NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN Lactobacillus fermentum BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẤY PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO

HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN Lactobacillus fermentum BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤY PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO Họ và tên : Đào Thị Minh Ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN

Lactobacillus fermentum BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤY

PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO

Họ và tên : Đào Thị Minh Nguyệt

Ngành : Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và dinh dưỡng người

Niên khóa : 2013 – 2017

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 05 năm 2017

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN

Lactobacillus fermentum BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤY

PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO

Tác giả

ĐÀO THỊ MINH NGUYỆT

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm và dinh dưỡng người

Giáo viên hướng dẫn:

TS DƯƠNG THỊ NGỌC DIỆP

TS VŨ THỊ LÂM AN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 05 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi

đã nhận được sự giúp đỡ tận tình từ quý thầy cô, các anh chị và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa cùng quý thầy cô trong khoa Công nghệ thực phẩm đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản trong suốt 4 năm học Những kiến thức này là nền móng vững chắc để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu và phục vụ cho công việc trong thời gian tới

Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến TS Dương Thị Ngọc Diệp và TS Vũ Thị Lâm

An đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài Cảm ơn các thầy cô, anh chị và tập thể mọi người trong phòng Thực Hành Vi Sinh, phòng Kỹ Thuật Thực Phẩm khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ về cơ sở vật chất, trang thiết bị và chỉ bảo tôi khi thực hiện

đề tài nghiên cứu tại đây

Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ tôi để tôi có thể hoàn thành đề tài này

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 05 năm 2017

Đào Thị Minh Nguyệt

TÓM TẮT

Lactobacillus fermentum đã được phân lập từ hạt ca cao lên men Vi khuẩn này

được đánh giá là có tác động tốt đối với chất lượng hạt ca cao sau lên men Việc bổ sung giống khởi động có ý nghĩa đối với quá trình lên men ca cao, nhằm hạn chế và khắc phục tác động của một số điều kiện ảnh hưởng không tốt đối chất lượng hạt ca cao sau lên men Nhằm thuận tiện cho việc bổ sung giống khởi động trong lên men thực phẩm, các loại chế phẩm vi sinh thường được sử dụng để thay thế cho sinh khối tươi Sấy phun là một trong những phương pháp vi bao tạo các chế phẩm vi sinh đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất các loại chế phẩm vi bao hiện nay

Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích tạo ra chế phẩm vi bao vi khuẩn

Lactobacillus fermentum bằng phương pháp sấy phun tạo điều kiện thuận lợi cho việc

bổ sung giống khởi động hỗ trợ quá trình lên men ca cao đạt hiệu quả Quá trình thực hiện bao gồm 5 thí nghiệm nhằm xác định loại chất vi bao (tinh bột acetate và maltodextrin), tỉ lệ chất vi bao (10%, 15%, 20% và 25%), và nhiệt độ sấy phun đầu vào (100 oC, 110 oC, 120 oC và 130 oC) thích hợp với L fementum, đảm bảo khả năng

sống sót sau khi sấy phun Đồng thời, xác định tỉ lệ sống sốt của vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản Cuối cùng so sánh khả năng sinh acid lactic của chế phẩm sau 30 ngày bảo quản với sinh khối tươi khi được bổ sung vào quá trình lên men ca cao và ca cao lên men tự nhiên trong quy mô phòng thí nghiệm

Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tiến hành vi bao L fermentum với dịch tạo

màng chứa 20% maltodextrin, nhiệt độ sấy phun đầu vào là 100 oC thì tỉ lệ sống sót của vi khuẩn đạt 25,76% Sau 30 ngày được bảo quản tại 4±1 oC, tỉ lệ sống sót của

L fermentum trong chế phẩm là 76,71% Khi bổ sung chế phẩm sau 30 ngày bảo quản

và sinh khối tươi vào quá trình lên men ca cao, sau 3 ngày hàm lượng acid lactic trung bình trong hạt ca cao lên men tương đương nhau lần lượt là 0,645% và 0,654% (không

có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê, p < 0,05) Như vậy, chế phẩm tạo thành có thể thay thế cho sinh khối tươi trong việc bổ sung giống khởi động trong quá trình lên men ca cao

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH HÌNH ẢNH vii

DANH SÁCH BẢNG BIỂU viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về ca cao 3

