Báo cáo thực tập hợp chất thiên nhiên

Đây là 6 bài thí nghiệm về hợp chất thiên nhiên bổ ích BÀI 1: TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA TINH DẦU CAM BƯỞI BÀI 23. TÁCH CHẤT BÉO TỪ DẦU THỰC VẬT TÁCH CHIẾT STEROL TỪ HỖN HỢP KHÔNG BỊ XÀ PHÒNG HÓA CỦA CHẤT BÉO BÀI 4. PHÂN TÍCH SẮC KÝ DẦU BÉO THỰC VẬT Bài 5. TÁCH CHIẾT ALKALOID TOÀN PHẦN CHIẾT PIPERINE TỪ HẠT TIÊU ĐEN BÀI 6.TÁCH CHIẾT FLAVONOID CHIẾT HESPERIDIN TỪ VỎ CAM, BƯỞI

Nhóm 5:

B1203503 Nguyễn Duy Thanh B1207869 Trần Thoại Trang B1203505 Trần Tường Thao B1203527 Phạm Long Tố Uyên B1203514 Nguyễn Đình Cung Tiến

BÀI 1: TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA TINH

DẦU CAM BƯỞI

I.Nguyên tắc :

Limonene là một hydrocarbon terpene dạng lỏng, không màu, có vai trò tạo mùi

cho một số quả thuộc loài Citrus.Công thức phân tử: C10H16, tồn tại ở hai dạng đồng phân

quang học D-Limonene ((+)-limonene) và L-Limonene ((-)-limonene)

Tinh dầu vỏ cam, bưởi có thành phần limonene cao.Trong đó, tinh dầuvỏ cam với

có khoảng 90% Limonene

Limonene ngoài khả năng gây ngán ăn trên sâu

và côn trùng gây hại (ứng dụng để diệt côn trùng nhằm

bảo vệ mùa màng) còn có dược tính:

• Được nghiên cứu hoạt tính sinh học với khả

năng gây độc lên tế bào ung thư (khi sử dụng

DMBA, NDEA, thử nghiệm gây sinh khối u tại

vú trên động vật)

Sinh tổng hợp limonene: Limonene được hình

thành từ geranyl pyrophosphate thông qua sự đóng vòng của carbocation neryl

II.Phương pháp :

 Chiết tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, tối ưu các yếu tố trong việc chưng cất tinh dầu ở phòng thí nghiệm

 Chiết lỏng – lỏng

 Làm khan hợp chất hữu cơ (Na2SO4 khan)

III.Tiến hành:

 Cân 100g nguyên liệu (vỏ cam tươi có màu xanh đồng nhất , vỏ trong màu trắng không hư), xắt nhỏ và xay nhuyễn để việc tách chiết tinh dầu được tối ưu nhất

 Chưng cất lôi cuốn hơi nước: bằng thiết bị Clevenger:

• Đong nước cất, cho cùng nguyên liệu vào bộ chưng cất (tỷ lệ thể tích là 1:1)

• Khởi động máy tăng nhiệt Sau khi nước trong bộ chưng cất sôi, đợi 2 giờ Tắt máy, chờ nguội 20 phút rồi tháo lấy tinh dầu và vệ sinh bộ chưng cất

• Lưu ý: 5 ml nước chưng cất thu được đầu tiên được

xã bỏ do có thể chứa nhiều tạp chất

• Sau khi chưng cất ta thu được 2 lớp dung dịch, tinh dầu nhẹ nên nằm ở lớp trên

 Chiết tách tinh dầu:

• Cho lớp tinh dầu thu được vào bình chiết

• Dùng Diethyl ether (DE) để lắc tách tinh dầu 3 lần,

mỗi lần với 30 ml diethyl ether

• Sau mỗi lần lắc, lấy lớp trên vì diethyl ether nhẹ

hơn nước và hòa tan tốt tinh dầu

• Thu gom tinh dầu, làm khan nước bằng Na2SO4

 Cô quay đuổi diethyl ether

Thu được tinh dầu màu cam đỏ và có mùi đặc trưng

IV.Kiểm tra kết quả:

Tinh dầu vỏ cam có màu vàng đậm, mùi thơm đặc trưng phần vỏ quả, có vị đắng nhẹ (vì thành phần hóa học của tinh dầu có chứa terpene),cay, ngọt, có tính sát trùng, phản ứng trung tính với giấy quì

V.Trả lời câu hỏi:

1.Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu vỏ quả như cam, bưởi…có thề thực hiện trong điều kiện nguyên liệu như thế nào? Giải thích?

