử nghiệm LPG đầu tiên trên người sử dụng vector chuyển MoMLV được FDA chấp thuận

• Ashanti DeSilva, 4 tuổi

• Tế bào T được CG (MoMLV-ADA), tăng sinh (IL-2) và trưởng thành in vitro

• Điều trị lặp lại 6 – 12 tháng theo vòng đời của TB T

• Không rõ kết quả của LPG do điều trị phối hợp ADA-PEG

LPG sử dụng RV vector trong điều trị SCID-ADA

Donald Kohn chẩn đoán 3 thai nhi ADA-SCID

Khi giảm PEG-ADA, tỉ lệ TB T tăng lên 1 – 10%, gấp 100 –

1000 lần

Không lâu sau khi truyền TB máu dây rốn, 0.01 – 0.1%

TB T ở nhũ nhi biểu hiện gen chuyển

Thu nhận máu dây rốn

LPG sử dụng RV vector và TBG máu dây rốn trong điều

trị SCID-ADA

Thử nghiệm LPG thành công vào 2000; 8/10 BN bình phục

3.5 năm sau khi ghép TBG CG

- Không cần sống trong bong bóng khí

- Có số lượng TB T bình thường (cả CD4 vàCD8)

- Có phản ứng với miễn dịch trẻ nhỏ (uốnván, bạch hầu, bại liệt)

- Kháng thể sx ra đủ  không cần truyềnkháng thể định kì

Trầm trọng hơn SCID-ADA, vì không có TB B, T và NK

LPG sử dụng RV vector trong điều trị X-linked SCID

2/15 trường hợp mắc leukemia do gen trị liệu chèn vào

gần vùng LMO2 proto-oncogene (LMO2: vai trò trong tạo

mạch)

 Là RV có thể xâm nhiễm TB đang phân chia hoặc

không đang phân chia vì chúng có thể đi qua màng nhân còn nguyên vẹn;

 Có thể nhiễm vào các tế bào không phân chia hoặc

đã biệt hóa như TB TK, đại thực bào, Tb cơ, gan;

 Đại diện: HIV-1 (nhiễm TB Th) trong điều trị AIDS

• 12 sợi “anten” cho VR bám dính

• Là kí chủ thường xuyên với cơ thể người, đãđược sử dụng làm vaccine, quen thuộc với hệthống miễn dịch ở người

• Không gắn chèn vào BG chủ nhưng biểu hiện

ổn định khi TB không phân chia;

• Tính KN mạnh  gây ĐUMD mạnh

Jesse Gelsinger, 18 tuổi (Pennsylvania, 1999) Thiếu hụt enzyme Ornithine transcarbamylase

chết sau 4 ngày LPG Có thể do vector adenovirus gây các phản ứng miễn dịch trầm trọng

ADENOVIRUS

Gen mã hóa ornithine transcarbamylase (OTC)

Chứng thiếu hụt OTC (liên kết NST X)

OTC là enzyme chủ chốt trong chu trình biến dưỡng nitơ trong cơ thể

Hyperammonemia

Thiếu OTC

Nôn mửa, hôn mê

Ammonia là chất độc TK Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS

Jesse Gelsinger, 18 tuổi (Pennsylvania, 1999) Thiếu hụt enzyme Ornithine transcarbamylase

chết sau 4 ngày LPG

Chứng xơ vữa động mạch (Atherosclerosis) : sự tạo mạch cục bộ

Mục tiêu: cải thiện dòng chảy ở chi hay tim thiếu máu bằng cách kích thích sự tạo mạch bổ sung

AdV chuyển VEGF-121 ở BN tắt nghẽn động mạch chi

Tắt nghẽn

Liều đơn Ad-VEGF tiêm vào 20 vùng cơ chi dưới

University of Michigan Health System

Ứng dụng LPG sử dụng ADENOVIRUS

Một số nhược điểm của

Adeno-associated virus (AAV)

không kích thích viêm ở cơ thể chủ

không tạo kháng thể tự kháng nó

không xâm nhiễm TB không phân chia

chèn vào một điểm trên BG của chủ (NST 19 ở người)

Chuột mắc ĐTĐ do hóa chất hoặc DT

Intronless insulin gene

Glucose -sensitive

promoter AAV

Trình tự tin hiệu tiết enhancer

Kiểm soát đường huyết và duy trì đến 8 tháng

Tiêm vào tĩnh mạch cửa gan

LPG sử dụng AAV làm vector trong điều trị ĐTĐ ở

chuột

Gen tự sát – LPG ung thư

(113 TN ở Mỹ về LPMD UT) 54% TN là LPMD cho khối u ác tính

Chuyển gen ức chế khối u TP53

LPG tự sát

Gen tự sát – LPG ung thư

Gen tự sát Tiền thuốc Thuốc có hoạt tính

Viral thymidine kinase Ganciclovir Ganciclovir triphosphate

Cytosine deaminase 5-fluorocytosine 5-fluorouracil

Linamarase Amygdalin cyanide

nitroreductase CB 1954 nitrobenzamidine

Examples of suicide gene/prodrug combinations and the active

cytotoxic drug selectively produced in the target cell.

