3 bản chất quá trình lên men rượu

3.2.Bản chất của quá trình lên men Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian.. Quá trình lên men rượu kèm theo sự hình thành các sản phẩm đồn

3.Bản chất quá trình lên men rượu

3.1.Một số nghiên cứu đầu tiên:

Lên men rượu đầu tiên đã rất lôi cuốn các nhà khoa học trên thế giới Vào thế kỉ

18, Blac đã cho rằng sản phẩm của sự lên men rượu chỉ là C2H5OH và CO2

Năm 1789, Lavoise thực hiện một số thí nghiệm cho thấy rằng bên cạnh những sản phẩm chính là C2H5OH và CO2 còn có một số sản phẩm khác mà ông đặt tên là acid acetic Theo ông, 95,5 % đường sẽ cho 57,7% C2H5OH, 33,3%CO2 và 2,5% acid acetic

Năm 1810, Tay Hussac đã nghiên cứu tỉ mỹ hơn về khám phá của Lavoise, ông cho rằng cứ 45 phần đường glucose thì tạo ra 23 phần rượu C2H5OH và 22 phần CO2 Từ đó ông cho ra phương trình sau:

C 6 H 12 O 6 = 2C 2 H 5 OH + 2CO 2

Năm 1853, Pasteur đã công bố kết quả nghiên cứu của ông về sự lên men rượu, theo ông cứ 100 phần saccharose thì chuyển sang được 105,4 phần đường nghịch đảo và sau khi lên men sẽ cho 54,1 phần C2H5OH và 49,4 phần CO2, 3,2 phần glycerin, 0,7 phần acid sucenic và một phần các sản phẩm khác Từ đó, người ta tính được cứ 45 phần glucose lên men rượu được 21,8 phần C2H5OH chú không phải là 23 phần như Tay – Hussac đã tính

Sau đó nhiều nhà khoa học đã đi sâu vào nghiên cứu quá trình lên men rượu và các giống vi sinh vật lên men, các yếu tố kĩ thuật trong quá trình lên men

3.2.Bản chất của quá trình lên men

Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian Lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp, đòi hỏi phải có sự tham gia của nấm men hoặc một số vi sinh vật khác Trong quá trình lên men rượu, đường được biến đổi thành rượu ethylic và CO2 Quá trình lên men rượu kèm theo

sự hình thành các sản phẩm đồng thời giải phóng ra năng lượng Trong phản ứng lên men, đường được chia cắt thành các mạch cacbon cơ bản để hình thành nên các hợp chất carbon mạch ngắn hơn

Để thực hiện được các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình, vi sinh vật cũng đòi hỏi phải có năng lượng Lên men là quá trình cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng dưới dạng năng lượng tàng trữ trong mạch cacbon và được giải phóng ra trong các phản ứng enzyme do sự chuyển electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong các quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro Nhưng sự chuyển hydro cũng tương đương với sự chuyển electron, vì lẽ nguyên tử hydro có thể tách ra thành proton H+ và electron Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất gọi là enzyme dehydrogenaza Như vậy, lên men là quá trình oxy hóa – khử

có enzyme xúc tác hay nói cách khác là quá trình oxy hóa – khử sinh học Trong quá trình đó, các nguyên tử cacbon của cơ chất bị oxy hóa đến CO2, còn các nguyên tử hydro tách ra khỏi cơ chất, đầu tiên được chuyển đến NAD+, sau đó từ NADH2 trong điều kiện yếm khí hydro có thể được chuyển đến những sản phẩm trung gian khác nhau hoặc đến chất tiếp nhận được tổng hợp nên chỉ nhằm mục đích đó, nghĩa là để tái sinh lại NAD+ Tùy thuộc vào chất tiếp nhận hydro cuối cùng mà phân biệt hô hấp lên men và hô hấp yếm khí

Lên men là quá trình để thu năng lượng, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ được khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó Phụ thuộc vào sản phẩm nào được tích tụ chiếm ưu thế hoặc sản phẩm nào đặc trưng mà người ta phân ra lên men rượu, lên men lactic hay lên men butyric,…