 Vỏ cam sau khi thu hoạch có màu xanh đồng nhất, tươi, phần vỏ bên trong có màu trắng, không bị dập, ủng Vì như vậy thì mới đảm bảo được lượng tinh dầu thu được là tối ưu nhất (tránh thất thoát tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi) Cần xoay nhuyễn vỏ quả để tăng hiệu suất chiết tách

2.Phương pháp tách tinh dầu vỏ quả bằng lực cơ học như ép vắt…có thể thực hiện trong điều kiện nguyên liệu như thế nào? Giải thích?

 Cũng như phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước nguyên liệu tức là vỏcam sau khi thu hoạch có màu xanh đồng nhất, tươi, phần vỏ bên trong có màu trắng,

không bị dập, ủng Vì như vậy thì mới đảm bảo được lượng tinh dầu thu được là tối ưu nhất (tránh thất thoát tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi) Cần xoay nhuyễn

vỏ quả để tăng hiệu suất chiết tách

3.Nguyên tắc lóng tách hai chất lỏng từ 1 hỗn hợp?

Nguyên tắc dựa trên sự cân bằng phân bố của chất tan giữa hai pha lỏng không hòa tan vào nhau

a.Chiết chất lỏng :

Chiết lỏng – lỏng là quá trình chuyển một chất ở dạng hòa tan hay huyền phù từ pha lỏng này sang pha lỏng khác Tùy theo bản chất của chất cần chiết và môi trường chúng đang tồn tại ta chọn dung môi chiết thích hợp sao cho chỉ hòa tan chất định chiết mà không hòa tan các chất của môi trường Quá trình chiết kết thúc khi chất dã chiết hết Kiểm tra bằng màu hay sắc ký

Nguyên tắc chọn dung môi

 Dung môi phải chọn là dung môi có khả năng hòa tan lớn hơn dung môi cũ

 Dễ tách ra khi tinh chế lại thành chất tinh khiết không trộn lẫn vào dung môi cũ

 Có sự khác biệt nhiều về tỉ khối so với dung môi cũ

 Ít có khả năng tạo nhũ và ít nguy hiểm

 Có nhiệt độ sôi thấp vì sau khi chiết ta thường dùng phương pháp chưng cất để tách dung môi ra

 Dung môi không phân cực (ether dầu hỏa…) hòa tan tốt hợp chất không phân cực

 Dung môi phân cực trung bình (diethyl ether, chloroform…) hòa tan tốt hợp chất phân cực trung bình (vd như bài tinh dầu…,chất nhóm chức ether, aldehyde, ketone, ester, )

 Dung môi phân cực mạnh (metanol…) hòa tan chất phân cực mạnh(ancohol, acid carboxylic…)

b.Những lưu ý khi sử dụng bình lóng

Trước hết khóa kín bình, đổ dung dịch vào, rồi cho dung môi vào bình đựng dung môi, thường dùng từ 1/5 – 1/3 thể tích dung dịch Đậy nút, tay phải giữ nắp và bình, tay trái giữ khóa bình, lắc nhẹ cẩn thận, đảo ngược nhiều lần Khi lắp áp suất trong bình tăng lên nên thỉnh thoảng mở khóa bình để cân bằng áp suất với bên ngoài, sau

đó đóng khóa lại, tiếp tục lắc Khi lắc xong, để bình trên giá, mở nắp đậy chờ dung dịch tách thành hai lớp Mở khóa bình cho lớp chất lỏng phía dưới chảy xuống, còn lớp trên được lấy ra bằng cách đổ qua miệng bình

• Chú ý: Nếu sau khi lắc và lắng, nếu không thấy 2 chất lỏng phân riêng ra mà tạo nhũ tương lúc này ta thêm dung dịch NaCl bão hòa tinh khiết vào cho đến khi tách thành hai lớp chất lỏng, hoặc có thể thêm vào bình lóng khoảng 30ml nước cất

4.Nguyên tắc làm khan hợp chất hữu cơ?

 Đây là phương pháp loại nước hoặc dung môi ra khỏi sản phẩm hoặc hóa chất ban đầu

 Làm khô trong hóa hữu cơ là làm khô nước Một chất làm khô được gọi là tốt khi cường độ làm khô mạnh và khả năng làm khô lớn Cường độ làm khô được đánh giá bằng áp suất hơi nước của chất đó, khả năng làm khô được đánh giá bằng lượng nước hấp thụ được