2.1.1 Giới thiệu 3

2.1.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi 4

2.1.3 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men 5

2.1.4 Những biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao 7

2.2 Vi khuẩn lactic 8

2.2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 8

2.2.2 Lactobacillus fermentum 10

2.3 Vi bao và phương pháp sấy phun 11

2.3.1 Giới thiệu 11

2.3.2 Phương pháp sấy phun 12

2.3.2.1 Nguyên lý của quá trình sấy phun 12

2.3.2.2 Cấu tạo hệ thống sấy phun 12

2.3.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp sấy phun 14

2.3.3 Một số vật liệu vi bao 15

2.3.3.1 Gelatin 15

2.3.3.2 Alginate 15

2.3.3.3 Xanthan gum 16

2.3.3.4 Tinh bột acetate 16

2.3.3.5 Maltodextrin 17

2.3.3.6 Whey protein 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19

3.2 Vật liệu nghiên cứu 19

3.2.1 Nguyên liệu 19

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 19

3.2.3 Hóa chất sử dụng 20

3.3 Nội dung thí nghiệm 21

3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp 22

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất vi bao trong dung dịch sấy phun đến khả năng sống sót của L fermentum sau khi sấy phun 23

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến sự sống sót của L fermentum sau khi sấy phun 24

3.4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót của L fermentum trong thời gian bảo quản chế phẩm 25

3.4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic của chế phẩm 25

3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp cho vi khuẩn L fermentum 27

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất vi bao trong dung dịch sấy phun đến khả năng sống sót của L fermentum sau khi sấy phun 28

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến sự sống sót của L fermentum sau khi sấy phun 30

4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót của L fermentum trong thời gian bảo quản chế phẩm 32

4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic của chế phẩm 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 43

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cây cao cao 3

Hình 2.2 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men 6

Hình 2.3 Biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao 7

Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lạc và kết quả nhuộm gram của L fermentum 10

Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo máy sấy phun 13

Hình 2.6 Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic 14

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm sấy phun dịch vi khuẩn Lactobacillus fermentum 21

Hình 4.1 Tỉ lệ sống sót của L fermentum, ẩm độ của, hiệu suất thu hồi chế phẩm khi sử dụng TB acetate và MD làm chất vi bao 27

Hình 4.2 Tỉ lệ sống sót của L fermentum, ẩm độ, hiệu suất thu hồi của chế phẩm khi thay đổi tỉ lệ MD bổ sung vào dịch sấy phun 29

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đối với khả năng sống sót của L fermentum sau khi sấy phun, ẩm độ và hiệu suất thu hồi chế phẩm 31

Hình 4.4 Mật độ vi khuẩn L fermentum trong chế phẩm sau 30 ngày bảo quản lạnh

32

Hình 4.5 Vi ảnh SEM của Maltodextrin, chế phẩm sấy tại 100 oC ở ngày thứ 1 và ngày thứ 30 được bảo quản lạnh 35

Hình 4.6 Vi ảnh SEM của mẫu chế phẩm khi sấy ở 100 oC và 130 oC 36

Hình PL 2 Mật độ vi khuẩn L fermentum khi nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng trong 32 giờ 44

Bảng PL 6.3.1 Mật độ vi khuẩn L fermentum trước và sau khi sấy phun khi thay đổi

nhiệt độ sấy đầu vào 50

Bảng PL 6.3.2 Ẩm độ và hiệu suất thu hồi của chế phẩm vi bao khi thay đổi nhiệt độ

sấy đầu vào 51

Bảng PL 6.4.1 Kết quả chuẩn độ acid hạt ca cao lên men (% acid lactic) 52

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cây ca cao đã trở thành cây trồng chuyên canh ở nhiều vùng của nước

ta Tuy nhiên, các nông hộ chỉ tập trung nghiên cứu kỹ thuật nâng cao năng suất cây trồng, các vấn đề về kỹ thuật lên men nhằm nâng cao và ổn định chất lượng hạt ca cao còn nhiều hạn chế Hiện nay, quá trình lên men cao cao diễn ra một cách tự nhiên, nhưng do điều kiện thời tiết, khí hậu cũng như hệ vi sinh vật trong quá trình lên men