Lên men khác với hô hấp yếm khí và sự oxy hóa không hoàn toàn Hô hấp yếm khí cũng tiến hành trong điều kiện không có oxy tham gia nhưng hydro lại được chuyển qua mạch hô hấp mà đến chất tiếp nhận cuối cùng như nitrat hoặc sulfat 3.3.Cơ chế quá trình lên men rượu [3,5]:

Lên men rượu là một quá trình sinh học rất phức tạp xảy ra dưới tác dụng của nhiều enzyme

Theo lý thuyết hiện đại sự tạo thành rượu từ glucose thì trải qua các giai đoạn sau nay:

1./ Đầu tiên dưới tác dụng xúc tác của glucokinaza, đường gluco kết hợp với photphat của phần tử ATP ( Andenozitri – Photphat) trong tế bào nấm men tạo thành gluco – photphat và AND

C 6 H 12 O 6 + ATP  CH 2 O(H 3 PO 3 )(CHOH) 4 CHO + ATP

2./ Tiếp sau đó gluco- 6- photphat do tác dụng của enzym đồng phân gloco-photphat-izomenaza sẽ biến thành fructophotphat

CH 2 O(H 3 PO 3 )(CHOH) 4 CHO  CH 2 O(H 3 PO 3 )(CHOH) 3 COCH 2 OH

3./ Giai đoạn tiếp theo dưới tác dụng của enzym photphofuctokinaza phân tử ATP thứ hai sẽ sẽ đính thêm một gốc photphat nửa vào fucto-6-photphat đđể tạo thành fucto-1-6-diphotphat và phân tử ADN thứ hai

CH 2 O(H 3 PO 3 )(CHOH) 3 COCH 2 OH + ATP  CH 2 O(H 3 PO 3 )

(CHOH) 3 COCH 2 (H 2 PO 3 ) + ADP

Sự tạo thành fucto-1-6-photphat của giai đoạn chuẩn bị lên men Giai đoạn thực hiện chuyển hóa mối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổi dưới tác dụng của enzym

4./ Giai đoạn cuối xảy ra dưới tác dụng của xúc tác là aldolaza phân cắt phân

tử fuctodiphotphat thành 2 phân tử trioza gồm aldehyt – photphoglyxeric và photphodioxyaceton

CH 2 O(H 3 PO 3 )(CHOH) 3 COCH 2 (H 2 PO 3 )CH 2 O(H 3 PO 3 )COCH 2 OH+

5./ Vai trò chủ yếu trong các biến đổi tiếp theo của quá trình lên men rượu andehyt- diphotphoglycerin Nhưng trong dịch lên men chúng chứa rất ít, điều này chứng tỏ có sự đồng phân dưới tác dụng của enzym triphotphat izomeraza

CH 2 O(H 3 PO 3 )COCH 2 OH  CH 2 O(H 3 PO 3 )CHOHCHO.

6./ Giai đoạn tiếp theo là 2 phân tử aldehyde photphatglycerin bị oxy hóa Phản ứng này xảy ra có sự tham gia của acidphotphorit Trong canh trường nhờ xúc tác của enzym triphotphat dehydronaza Coenzym của nó là ADN (nicotiamit-andenit-dinucleotic)

CH 2 O(H 3 PO 3 )CHOHCHO + H 3 PO 4 + NaDH 

CH 2 O(H 3 PO 3 )CHOHCHO-H 2 PO 3 + 2NaDH 2

(1-3 diphotpho glyxerin acid) 7./ Giai đđoạn tiếp theo với sự tham gia của photphatglyxerinkinaza gốc photphat cao năng của 1- diphotphoglyxeric mới tạo thành sẽ chuyển vào phân tử ADP

CH 2 O(H 3 PO 3 )CHOHCHO-H 2 PO 3 + 2ADP 

8./ Dứoi tác dụng của photphoglyxeromutaza gốc acid sẽ chuyển từ vị trí cacbon thứ ba đến vị trí cacbon thứ hai