 Các chất như P4O10, H2SO4 đặc, CaCl2, MgSO4, Na2SO4 đều là các chất làm khô mạnh Người ta còn chia chất làm khô thành 3 loại: Acid như P4O10, H2SO4 đặc ; base như KOH, NaOH viên và chất làm khô trung tính: MgSO4, Na2SO4 tùy theo tính chất của đối tượng được làm khô mà người ta chọn chất làm khô thích hợp theo nguyên tắc không làm biến chất chất được làm khô về cả tính chất vật lý lẫn hóa học

Chất làm khô phải thỏa mãn các điều kiện sau

 Không có tác dụng hóa học với chất lỏng

 Có khả năng hút nước mạnh

 Không hòa tan trong chất lỏng

 Có tác dụng làm khô nhanh

Chú ý: Cho vào chất lỏng không hút nước một lượng quá lớn chất làm khô dạng

rắn vì nếu dùng nhiều sẽ hao hụt chất lỏng, sau đó loại chất làm khô, có thể dùng dung môi thay chất làm khô

5.Nguyên tắc xác định hằng số vật lý tinh dầu nhằm mục đích gì?

 Mục đích là để xác định độ tinh khiết của tinh dầu cam thu được,khảo sát được lượng nước còn lẫn trong tinh dầu, hiệu suất chiết cũng như độ tan của tinh dầu cam

6.Khảo sát:Nhiệt độ để kết tinh tinh dầu cam rất thấp (<-22oC)

a Khảo sát nồng độ và thời gian ngâm muối NaCl đến hiệu suất thu hồi tinh dầu

 Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thànhhệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợpchưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước.Muối cũng là chất điện li làm tăng tỉ trọng, độphân cực của nước giúp tinh dầu dễ phân lớp

Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sựtăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh

dầu ra ngoài Nồng độ muối tối ưu là 2%.

b.Khảo sát nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu

 Với nguyên liệu xay cho hàm lượng tinh dầu cao hơn rất nhiều so với nguyênliệu không nghiền Khi nghiền, các tế bào chứa tinh dầu bị vỡ, nước dễ thẩm thấu vào các túi dầu, tinh dầu dễ thoát ra môi trường ngoài và hơi nước có nhiệm vụ lôi

cuốn tinh dầu tự do ra bình hứng Ngoài ra, với nguyên liệu xay tinh dầu thu được trong suốt, không màu, có mùi tự nhiên hơn so với nguyên liệu không

xay tinh dầu có màu vàng do tiếp xúc nhiệt quá lâu và mùi không còn tự nhiên

c.Khảo sát thời gian ngâm với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được.

 Do có thời gian đểtạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường bên nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay từ đầu và thể tích tăng đáng kể Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và

tinhdầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi chưngcất Thời gian ngâm tối ưu là

2 giờ

d Khảo sát tỉ lệ bã vỏ cam/nước chưng và thời gian chưng đến hiệu suất thu hồi tinh dầu.

 Lượng nước quá nhiều một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao

bọc xung quanh túi tinh dầu

 Thời gian chưng cất càng lâu lượng tinh dầu thu được càng nhiều Tuy nhiên, đến một thời điểm nào đó thì lượng tinh dầu thu được không tăng lên theo thời gian Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn ảnh hưởng đến chất lượng

tinh dầu do nguyên liệu bị cháy khét làm mấtmùi thơm tự nhiên của tinh dầu

Nhóm 5:

B1203503 Nguyễn Duy Thanh B1207869 Trần Thoại Trang B1203505 Trần Tường Thao B1203527 Phạm Long Tố Uyên B1203514 Nguyễn Đình Cung Tiến

BÀI 2&3 TÁCH CHẤT BÉO TỪ DẦU THỰC VẬT TÁCH CHIẾT STEROL TỪ HỖN HỢP KHÔNG BỊ XÀ PHÒNG HÓA CỦA

CHẤT BÉO

I Nguyên tắc:

1 Tổng quan về Lipids (chất béo):

Gồm 3 nhóm chính: Các chất béo dầu mỡ, sáp, phospholipid

 Các chất béo dầu mỡ: gồm acid béo (dạng dầu hoặc sệt), hydroxyacid, acetylenic acid, hỗn hợp glyceride

 Acid béo: là acid carboxylic có số chẵn carbon

• Acid béo không no (thường dạng dầu): chứa 1 – 6 liên kết đôi trong phân

tử Trong thiên nhiên đa số là acid béo không no có cấu trúc dạng cis: acid oleic, acid linoleic, acid linolenic

• Acid béo no (thường dạng mỡ, hơi sệt) Ví dụ: acid caproic – C6, acid myristic – C14, acid palmitic – C16, acid stearic – C18, acid arachidic – C20…