mà thành phần, chất lượng hạt ca cao có thể bị thay đổi, quá trình lên men không ổn định: hạt ca cao lên men thường có hàm lượng acid cao, chất lượng liquor (nguyên liệu làm chocolate) bị đánh giá là chua Trong nghiên cứu của Schwan và Wheals (2004); Vương Thanh Tùng (2006) đã có kết luận về ảnh hưởng lớn của điều kiện thời tiết trong quá trình lên men đến chất lượng hạt ca cao sau lên men và chất lượng của các sản phẩm chế biến từ ca cao Hạt ca cao lên men trong điều kiện tự nhiên có chất lượng chấp nhận được nhưng không đồng đều giữa các lớp trong khối ủ và giữa các

giống khởi động trong quá trình lên men ca cao vẫn còn hạn chế, đặc biệt là bổ sung vi khuẩn lactic

Việc bổ sung giống khởi động trong các sản phẩm lên men đã và đang được ứng dụng một cách rộng rãi Các giống khởi động này có thể là chủng vi sinh vật tươi hoặc các chế phẩm có chứa vi sinh vật Tuy nhiên, để thuận tiện cho việc lưu trữ, bảo quản các chủng vi sinh vật cũng như thuận tiện cho việc ứng dụng trong quy mô sản xuất lớn, người ta thường sử dụng các loại chế phẩm đã được sản xuất từ trước Vi bao là một công nghệ thuận lợi cho việc lưu trữ và cung cấp các chủng vi khuẩn Trong số các kỹ thuật vi bao, sấy phun dường như là một lựa chọn tốt cho sản xuất quy mô lớn các chế phẩm dạng bột có chứa các chủng vi khuẩn với độ ẩm thấp Tính ổn định của các chủng vi khuẩn trong chế phẩm cao hơn các chủng đông lạnh hoặc tươi (Zhao và ctv, 2008; Peighambardoust và ctv, 2011) và có khả năng lưu trữ ở nhiệt độ phòng (Chávez và Ledeboer, 2007; Oliveira và ctv, 2007)

Nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng giống khởi động, hỗ trợ, nâng cao hiệu quả của quá trình lên men ca cao, đề tài “Nghiên cứu chế phẩm vi bao vi khuẩn

Lactobacillus fermentum bằng phương sấy phun nhằm hỗ trợ quá trình lên men ca

cao” được tiến hành

1.2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu tạo chế phẩm vi bao chứa vi khẩn Lactobacillus fermentum bằng

phương pháp sấy phun Từ đó, bước đầu khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm đến hạt ca cao lên men nhằm định hướng lâu dài trong việc ứng dụng chế phẩm hỗ trợ việc bổ sung giống khởi động giúp quá trình lên men ca cao đạt hiệu quả

1.3 Nội dung đề tài

Để hoàn thành mục tiêu đề ra, quá trình thực hiện đề tài bao gồm các nội dung:

- Xác định vật liệu chất mang thích hợp đối với vi khuẩn L fermentum và tỉ lệ

hoang dại được phát hiện cách đây khoảng 3000 năm tại Trung Mỹ và Mexico

Hình 2.1 Cây cao cao

Theo báo điện tử Bộ Nông nghiệp và PTNT (2015), từ năm 2004, nước ta đã có chương trình phát triển diện tích trồng cây ca cao 50.000 ha đến năm 2020, trong đó diện tích cây cho trái là 42.000 ha với năng xuất trung bình 1,2 tấn/ha Từ khi có chủ chương của Nhà nước, diện tích trồng ca cao tăng từ 1.218 ha (năm 2004) lên trên 20.000 ha (năm 2011), thu hút tổng số nông dân tham gia khoảng 35.000 người

Theo ông Nguyễn Vinh Thành, chuyên gia phân tích về ca cao của tập đoàn Cargill tại Hà Lan, sản lượng ca cao toàn cầu những năm qua không tăng nhiều do bất

ổn ở những nước sản xuất ca cao hàng đầu như Bờ Biển Ngà bị giảm sản lượng khoảng 38%, Ghana giảm khoảng 19% Trong khi đó, nhu cầu sử dụng hạt ca cao trên thế giới vẫn tăng, dẫn đến tình trạng cung không đủ cầu, đặc biệt là các nước như