9./ Dưới tác dụng của enolaza, acid 2-photphoglyceric sẽ mất nước và biến thành acid photphopyruvic

2CH 2 OCHO (H 3 PO 3 ) COOH  2CH 2 CO(H 3 PO 3 ) COOH + 2H 2 O

10./ Acid phophopyruvic rất không bến dễ bị mất gốc acid photphoric do enzym pyrovackinaza và do đó acid pyruvic được tạo thành

11./ Tới đây acid pyruvic bị decacbonxyl đđể tạo thành aldehyde acetic

12./ Giai đoạn cuối cùng lên men rượi là aldehyt acetic bị khử bởi NADH2

Phương trình tổng quát lên men rượu như sau:

C 6 H 12 O 6  2CO2 + 2C 2 H 5 OH

Trong quá trình lên men rượu mỗi phần tử gam glucose sẽ giải phóng ra khoảng 50Kcal Năng lượng này nấm men chỉ sử dụng chừng 20Kcal Số còn lại sẽ thải ra canh trường làm tăng nhiệt độ dịch lên men

Hình 1.24: Sơ đồ quá trình lên men rượu Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men:

Trong quá trình lên men ngoài sản phẩm chính là cồn etylic và CO2 còn tạo ra nhiều chất khác Bằng phương pháp phần tích sắc kí người ta đã có trên 500 chất

khác nhau Nhưng về cơ bản có thể xếp vào 4 nhóm chính: acid, esste, andehyt, alcol ( bao gồm cả rượu bậc thấp lẫn rượu bậc cao là dầu fusel)

 Sự tạo thành acid:

Trong quá trình lên men rượu thường tạo ra các acid hữu cơ như: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic,… nhưng chiếm chủ yếu là acid acetic và acid

lactic

• Acid Acetic: có thể tạo thành từ phản ứng oxy hóa giữa 2 aldehyt acetic

• Acid Lactic: đđược tạo bởi pyrovicdehydronaza theo phản ứng.

Hoặc: CH 2 O(H 2 PO 3 )CHOHCHO + CH 3 CHOHCOOH + H 3 PO 4

• Acid Citric: cũng được tạo thành từ aldehyt acetic theo phản ứng sau:

• Acid Succinic: được tạo thành theo 2 con đường đó là dehydro và trùng hợp

hai phân tử acid acetic với phân tử aldehytacetic

 Glycerin và Aldehyt: là sản phẩm trung gian của lên men rượu trong điều

kiện của lên men rượu trong điều kiện lên men chỉ nhằm mục đích thu alcol etylic Người ta khống chế pH lên men trong giới hạn 4,5 ÷ 5,2 với điều kiện đó lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 ÷ 0,45 tương ứng 2 ÷ 3 % lượng đường ban đầu Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng glyxerin đạt 23,4 % và lượng aldehyt chưa chuyển thành rượu đạt 11,9% Dựa vào tính chất này để tạo thành ra glycerin Người ta còn dùng natrisunfit cho vào canh trường lên men nhằm điều chỉnh sản phẩm tạo thành Tóm lại: tùy theo điều kiện môi trường lên men có thể xảy ra theo các kiểu khác nhau

Lên men rượu bình thường:

C 6 H 12 O 6  2CO 2 + 2C 2 H 5 OH

Lên men rượu cho thêm Na 2 S 2 O 3

C 6 H 12 O 6  CH 3 CHO + C 3 H 8 O 3 + CO 2

Lên men ruọu trong môi trường kiềm:

C 6 H 12 O 6  2CO2 + CH 3 COOH + C 2 H 5 OH + C 3 H 8 O 3

 Sự tạo thành Alcol cao phân tử:

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu có số nguyên tử cacbon lớn hơn hai đó là: aldol propylic, izobutylic, izoamylic, imylic, Hàm lượng của chúng chỉ vào khoảng 0,4 ÷ 0,5% so với cồn etylic, nhưng chúng ảnh hưởng rất xấu đến chất lượng sản phẩm do đó gây ra cho sản phẩm có mùi hơi khó chịu Các aldol này có tên chung là dầu Fusel hay còn gọi là dầu khét Nguyên nhân hình thành dầu Fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin trong quá trình sinh trưởng tạo thành