• Các acid béo tham gia trong phản ứng xà phòng hóa tạo thành muối

 Acid acetylenic: nhóm hợp chất acid carboxylic dạng dầu chứa liên kết ba trong phân tử (liên hợp với nhau hoặc liên hợp với liên kết đôi) Ngoài ra có thể có thêm các liên kết đôi và gồm các dẫn xuất có oxygen tương ứng Ví dụ: acid tariric, acid stearolic

 Glyceride: hợp chất không phân cực, khi bị xà phòng hóa tạo thành glycerol và muối của acid béo

 Sáp: chủ yếu gồm các acid béo dây hở, ester của acid béo và các alcohol

monohydric, thường chứa từ 24-36 carbon Ví dụ: sáp ong, mỡ sáp từ lông cừu (lanolin),…Các sáp chịu được sự xà phòng hóa hơn là dầu và các chất béo

 Chất béo biến dưỡng thứ cấp: Sphingomyelin, phospholipid

 Sphingomyelin: có mạch acid béo hóa hợp với một polyhydroxyamine mạch hở tạo nối amide, có thể có liên kết glycosidic với carbohydrate

 Phospholipid: chứa acid phosphoric và một base nitơ (như choline, ethanolamine, serine) và một polyhydroxyalcohol

2 Tổng quan về sterol

 Sterol là một dạng chất béo thuộc nhóm hữu cơ bậc hai, không bị xà phòng hóa, có cấu trúc hệ vòng cyclopentano perhydro phenanthrene, với nhóm –OH ở vị trí C-3 trên vòng; và trong số ít trường hợp có cấu trúc biến đổi của hệ vòng đó Nhờ cấu trúc này mà cách định tính và định lượng sterol có những phương pháp riêng

 Sterol là nhóm chất rất phong phú, có trong động vật, thực vật và nấm men Sinh tổng hợp sterol từ chuyển hóa acetate thành squalene, có phối hợp đóng vòng và demethyl hóa Sterol có thể ở dạng tự do hoặc dạng ester, glycoside

 Do sterol không tan trong nước và không bị xà phòng hóa nên có thể tách ra khỏi dung dịch chất béo đã bị xà phòng hóa bằng cách chiết lỏng – lỏng với dung môi hữu cơ kém phân cực

3 Tính chất và cách khảo sát chất béo

 Chất béo không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ không phân cực Vì vậy có thể sử dụng các dung môi như: ether dầu hỏa, hexane, chloroform… để

tách lấy chất béo từ nguyên liệu khô, hoặc chiết lỏng – lỏng để tách lấy chất béo từdịch chiết alcohol của nguyên liệu

II Tiến hành:

1 Chiết chất béo trong đậu nành:

 Cân 300g đậu nành, xay nhuyễn thành bột mịn, cho vào túi vải, cột chặt miệng túi

 Dùng ether dầu hỏa ngâm bột đậu, ngâm chiết 3 lần, lần lượt với thể tích: 200ml, 150ml và 100ml Trong lúc ngâm, dùng đũa khuấy động lên túi 10 phút rồi để yên

5 phút, vắt lấy dịch ether dầu hỏa

 Gom dịch chiết, lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi

 Cô quay còn 150ml thì lấy bình ra, chia làm 2 phần: Phần 1: 100ml sử dụng cho

xà phòng hóa tách chiết sterol Phần 2: 50ml còn lại cô quay đến gần cạn để sắc ký

 Tiếp tục ngâm chiết bã đậu nành đã loại béo với Chloroform 2 lần, mỗi lần với 100ml dung môi

 Vắt, gom dịch chiết, cô quay thu hồi dung môi đến thể tích còn khoảng 3ml

2 Phân tích sắc ký dung dịch chất béo của đậu nành:

 Chuẩn bị 2 bản mỏng: vạch đường xuất phát và đường đến của dung môi

 Trên mỗi bản mỏng chấm 2 vết sắc ký tương ứng từ 2 loại: dịch ether dầu hỏa (E)

và dịch chloroform (C)

 Giải ly trong 2 hệ dung môi khác nhau:

• Dung môi giải ly (1): ether dầu hỏa : ethyl acetate (0,5:1,5)

• Dung môi giải ly (2): chloroform : methanol (2 ml chloroform + 1 giọt methanol)

3 Xà phòng hóa dung dịch chất béo của đậu nành:

 Lấy 100ml dung dịch chất béo đậu nành (đã chừa ra khi cô quay) cho vào bình cầu, thêm 100 mL methanol, ngâm bình vào chậu nước lạnh, thêm tiếp 25 g KOH