Brazil, Nga, Ukraina… Có thể nói, đây là cơ hội cho Việt Nam phát triển diện tích và sản lượng ca cao

Ông Nguyễn Văn Hoà, phó cục trưởng cục trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và PTNT) cho biết, cây ca cao ở Việt Nam đã khôi phục và phát triển từ khi có sự hỗ trợ của dự

án quốc tế Success alliance từ vài chục ha năm 2000 tăng lên 7.320 ha năm 2006, tăng lên 11.400 ha vào cuối năm 2007 và dự kiến đến 2015 đạt 60.000 ha Trong đó, có gần 1.000 ha đang cho thu hoạch, năng suất ban đầu đạt bình quân 0,8 tấn/ha, ước tính sản lượng đạt 773 tấn Nhiều mô hình trồng ca cao đạt năng suất từ 1,5 tấn đến hơn 2 tấn hạt khô/ha như: hộ ông Trần Hùng Sơn, xã Phú Đức, huyện Châu Thành (Bến Tre), hộ ông Đào Văn Tuấn, xã Dăk Rla, huyện Đăkmil (Đăk Nông)

2.1.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi

Thành phần cấu tạo của quả ca cao gồm có: vỏ quả và cùi trụ chiếm 60% và hạt tươi chiếm 40% khối lượng quả, trong đó khoảng 0,2% là lớp cơm nhầy bao quanh hạt

ca cao Bảng 2.1 thể hiện thành phần của hạt ca cao tươi

Bảng 2.1 Các thành phần của hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi

(Mucilage/Sweating)

Vỏ hạt (Shell/Testa)

Phôi nhũ (Cotyledon/Kernel)

Nhìn chung, nước và glucose chiếm chủ yếu trong lớp cơm nhầy ca cao Thành phần chủ yếu của vỏ hạt là tinh bột Trong phôi nhũ, chứa khá nhiều thành phần Bao gồm cả theobromine, polyphenol và enzyme mà ở phần cơm nhầy và vỏ hạt hầu như không có

2.1.3 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men

Trong quy trình sản xuất hạt ca cao lên men, lên men là một trong những giai đoạn quan trọng nhất, nhằm thủy phân phần cơm bao bọc xung quanh hạt và làm chết mầm hạt ca cao Tại giai đoạn này các phản ứng sinh hóa diễn ra mãnh liệt để giảm vị đắng, chát, tạo ra tiền chất cho hương vị chocolate (amino acid, đường khử, polyphenol…), bên cạnh đó còn tạo ra các nguyên liệu cho quá trình biến đổi sinh hóa

về chất lượng trong các giai đoạn phơi sấy, bảo quản, rang và chế biến chocolate Hình 2.2 mô tả khái quát về quy trình sản xuất hạt ca cao lên men tự nhiên

Hình 2.2 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men

Theo Schwan và ctv (2004), lớp cơm nhầy hạt ca cao là môi trường thích hợp cho

sự phát triển của vi sinh vật bởi nó chứa 82-87% nước, 10-15% đường, 2-3% pentosan, 1-3% acid citric, 1-1,5% pectin Chính vì vậy, ngay từ khi bóc vỏ quả, lớp cơm nhầy đã nhiễm nhiều loại vi sinh vật Nhìn chung, quá trình lên men hạt ca cao là một chuỗi các quá trình lên men nối tiếp nhau thể hiện qua sự biến động về mật độ của một số nhóm vi sinh vật mà chủ yếu là nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic

Hạt ca cao

đã LM

2.1.4 Những biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao

Lên men ca cao xảy ra qua hai giai đoạn chính:

 Giai đoạn 1: lên men lớp nhầy bao quanh hạt làm cho đường chuyển thành rượu và acid Trong giai đoạn này lớp nhầy được lên men nhờ vào các vi sinh vật làm cho lớp nhầy bị phân hủy, từ đó không khí xâm nhập vào khối

ca cao

 Giai đoạn 2: lượng acid tạo thành thấm vào bên trong hạt ca cao gây ra các phản ứng sinh hóa, làm giảm vị đắng chát, tạo thành các tiền chất, hương vị cho ca cao