Linamarase = beta-glucosidase, chuyển cơ chất cyanogenic glucoside,

linamarin, thành glucose và cyanide

Ion cyanide khuếch tán tự do xuyên màng tế bào.

Gen tự sát – LPG ung thư

GÂY CHẾT TẾ BÀO BỆNH

VÍ DỤ VỀ LIỆU PHÁP GENE TRONG UNG THƯ

TUYẾN GIÁP

 dn-RET (dominant negative)- oncogene với “đột biến thêm chức năng” sẽ bất hoạt oncoprotein bình thường

proto- PTP (Protein Tyrosine Phosphatase) điều hòa biểu hiện của TNF (Tumor Necrosis Factor)

 Gadd45 kiểm tra chu trình tế bào, sửa sai DNA, apoptosis

 HMGI(Y) (High Mobility Group) : Protein

“nonhistone” trong nhân ở ĐV có vú có tính linh động điện di cao, biến đổi cấu trúc DNA và NSC làm ảnh hưởng đến sự sao chép, phiên mã, tái tổ hợp,…, liên quan đến sự hình thành khối u và di căn

 ONYX-015 là 1 adenovirus nhân bản trong tế bào không biểu hiện p53 (protein sửa sai)

 NIS (Sodium Iodide Symporter) + hóa trị 131 I

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

LPG CHO TỪNG LOẠI BỆNH

• Bổ sung (Gene transplantation)

(dành cho BN bị mất gen)

• Sửa chữa (Gene correction )

(sửa các đột biến chuyên biệt ở gen mục tiêu)

• Tăng cường (Gene augmentation)

(nâng cao sự biểu hiện gen quan tâm)

• Giết trúng đích (Targeted killing): chuyển gen hủy diệt (tự sát) vào tế bào chuyên biệt

• Loại bỏ (Gene ablation) – ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu

SỬA CHỮA SAI HỎNG TRÊN GENE BỆNH

• Thông qua tái tổ hợp đồng dạng

Ưu điểm : tái lập hoàn toàn tình trạng bình thường

Nhược điểm : rất khó thực hiện thành công

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

BỔ SUNG GENE LÀNH THAY CHO GENE BỆNH

Trong trường hợp gene bệnh không biểu hiện, gene lành được đưa vào tế bào và biểu hiện để tái lập kiểu hình bình thường

Ưu điểm : dễ thực hiện

Nhược điểm :

Biểu hiện của gene không được điều hòa như trong điều kiện bình

thường

Chỉ sử dụng khi gene bệnh là lặn

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

ỨC CHẾ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE BỆNH

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Oligonucleotide ngắn liên kết với mRNA (mã hóa cho protein bệnh)  ức chế sự dịch mã của mRNA đó

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

TRIPLEX FORMING OLIGONUCLEOTIDES (TFO)

TFOs liên kết với một trình tự DNA mạch đôi thông qua liên kết hydrogen Hoogsteen

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Sửa chữa đột biến trên mRNA thông qua Ribozyme gồm 3 vùng : mã hóa (coding domain), “cắt nối trans” (trans splicing domain) và vùng liên kết với pre-mRNA (binding domain)

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007

Các bệnh có thể ứng dụng LPG

Disease Defect Target cell

Hemophilia Factor VIII, Factor IX deficiency Liver, muscle, fibrob

Cystic fibrosis Loss of CFTR gene Airspaces in the lungHemoglobulinpathies  or  globulin gene Bone-marrow cells

1-antitrypsin deficiency 1-antitrypsin Lung or liver cells

Cancer Many causes Many cell types

Neurological diseases Parkinson’s, Alzheimers Direct injection into

the brain

Cardiovascular Restenosis, arteriosclerosis Vascular endotheliumInfectious diseases AIDS, hepatitis B T cells, macrophages, Liver cirrhosis Fibrogenesis Hepatocyte growth factorAutoimmune disease Lupus, diabetes MHC, 2-microglobulin

FDA chưa phê chuẩn bất kì sản phẩm về LPG ứng dụng trên người

Bốn trở ngại lớn của LPG:

2) Phản ứng miễn dịch làm giảm hiệu quả của LPG và sự lặp lại LPG

không ý nghĩa

3) Rủi ro với vector virus: Độc tính, phản ứng miễn dịch và viêm, khả

năng gây bệnh trở lại

4) Rối loạn đa gen phổ biến như bệnh tim, Alzheimer, viêm khớp, đái

tháo đường do sự phối hợp tác động của nhiều gen

1) Trạng thái tự nhiên ngắn: hiệu quả ngắn