Chương 10 liệu pháp gene

Khái niệm Liệu pháp geneỨng dụng Ứng dụng Sửa chữa khiếm khuyết di truyềnSửa chữa khiếm khuyết di truyền Chữa trị bệnh Chữa trị bệnh Ức chế sự biểu hiện của gene bệnh Ức chế sự biểu hiện

Trang 1

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Khoa Công nghệ sinh học

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Khoa Công nghệ sinh học

Trang 3

I Giới thiệu I.1 Khái niệm

Tiếng Anh Tiếng Anh

3

Trang 4

I Giới thiệu I.1 Khái niệm Tiến hành

Tiến hành trên mô

hình động vật

Thử nghiệm lâm sàng, điều trị bệnh

Thuốc phân tử

Nguồn: https://www.rndsystems.com/resources/artices/gdnf-novel-treatment-parkinson%E2%80%99s-disease

GDNF Delivery Methods Investigated in Animal Models of Parkinson's Disease (PD) GDNF Delivery Methods Investigated in Animal Models of Parkinson's Disease (PD)

Trang 5

I Giới thiệu I.1 Khái niệm Liệu pháp gene

Ứng dụng Ứng dụng

Sửa chữa khiếm khuyết di truyềnSửa chữa khiếm khuyết di truyền

Chữa trị bệnh

Ức chế sự biểu hiện của gene bệnh

kỹ thuật thao tác trên gene

Sửa chữa (không thay thế) các gene hỏng bằng các

kỹ thuật thao tác trên gene

Tiêu diệt tế bào bệnh bằng

gene tự sát hay gene sản xuất chất độc

Tiêu diệt tế bào bệnh bằng

gene tự sát hay gene sản xuất chất độc

ngoại lai

Chuyển gene vào tế bào chức

năng

→Tác động lên hệ miễn dịch , tấn công tác nhân gây bệnh

Trang 6

Trang 7

7

Trang 8

I Giới thiệu I.2 Tế bào mục tiêu

Tế bào sinh dưỡng Tế bào sinh dục

Vai trò

Sinh trưởng, phát triển của cơ thể Sinh sản, duy trì nòi giống

Mục đích sử dụng Làm mục tiêu chuyển gene Biến đổi hệ gene của cá thể được sinh sản từ

những tế bào sinh dục đó

Loại tế bào thường

dùng

Tế bào lympho(lymphocyte)

- Tinh trùng

- TrứngNguyên bào sợi

(fibroblast)

Tế bào gốc(Stem cells)

Tế bào biểu bì(keratinocyte)

…

Trang 9

Tế bào sinh dưỡng

Liệu pháp gene soma

(Somatic Gene Therapy)

Tiến hành đầu tiên năm 1990

Ashanti Desilva

Suy giảm miễn dịch (SCID) do khiếm

khuyết gene adenosine deaminase (ADA)

9

Trang 10

Liệu pháp gene tế bào mầm

(Germline Gene Therapy)

Tế bào sinh dục

Tiến hành đầu tiên năm 2001

30 trẻ chào đời bằng công nghệ chuyển chất

nhân (ooplasm)

Trang 11

I Giới thiệu I.3 Chiến lược liệu pháp gene

Thu nhận những tế bào từ cơ thể

→ Chuyển gene liệu pháp

→ Cấy lại cơ thể

11

Trang 12

I Giới thiệu I.3 Chiến lược liệu

pháp gene I.3.1 Liệu pháp in vivo

12

Đưa trực tiếp gene liệu pháp vào trong tế bào của

môriêng biệt trên cá thể bị bệnh

Trang 13

I Giới thiệu I.3 Chiến lược liệu

pháp gene I.3.1 Liệu pháp ex vivo

13

Trang 14

I Giới thiệu I.4 Lịch sử nghiên cứu

• Ý tưởng: cắt bỏ, sửa chữa gene hỏng, thay thế cấy gene lành vào cơ thể

• Thuật ngữ “phẫu thuật gene” (gene surgery): liệu pháp chữa trị các bệnh di truyền (do gene hỏng

gây ra)

• Ý tưởng: cắt bỏ, sửa chữa gene hỏng, thay thế cấy gene lành vào cơ thể

• Nhóm nhà khoa học thuộc Đại học Y Bayler ở Houston, Texa: thử nghiệm liệu pháp gene chữa bệnh

Lesch – Nyhan (khiếm khuyết thần kinh hiếm gặp)

• Tiến hành: tiêm gene mã hóa enzyme đặc biệt vào trong một nhóm tế bào (giả thiết gene này sẽ sửa

chữa các sai hỏng gây nên bệnh)