Hình 2.3 Biến đổi sinh hóa trong lên men hạt ca cao

Bắt đầu quá trình lên men là quá trình phân giải yếm khí lớp cơm nhầy chứa 10-15% đường, 1,5% peptin và pH thấp, tạo điều kiện cho nấm men phát triển mạnh Trong 48 giờ đầu của quá trình lên men yếm khí không bắt buộc, các phản ứng sinh hóa chủ yếu là chuyển hóa đường trong cơm nhầy thành C2H5OH, CO2, năng lượng và một số sản phẩm khác nhờ nấm men

Sự chuyển hóa trên tạo điều kiện yếm khí cho phép sự phát triển của các vi khuẩn

Lactobacillus, chủ yếu là L plantarum, L collinoides và L fermentum, các vi khuẩn

này cũng tham gia vào quá trình phân hủy đường trong cơm nhầy Sản phẩm tạo thành

là acid lactic (theo con đường lên men đồng hình), tạo acid lactic, acid acetic và một số acid hữu cơ khác (theo con đường lên men dị hình) Vi khuẩn acetic oxy hóa C2H5OH tạo acid acetic

Các acid sinh ra nhiều, nồng độ C2H5OH cao và nhiệt độ cao sẽ ức chế sự phát triển của nấm men, phá vỡ thành tế bào, diệt chết phôi mầm Sau khi phôi mầm chết một số enzyme như lipase, protease…, có trong phôi mầm sẽ di chuyển vào bên trong nội nhũ, trong nội nhũ có 2 loại tế bào quan trọng là tế bào dự trữ chất béo, protein và

tế bào chứa các hợp chất polyphenolic và methylxanthine (là sự kết hợp của theobromine và caffeine) Khi thành tế bào bị phá vỡ, thì các hợp chất bên trong có điều kiện tiếp xúc với nhau, dưới tác dụng của enzyme thì các phản ứng sinh hóa đã xảy ra, sản phẩm của quá trình sinh hóa này là amino acid, đường khử, polyphenol, sau

đó các hợp chất này kết hợp với nhau thông qua phản ứng Maillard, phản ứng Caramel hóa hình thành hương vị đặc trưng chocolate (Stephen, 2009 - Trích dẫn bởi Nguyễn Tiến Thành, 2014)

Trong quá trình lên men, polyphenol bị oxy hóa tạo ra sắc tố nâu trong ca cao Các anthocyanin nhanh chóng thủy phân tạo cyanidin và đường dưới tác dụng của enzyme glucosidase để tạo nên màu nâu của quinnon Theo Schwan và ctv (1995), sau lên men các hợp chất trên còn lại 20%, có lợi đối với sức khỏe con người

2.2 Vi khuẩn lactic

2.2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Năm 1857, Louis Pasteur đã chứng

minh rằng việc lên men sữa là kết quả hoạt động của nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là

vi khuẩn lactic Năm 1887, Joseph Lister phân lập thành công loài vi khuẩn lactic

thuần khiết đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus

lactis)

Vi khuẩn lactic ít gặp trong đất và nước, thường phát triển trong môi trường có chất hữu cơ phức tạp như sữa và các sản phẩm từ sữa, thịt và các sản phẩm từ thịt, trong bia, rượu vang và trong rau quả muối chua Ngoài ra vi khuẩn lactic còn được tìm thấy trên da, nước bọt, niêm mạc và hệ tiêu hóa của người và một số động vật

Theo Kiều Hữu Ảnh (2010), hiện nay các loài vi khuẩn thuộc 12 chi được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic do khả năng tạo thành một lượng lớn acid lactic từ hydrate

carbon Trong đó, các loài thuộc 5 chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,

Streptococcus, Lactococcus được sử dụng làm giống khởi động trong quá trình lên

men thực phẩm Một số đặc điểm của các chi này được mô tả bởi Vos và ctv (2009):

 Lactobacillus: gồm một nhóm không đồng nhất của các vi khuẩn hình

que Gram dương, tế bào thay đổi từ trực khuẩn rất ngắn đến rất dài, thường không di động, không sinh bào tử, kỵ khí bắt buộc Nhiệt độ sinh trưởng dao động từ 2-50 oC, nhiệt độ tối ưu thường là 30-40 oC pH tối ưu thường từ 5,5-6,2