Phương trình tổng quát hình thành alcol cao phân tử được đơn giản theo phản ứng sau:

NH 2

Nhiều nhà nghiên cứu cho thấy sự tạo thành alcol cao phân tử chỉ phụ thuộc vào cấu trúc và hàm lượng acid amin có trong dịch lên men

 Sự tạo thành este:

Song song với việc tạo thành acid và aldol thì dưới tác dụng của enzym estaraza của nấm men các acid và aldol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo thành este tương ứng có thể viết dưới dang tổng quát như sau:

R 1 CH 2 OH + R 2 COOH  R 2 COO-CH 2 R 1 + H 2 O

3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

3.4.1.Nhiệt độ:

Mỗi một vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối

với nấm men Saccharomyces nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 ÷ 320C

Khi lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men kém và kéo dài hơn Nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường ban đầu xuống tới 20 ÷ 220C để hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn Sau 8 – 10 giờ nhiệt độ của môi trường sẽ tăng tới mức tối thích là 28 ÷

300C Tiếp đó là làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu

Nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ nhiễm vi khuẩn lactic và nấm men dại Ở nhiệt độ 300C thì nấm men dại phát triển nhanh

hơn nấm men Saccharomyces, còn ở nhiệt độ cao 35 ÷ 38 0C chúng phát triển nhanh hơn 6 ÷ 8 lần Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ như este, aldehyt và tổn thất rượu theo CO2 tăng

3.4.2.pH môi trường:

Nồng độ ion H+ trong môi trường ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men, chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chất lượng của sự lên men Mỗi vi sinh vật có thể hoạt động tốt ở một trạng thái ion nhất định Trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của môi trường

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành alcol etylic sẽ là 4,5 ÷ 5,2 Nếu tăng pH cho môi trường lên men thì lúc này môi trường đễ bị nhiễm khuẩn Glycerin sẽ tạo thành nhiều hơn và do đó giảm hiệu suất lên men Ở pH nhỏ hơn 4,2 nấm men phát triển tuy chậm hơn so với 4,5 ÷ 5,2 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển Trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,8 ÷ 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn nhất là vi khuẩn lactic và nấm men dại, lúc đó nấm men đủ mạnh để lấn áp tạp khuẩn thường làm tăng pH đến khoảng tối thích

3.4.3.Nồng độ dịch lên men (nồng độ đường)

Nồng độ dịch đường khá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng về trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả l ml độ rượu cao không những ức chế được tạp khuẩn mà ức chế cả nấm men Mặc khác nếu nồng độ đường cao sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men Ngược lại nếu nống độ dịch đường ban đầu thấp sẽ không kinh tế và làm giảm hiệu suất của thiết bị lên men, tốn năng lượng khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bả và nước thải Bình thường người ta khống chế hàm lượng nồng độ chất khô của dịch đường ban đầu từ 16 ÷

180Bx ( tùy theo mức độ thuần khiết) Tương đương với 13 ÷ 15% đường để sau khi len men sẽ nhận được nồng độ rượu trong dịch dấm chín 8,5 ÷ 9,5%V

3.4.4.Nồng độ cồn etylic:

Rượu tạo ra trong quá trình lên men tác động ngược lại đến cường độ lên men Thông thường nấm men lên men tới nồng độ đạt 12 ÷ 14% V Một số nấm men có thể đạt được 17÷ 20%V Với nồng độ cao hơn sẽ ức chế nấm men và gần như đình chỉ sự lên men rượu Với nồng độ rượu đạt 4,5%V bắt đầu ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của nấm men Khi nồng độ đạt đến 5%V thì sự sinh sản bắt đầu

ngưng trệ, nếu lên tới 7÷8% V thì bắt đầu kết thúc giai đoạn lên men mạnh và cũng bắt đầu giai đoạn lên men chậm ( lên men phụ)