• Nhóm nhà khoa học thuộc Đại học Y Bayler ở Houston, Texa: thử nghiệm liệu pháp gene chữa bệnh

Lesch – Nyhan (khiếm khuyết thần kinh hiếm gặp)

• Tiến hành: tiêm gene mã hóa enzyme đặc biệt vào trong một nhóm tế bào (giả thiết gene này sẽ sửa

chữa các sai hỏng gây nên bệnh)

• Jesse Gelsinger bị OTC (bệnh do khiếm khuyết gene sản xuất enzyme ornithine transcarboxylase) đã

chết do chữa trị bằng liệu pháp gene

• Lý do: sự đáp ứng miễn dịch trầm trọng với vật mang gene – adenoviruse, cơ thể coi vector này là

kháng nguyên mạnh

• Jesse Gelsinger bị OTC (bệnh do khiếm khuyết gene sản xuất enzyme ornithine transcarboxylase) đã

chết do chữa trị bằng liệu pháp gene

• Lý do: sự đáp ứng miễn dịch trầm trọng với vật mang gene – adenoviruse, cơ thể coi vector này là

kháng nguyên mạnh

Trang 15

I Giới thiệu I.4 Lịch sử nghiên cứu

2000

• Bác sĩ French chữa thành công cho 10 trẻ mắc bệnh suy giảm miễn dịch trầm trọng kết hợp NST X (X-SCID)

→ Hội chứng Buble Boy

• 2/10 trẻ mắc thêm bệnh Leukemia sau trị liệu

• Bác sĩ French chữa thành công cho 10 trẻ mắc bệnh suy giảm miễn dịch trầm trọng kết hợp NST X (X-SCID)

→ Hội chứng Buble Boy

• 2/10 trẻ mắc thêm bệnh Leukemia sau trị liệu

15

Hội chứng Bubble Boy

 Đột biến di truyền hiếm gặp

 Cơ thể không có khả năng sản xuất các tế bào T và B

Trang 16

I.4 Lịch sử nghiên cứu Ý nghĩa liệu pháp gene

Đơn giản

Chỉ có số ít sản phầm được nghiên cứu, phát triển

Tích cực

Hạn chế

Điều trị nhiều bệnh

Suy thoái cơ

Các gene gây bệnh được xác định khá ít

Ung thưHIV

Nhiều bệnh di truyền hiếm gặp

→Phát triển thuốc không mang lợi ích kinh tế

Nhiều bệnh di truyền hiếm gặp

→Phát triển thuốc không mang lợi ích kinh tế

Trang 17

Nguyên lý

Tiêu chí chọn vectorPhân loại

II Vector dùng trong liệu pháp gene

http://www.nature.com/nbt/journal/v29/n2/full/nbt.1769.html?message-global=remove

Wiley and Sons)

Breakdown of vectors used in gene therapy trials.

17

Trang 18

Chuyển một gene mã hóa cho protein chức

năng hay một thực thể sinh học nào đó vào

tế bào

Chuyển một gene mã hóa cho protein chức

năng hay một thực thể sinh học nào đó vào

Trang 19

Tế bào mục tiêu và những

đặc tính của nó

(khả năng tải nạp ex vivo,

dung hợp vào bệnh nhân)

Thời gian biểu hiện cần thiết

Kích thước vật liệu di tr uyền cần chu

yển

Tiêu chí chọn vector

19

Trang 20

II Vector dùng trong liệu pháp gene Phân loại vector

Có bản chất virus Không có bản chất virus

Trang 21

Thiếu khả năng sao chép độc lập → Cần tế bào đóng gói.

Thiếu khả năng sao chép độc lập → Cần tế bào đóng gói.

Gene sớm bị cắt bỏ

→Thay bằng trình tự promoter, gene mong muốn

Gene sớm bị cắt bỏ

→Thay bằng trình tự promoter, gene mong muốn

Có sự biểu hiện của receptor bề mặt virus hoang dại

→Virus hoang dại có khả năng nhiễm được vào tế bào nào đó thì các tiểu phần vector virus

cũng dễ nhiễm vào các tế bào đó

Có sự biểu hiện của receptor bề mặt virus hoang dại

→Virus hoang dại có khả năng nhiễm được vào tế bào nào đó thì các tiểu phần vector virus

cũng dễ nhiễm vào các tế bào đó

II.1 Các vector có bản chất virus Đặc điểm

Trang 22

Tế bào đóng gói

(packaging cell) Hỗ trợ virus sao chép

Cung cấp gene virus bị cắt

bỏ

Trang 23

23

Kiểu virus giả (pseudotiping) Kiểu virus giả (pseudotiping)