 Leuconostoc: tế bào có hình cầu thường kéo dài, xếp thành cặp hoặc

chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc Mặc dù có thể sinh trưởng ở pH 4,5 nhưng các loài thuộc chi này không

ưa acid, thích pH trung bình ban đầu là 6,5 Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 20-30 oC, nhưng có thể phát triển ở 5 o

C

 Pediococcus: là vi khuẩn Gram dương Các tế bào của các đại diện điển

hình không di động, thỉnh thoảng có hình trứng và chia thành các cặp hoặc chia theo hai hướng vuông góc tạo thành bốn tế bào một nhưng không bao giờ xếp thành chuỗi Tăng trưởng ở pH 5 và không tăng trưởng ở pH 9, ngoại trừ

Pediococcus stilesii Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 25-35 oC, nhưng phụ thuộc vào loài

 Streptococcus: tế bào thường có hình cầu hoặc hình bầu dục, có đường kính dưới 2 μm, xếp theo chuỗi hoặc theo cặp khi nuôi trong môi trường lỏng

Các tế bào vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc Nhiệt độ tối ưu thường khoảng 37 o

C, nhưng nhiệt độ tối đa và tối thiểu khác nhau giữa các loài

 Lactococcus: các tế bào có hình cầu hoặc hình trứng tròn, đứng riêng lẻ,

thành cặp hoặc chuỗi và thường kéo dài chuỗi Đây là vi khuẩn Gram dương, không di động, từ kỵ khí không bắt buộc đến kỵ khí bắt buộc Tăng trưởng ở

10 oC nhưng không tăng trưởng ở 45 o

C

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa carbohydrate thành acid lactic nhờ hoạt

động sống của vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic Có 2 kiểu lên men lactic chính

là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình

- Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men bởi các vi khuẩn lactic đồng

hình, có khả năng phân hủy đường theo con đường đơn giản và cho sản

phẩm chủ yếu là acid lactic (80-90%)

- Lên men lactic dị hình là quá trình lên men do vi khuẩn lactic dị hình

Chúng phân hủy đường thành acid lactic và hàng loạt các sản phẩm khác

nhau chiếm tỉ lệ khá cao: acid lactic (40%), ethanol (20%), acid acetic

(10%), các chất khí còn lại (20%) (Yuan, 1999 - Trích dẫn bởi Trần Thị Ái

Liên, 2011)

2.2.2 Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus Là vi

khuẩn Gram dương, có hình que, kích thước thường thay đổi, thường là ngắn, 0,5-1,0 x 3,0-15,0 μm, đôi khi xếp thành cặp hoặc chuỗi

Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lạc (a) và kết quả nhuộm gram (b) của L fermentum

Nhiệt độ phát triển: nhiệt độ tối ưu từ 37-42 oC, nhiệt độ thấp nhất từ 15-18 oC,

nhiệt độ cao nhất từ 48-50 oC

Theo Wood và Holzapfel (1995), L fermentum được xếp vào loại lên men dị hình

bắt buộc Thường lên men tạo acid từ D-Ribose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose,

D-Maltose, D-Lactose, D-Melibiose, D-Sucrose, D-Trehalose, D-Raffinose (Abramov,

2014 – Trích dẫn bởi Lehri và ctv, 2017)

Nghiên cứu của Võ Thị Mỹ Lộc và ctv (2013) đã cho thấy, trong điều kiện lên men tự nhiên, mẫu có chất lượng hạt ca cao tốt nhất sau khi lên men là mẫu có số lượng vi khuẩn lactic cao nhất Trong đó nhóm vi khuẩn lactic chiếm chủ yếu là

L fermentum đã được phân lập và định danh

2.3 Vi bao và phương pháp sấy phun

Sấy phun là một trong những kỹ thuật đóng gói lâu đời và được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm Sự phát triển của các thiết bị và kỹ thuật sấy phun phát triển qua một thời gian vài thập kỷ, từ năm 1870 đến năm 1900 Trong ngành công nghiệp thực phẩm, sấy phun là phương pháp vi bao phổ biến nhất, vì nó là được coi là có hiệu quả cao và chi phí hợp lý (Gharsallaoui và ctv, 2007) Đây là một quá trình liên tục Quá trình này có thể sản xuất các loại bột tinh khiết và tốt nhất với