 Lắp bình vào bộ đun hoàn lưu, đun trong 2 – 2,5 giờ

 Sau khi đun, cho thêm 50ml nước cất vào hỗn hợp Chia hỗn hợp làm 2 phần, chiết 3 lần, mỗi lần với 50ml ether dầu hỏa

4 Tinh chế hỗn hợp sterol:

 Dịch chiết ether dầu hỏa rửa với 50 mL nước muối, làm khan với Na2SO4, cô quay thu hồi dung môi đến còn 3-5 ml cho ra cốc, ngâm đá, thu lấy kết tủa

 Kết tinh lại: Hòa kết tủa này vào 3ml chloroform đã đun nhẹ (500C), sau đó lọc qua giấy lọc, ngâm lạnh đặt vào tủ hút để bay hơi, thu được tủa sterol

5 Sắc ký bản mỏng khảo sát sơ bộ thành phần sterol:

 Chuẩn bị bản mỏng sắc ký, chấm sắc ký 3 vết: dung dịch chất béo của đậu nành

(1), dịch chiết sterol với eter dầu hỏa (2), dung dịch khi ngâm tủa sterol (3).

 Chuẩn bị dung môi giải ly: Hệ dung môi chloroform : methanol (2ml chloroform +

1 giọt methanol) Đặt bản mỏng sắc ký vào cốc giải ly Lấy bản đã giải ly đem sấy trên bếp điện (120º C) để bay hết dung môi

 Nhúng bản mỏng đã khô vào dung dịch hiện hình vết, sấy trên bếp điện, đến khi hiện màu vết

III Kết quả:

3 Tìm hiểu và viết báo cáo về nhóm chức của sterol trong đậu nành.

 Trong 100 g dầu đậu nành có từ 300 – 400 mg sterol thực vật Thành phần chính

của sterol trong đậu nành gồm có β-sitosterol (53 – 56%), campesterol (20 – 23%)

và stigmasterol (17 – 21%) Cấu trúc hóa học của những sterol này chỉ khác với cholesterol ở cấu trúc mạch nhánh



β-sitosterollà chất bột màu trắng, dạng sáp, mũi dễ chịu, không tan trong nước và tan

trong alcohol.β-sitosterollàm giảm lượng cholesterol do ngăn cản cholesterol hấp

thu vào ruột; đôi khi còn được dùng để chữa tăng cholesterol máu

 Campesterol có trong nhiều loại rau củ, trái cây, các loại hạt và hạt giống nhưng với hàm lượng thấp Hàm lượng campesterol nhiều hay ít tùy thuộc vào sự ảnh hưởng của điều kiện địa lý và môi trường phát triển của cây Campesterol có tính kháng viêm, có khả năng ức chế các chất gây viêm và chất gây thoái hóa chất nền liên quan đến viêm xương khớp do thoái hóa sụn

 Stigmasterol là một trong số các sterol thực vật không no, không tan trong nước

mà tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ có chứa nhóm chức alcohol; thường hiện diện trong dầu thực vật hay dầu đậu nành, trong nhiều lọa rau củ, cây họ đậu, hạt, hạt giống Stigmasterol giữ vai trò sinh lý quan trọng trong các cơ chế điều tiết và tái tạo các mô liên quan đến ảnh hưởng của estrogen cũng như là một chất trung gian trong sinh tổng hợp androgen, estrogen và corticoid Stigmasterol còn được dung như là tiền chất của vitamin D3

Nhóm 5:

B1203503 NguyễnDuyThanh B1207869 TrầnThoạiTrang

B1203505 TrầnTườngThao B1203527 Phạm Long TốUyên

B1203514 NguyễnĐìnhCungTiến

BÀI 4 PHÂN TÍCH SẮC KÝ DẦU BÉO THỰC VẬT

I Nguyêntắc:

 Trong một số loại thực vật có nhiều hợp chất dạng dầu, một số loài động vât có các chất béo dạng mỡ và sáp, mộtsốloàinầm men cócácchất sterol

 Tuynhiên, ngoàichấtbéo,

cáchợpchấtbéokémphâncựckháccũngcóthểtồntạidướidạngdầunhưtetraterpene, xanthophyll khicònđanglàhỗnhợptríchtừthựcvật Tronghỗnhợpdầubéothựcvật, sốlượngcáchợpchấtthườngnhiềuhơn 2 chất

 Cáchợpchấtdầubéonhư alcohol, acid béovà ester

tronghoaquảcũngcóvaitròtạomàuvàmùichothựcvậtđó

II Tiếnhành

Cơmgấc(400 g)

ngâmrượu

Lọc, rótracốc 80 ml

10 ml đuncáchthủytrong 30

phút, sửdụngchosắckýlớpmỏng