Sử dụng protein của virus

khác để thay đổi kiểu tế bào

Trang 24

II.1 Các vector có bản chất virus

Tạo ra virus mới: mạnh, nguy hiểm

Không làm thay đổi điều hòa hoạt động gene chủ

Một

số

virus

thường gặp

Trang 26

II.1.1 Vector retrovirus (Rv) Đặc điểm

Cấu tạo ngoài

1. Đường kính trung bình: 100nm

2 Có1 vỏ, chứa glycoprotein

Bộ gene

1 Chứa 2 bản sao của RNA đơn dương dài 5-10kb

2 Nhận gắn gene chuyển (transgene) khoảng 8kb

3 Bộ gene RNA được sao chép thành DNA mạch đôi

→Sát nhập vào bộ gene vật chủ

26

Trang 27

II.1.1 Vector retrovirus (Rv) Cơ chế tác động

Gắn các gene chuyển vào NST của tế bào đích

27

Trang 28

Giới thiệu

Cấu tạo

Hệ thống retroviruse

Tạo virion tái tổ

hợp Ứng dụng

28

II.1.1 Vector retrovirus (Rv) a Murine Leukimia Viruse (MLV)

Trang 29

Là vector đầu tiên trong

Virus xâm nhiễm vào tế bào chủ rất hiệu quả

Bộ gene: là bộ gen restroviruse được tạo dòng

sớm nhất

Bộ gene: là bộ gen restroviruse được tạo dòng

Trang 30

Env Env

Pro Pro

Pol Pol

Trang 31

Cấu tạoRetroviruse (Rv) Murine Leukimia Viruse (MLV)

Mã hóa một nhóm protein đặc biệt cấu

thành lõi của viruse

• Mã hóa enzyme protease virus

• Cắt Gag/Pro/Pol thành các chuỗi peptid

hoạt động

http://pharmacydocs.blogspot.com/2015_10_13_archive.html

Trang 32

Mã hóa cho enzyme gắn mạch đôi DNA tại

(phân hủy RNA trong

phân tử lai DNA-RNA)

•Chuyển RNA→DNA

• Chức năng RNase H

(phân hủy RNA trong

phân tử lai DNA-RNA)

32

Trang 33

Dung nạp virus vào màng tế bào

33

Env

Trang 34

Hệ thống vector retroviruse

Vector mang gene

Dòng tế bào đóng gói

Chứa gen mã hóa protein vỏ cần cho

đóng gói (Gag, Env)

Chứa gen mã hóa protein vỏ cần cho

đóng gói (Gag, Env)

Không chứa trình tự cần cho sự đóng

góiKhông chứa trình tự cần cho sự đóng

gói

Trang 35

Tạo virion vector retroviruse tái tổ hợp

Producing recombinant retroviral vectors

Sát nhập DNA vào tế bào chủ Gen của proviruse phiên

mã, tổng hợp protein

Trang 36

Ứng dụngỨng dụng

Yêu cầu với sự hợp nhất, biểu hiện gen virus: các tế bào đích

phải phân chia

→Nhiều mô gặp khó khăn khi các tế bào đã biệt hóa, không tăng

sinh được

Vector retroviruse thường được sử dụng trong liệu pháp gen ex

vivo (thu nhận những tế bào từ cơ thể người bệnh, chuyển gen

liệu pháp, chọn lọc tế bào chuyển gen thành công và cấy trở lại

cơ thể)

 Trong liệu pháp in vivo: biến nạp vào các tế bào

không phân chia Nghiên cứu sử dụng virus HIV làm vector vì chúng có khả năng tải nạp vào các tế bào không phân chia đang được tiến hành

Trang 37

II.1.1 Vector retrovirus (Rv) b Lentiviruse

Giới thiệu

Structure of HIV

http://biology.kenyon.edu/slonc/gene-web/Lentiviral/Lentivi2.html

Là một họ phụ của retroviruse (có HIV)

Bao bọc bởi 1 màng kép lipid chứa protein xuyên

màng

Protein gp120:

• Tế bào chủ nhận diện nó

→Cho phép virus xâm nhập

• Tác động với protein receptor CD4 trên tế bào lympho

Tb của hệ miễn dịch người.