3.4.5.Thời gian lên men:

Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men Thời gian lên men được tính từ lúc cấy giống vào môi trường và trải qua giai đoạn sinh sản, sinh trưởng, lên men … Người ta chưa xác định rõ khi nào thì quá trình lên men kết thúc Thông thường người ta chia thành 2 giai đoạn lên men

- Giai đoạn lên men chính: là giai đoạn này kết thức khi nếm dịch lên men không còn vị ngọt của đường hay quan sát thấy khả năng tạo bọt rất yếu

- Giai đoạn lên men phụ: là giai đoạn ủ chín và tàng trữ, được tính từ lúc bắt đầu kết thúc quá trình lên men chính và thường kéo dài vài tháng trở lên

3.4.6.Nồng độ O 2 trong môi trường:

Nấm men là loại vi sinh vật hô hấp tùy tiện, trong môi trương yếm khí nó sẽ lên men để tạo rượu và CO2, còn trong điều kiện đấy đủ O2 nó có khả năng oxy hóa dường thành CO2 và H2O, đồng thời sinh sản và phát triển rất mạnh, do đó có thể kìm hãm sự lên men bằng O2 hay còn gọi là hiệu ứng “Pasteur”

Do đó trong việc sản xuất rượu vang thì giai đoạn đầu cần tạo điều kiện hiếu khí để cho nấm men phát triển, sinh sản đủ số lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men Sau đó phải yếm khí tuyệt đối cho nấm men chuyển hóa đường

3.4.7.Nồng độ CO 2 tạo thành:

Khí CO2 được tạo thành trong quá trình lên men rượu từ dịch đường Một phần sẽ tồn tại trong môi trường, một phần sẽ tách ra bên trên bề mặt môi trường, và một phần sẽ tích tụ lại làm một lớp ngăn cản không khí và môi trường Khí CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men chứ không làm yếu khả năng lên men của chúng

Theo Mike Hugar với nồng độ 0,25% trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ làm ức chế sự sinh sản của nấm men Cũng theo Smitener sự sinh sản của nấm men ngừng khi nồng độ CO2 trong môi trường lên đến 4,5% trọng lượng, tương ứng với áp suất 7,7 bar ở 150C

Khi môi trường chứa hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, ức chế

sự sinh sản của nấm men dẫn đến hiệu suất thấp

Khí CO2 nằm trong khoảng không gian giữa môi trường và không khí có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật

3.4.8.Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng:

Trong điều kiện sản xuất dù vệ sinh có sạch đến đâu thì cũng khó bảo đảm sự vô trùng tuyệt đối vì vậy cần phải sử dụng một số hóa chất sát trùng để hạn chế và ngăn ngừa vi khuẩn Tùy theo chất lượng hóa chất sử dụng nhiều hay ít sao cho hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men Khi dùng formalin hay fluosilicac natri thì nồng độ không vượt quá 0,02% so với dịch lên men

Bảng1.8 :Ảnh hưởng của một số acid tới nấm men

Chất

Nồng Độ Ngừng sinh

trưởng

tê liệt

Acid clohidric 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46

Acid sulfuric 0,34 0,039 1,30 0,132 2,04

Acid phosphoric 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28

Acid acetic 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25

Acid lactic 0,40 0,100 3,00 0,333 1,27

Ngoài các chất kể trên trong dịch đường lên men luôn chứa một lượng furforol, melanoidin ảnh hưởng ít đến nấm men

♦ Furforol: có nhiều trong mật rỉ, khoảng 6÷ 8 mg/100g chất khô Nhưng nếu

pha loãng đến nồng độ 20 ÷ 22% thì nổng độ furforol khoảng 1,5÷ 2,0 mg/100ml hay 0,015 ÷ 0,02% thì ảnh hưởng của furforol xem như không đáng kể

♦ Melanoidin: chỉ ảnh hưởng trong quá trình nhân giống của nấm men

Melanoidin không hấp thu trên bề nặt của nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ làm nhiều tế bào bị chết