37

Trang 38

II.1.1 Vector retrovirus (Rv)

Vật liệu được đóng gói

(pCMVAR9) Plasmid mã hóa cho protein env Plasmid mã hóa cho protein env Vector chuyểnVector chuyển

Không có khả năng nhân lên sau

khi đã nhiễm vào tế bào chủ

Không có khả năng nhân lên sau

khi đã nhiễm vào tế bào chủ

Còn giữ lại những cặp base của

gene gag và RRE

Còn giữ lại những cặp base của

gene gag và RRE

Trang 39

Trang 40

Trang 41

Nguồn: http://biology.kenyon.edu/slonc/gene-web/Lentiviral/Lentivi2.html

HIV based gene therapy vector

41

Trang 42

II.1.1 Vector retrovirus (Rv) c Một số retroviruse khác

Nguồn:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1

360503/

Trang 43

II.1.1 Vector retrovirus (Rv) d Rủi ro khi sử dụng các vector retroviruse

Đột biến chèn

Tạo ra những virus hoang dại

Vector virus chèn vào bên trong hay kề gene nội bào

Bất hoạt các gen ức chế khối u

Hoạt hóa các proto-oncogene

vector virus không có khả năng sao chép ↔

virus nội sinh in vivo

Các virus có khả năng sao chép

Quá trình đóng gói giữa dòng tế bào đóng

Trang 44

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad)

Trang 45

“Adeno”: tiếng Latin có nghĩa là “tuyến”

Lần đầu tiên được phân lập từ amidan và tuyến vòm họng

Trang 46

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Giới thiệu Hệ gene

Trang 47

Hệ genecủa Adenovirus

Tín hiệu đóng gói P(packaging signal)

Gene muộn L(late gene)

Gene sớm E(early gene)

Trang 48

Vùng gene cuối lật ngược (IRT)

Gene muộn L

(late gene)

Tạo 11protein

= 7 ở vỏ + 4 ở lõi bộ gene

Trang 49

đưa vào nhân

Tín hiệu định vị nhân

Trang 50

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Cơ chế tác động

Phiên mã Phiên mã

Xuất phát từ 2 đầu DNA mạch thẳng

1 phân tử mạch kép

Tạo ra ban đầu

Tạo ra ở giai đoạn sau

Dịch mã Dịch mã

Trang 51

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Thế hệ

vector adenovirus

Thế hệ vector adenovirus

Trang 52

vector adenovirus

 Từ thận phôi người

 Luôn tồn tại, biểu hiện gene E1A, E1B

Trang 53

vector adenovirus

• Sản phẩm: 1 protein gắn DNA mạch đơn

→Cần cho sự sao chép DNA, thể hiện gene

• Được sản xuất bởi dòng tế bào 293

• E3 không mã hóa cho gene cần thiết cho sao chép in vitro

• E3 giúp virus tránh được sự đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ bằng cách

khóa MHC I

→ Tăng cường sự trình diện kháng nguyên, đáp ứng miễn dịch của tế bào chủ

• Cần các dòng tế bào thể hiện tốt E4

• Giảm sự ổn định DNA adenoviruse in vivo

• Mất khả năng biểu hiện promoter CMV ở gan

Trang 54

Vector virussuy nhược

Mục đích:

Ngăn cản việc tạo ra các protein virus có tính năng hạn chế đáp ứng miễn dịch

Mục đích:

Ngăn cản việc tạo ra các protein virus có tính năng hạn chế đáp ứng miễn dịch

Thay tất cả các trình tự mã hóa cho proteinbằng gene liệu pháp và

Trang 55

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Tái tạo adenoviruse

Nguyên lý Đồng nhiễm 2 phần của bộ gene adenoviruse vào trong tế bào có

biểu hiện mạnh gene E1 (tế bào chủ)

1plasmide+gene E1 (có đầu 5’) thay bằng gene trị liệu

1 DNA của adenviruse (thiếu đầu 5’),

Trang 56

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Tái tạo adenoviruse

Transduction using adenoviral vectors Recombinant adenovirus enters cells via CAR-mediated binding allowing internalization via receptor-mediated

endocytosis through clathrin-coated vesicles

Trang 57

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Ứng dụng

Chuyển gene in vivo vào phổi, gan,

Trang 58

II.1.2 Vector Adenovirus (Ad) Rủi ro khi sử dụng

Trang 59

Tài liệu tham khảo

Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2007), Công nghệ sinh học trên người và động vật, Nhà xuất bản Giáo

dục Việt Nam,

896 trang

59

Trang 60

Let ignorance talk as it will, learning has its

value

Trang 61

Cám ơn Thầy và các bạn

đã chú ý lắng nghe

61

Định dạng
Số trang	61
Dung lượng	6,06 MB