độ vô trùng cao (Menshutina và ctv., 2010) Kỹ thuật sấy phun đã được áp dụng rộng rãi trong đóng gói vi khuẩn probiotic, nơi các vi sinh vật vượt qua thành công điều kiện nhiệt độ đột ngột (Riveros và ctv 2009; Boza và ctv, 2004 - Trích dẫn bởi Duong Thi Ngoc Diep, 2013)

Theo Anadharamakrishnan và ctv (2015), thông thường, khi tiến hành vi bao các chủng vi sinh vật, phải chọn các tế bào ở giai đoạn tăng trưởng hoặc giai đoạn cân bằng Điều này góp phần tăng khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình vi bao

2.3.2 Phương pháp sấy phun

2.3.2.1 Nguyên lý của quá trình sấy phun

Sấy phun là phương pháp sấy giúp chuyển trạng thái của nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng bột khô Trong quá trình sấy phun, dịch nguyên liệu được hệ thống vòi phun phân tán thành các hạt ẩm cho tiếp xúc với luồng không khí nóng trong buồng sấy với thời gian ngắn (Patel và ctv, 2009)

Theo Lê Văn Việt Mẫn (2011), quá trình sấy phun gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: chuyển nguyên liệu cần sấy thành dạng sương mù (các hạt lỏng phân tán trong môi trường không khí) nhờ cơ cấu phun sương trong thiết bị sấy phun Kích thước của các giọt lỏng sau giai đoạn phun sương dao động khoảng 10-200 μm

- Giai đoạn 2: hòa trộn sương mù với tác nhân sấy trong buống sấy Đây chính là giai đoạn tách ẩm ra khỏi nguyên liệu Do nguyên liệu được phun sương nên diện tích tiếp xúc giữa bề mặt các giọt lỏng và tác nhân sấy là rất lớn Nhờ

đó, ẩm trong nguyên liệu được bay hơi nhanh chóng Sản phẩm tạo thành ở dạng bột mịn Thời gian tách ẩm diễn ra trong khoảng từ vài giây đến vài chục giây

- Giai đoạn 3: tách sản phẩm ra khỏi dòng tác nhân sấy Người ta có thể sử dụng hệ thống “Cyclon”, túi lọc hoặc phương pháp kết tủa trong môi trường tĩnh điện, phổ biến nhất là sử dụng “Cyclon”

2.3.2.2 Cấu tạo hệ thống sấy phun

Các hệ thống sấy phun hiện nay bao gồm: tác nhân sấy (không khí sấy), caloriphe

để gia nhiệt cho tác nhân sấy, vòi phun, buồng sấy, hệ thống cyclon thu hồi sản phẩm, quạt hút

Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của hệ thống sấy phun

 Buồng sấy

Buồng sấy là nơi vật liệu sấy (các hạt ẩm) tiếp xúc với tác nhân sấy (không khí nóng) Buồng sấy có thể có nhiều dạng khác nhau nhưng phổ biến nhất là buồng sấy hình trụ đứng, buồng sấy hình côn với góc côn (2α) 50-60o Kích thước buồng sấy được thiết kế phụ thuộc vào kích thước và quỹ đạo chuyển động của các hạt từ cơ cấu phun sương tạo ra (Westergaard, 2004)

 Hệ thống thu hồi sản phẩm

Các hạt bột sau khi được sấy khô trong buồng sấy sẽ bị hút theo dòng không khí đến hệ thống “Cyclon” bởi tác dụng của quạt hút Hệ thống “Cyclon” được thiết kế để hướng dòng không khí di chuyển theo kiểu xoáy ly tâm Các hạt bột va chạm với thành thiết bị sẽ rơi xuống và được thu hồi Dòng không khí sẽ được quạt hướng dòng đến bộ phận gia nhiệt, tách ẩm và tuần hoàn lại vào buồng sấy

 Quạt

Hệ thống sấy phun được trang bị hai quạt uạt chính được đặt sau hệ thống

“Cyclon” thu hồi sản phẩm, có tác dụng tạo lực hút dòng không khí có chứa sản phẩm bột sấy đi qua hệ thống “Cyclon” để phân tách khí thải và thu hồi sản phẩm uạt phụ đặt trước thiết bị gia nhiệt không khí trước khi vào buồng sấy, có tác dụng tạo lực đẩy không khí đến thiết bị gia nhiệt và vào buồng sấy

Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic (Hình 2.3) có cơ cấu phun sương dạng vòi phun cơ khí, hoạt động nhờ áp lực khí nén, được sử dụng trong nghiên cứu này

Hình 2.6 Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic

2.3.2.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp sấy phun

Theo Keshani và ctv (2015); Roustapur và ctv (2006), phương pháp sấy phun có các ưu và nhược điểm

 Ưu điểm

- Thời gian sấy nhanh hơn so với các phương pháp sấy tạo sản phẩm bột khác

- Ẩm độ và hoạt độ nước của sản phẩm thấp, có khả năng bảo quản tốt

- Thòi gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhân sấy trong thiết bị rất ngắn,

 Nhược điểm

- Không thể sử dụng cho mẫu nguyên liệu có độ nhớt quá cao

- Tính linh động trong sản xuất thấp vì mỗi thiết bị sấy phun thường được thiết

kế để sản xuất một số sản phẩm với tính chất và chỉ tiêu đặc thù riêng

2.3.3 Một số vật liệu vi bao

2.3.3.1 Gelatin

Gelatin là sản phẩm thu được từ sự thủy phân có giới hạn collagen, chứa 18 loại amino acid khác nhau trừ tryptophan và cysteine Gelatin là chất rắn dạng miếng, bột, vảy… không mùi, có màu từ vàng nhạt đến trắng Chúng có thể hấp thu một lượng nước gấp 5-10 lần khối lượng của nó Khi gia nhiệt, gelatin sẽ hydrate hóa nhanh chóng chuyển thành dạng dung dịch Gelatin có khả năng tạo màng phim bền chắc ngay cả khi màng phim rất mỏng đến 100 μm

Trong công nghiệp thực phẩm, gelatin là một trong những loại keo ưa nước có thể dùng làm tác nhân tạo gel, tạo độ đặc hay ổn định cấu trúc Khả năng tạo gel là một trong những tính chất chức năng quan trọng của gelatin và nó phụ thuộc vào nhiệt độ

Độ bền gel này được biểu thị bằng độ Bloom, chỉ số này càng cao độ bền gel càng lớn Ngoài ra, gelatin được biết đến như là môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật Đây là vật liệu rẻ tiền, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào, không độc, dễ dàng bị thủy giải trong môi trường dạ dày-ruột giải phóng tế bào Tuy nhiên, gelatin dễ tan chảy ở 40 oC gây ảnh hưởng đến quá trình sấy khô vi bao (Lê Quan Nghiệm và ctv,

2007 - Trích dẫn bởi Đỗ Quốc Cường, 2009)

2.3.3.2 Alginate

Alginate là muối của acid alginic, là một polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh được chiết suất từ tảo nâu Cấu tạo hóa học của alginate gồm hai phân tử β-D-mannuronate và α-L-guluronate được liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glucozit Alginate có tính acid yếu, không màu, không mùi, có tính ưa nước và tính tương hợp sinh học cao, rẻ tiền Tính chất quan trọng của alginate là độ nhớt và khả năng tạo gel Ứng dụng thương mại của alginate trong thực phẩm đòi hỏi sự hình thành của một mạng gel liên tục Các cation như Ca2+, Na+ thúc đẩy sự hình thành gel mà không cần gia nhiệt Đồng thời điểm nóng chảy của gel cũng tăng theo độ mạnh của các ion Khi Na được thay thế bằng Ca, mỗi ion Ca2+

sẽ phối hợp với hai chuỗi alginate, liên

kết chúng lại với nhau Cấu trúc linh hoạt sẽ kém linh hoạt hơn và tạo thành một mạng lưới liên kết khổng lồ - một loại gel

2.3.3.3 Xanthan gum

Xanthan gum là một polysaccharide tự nhiên và là một polymer sinh học công nghiệp quan trọng Nó được phát hiện vào năm 1950 tại phòng thí nghiệm nghiên cứu khu vực phía Bắc của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (Margaritis và Zajic, 1978)

Đây là một heteropolysaccharide với một cấu trúc cơ bản gồm các đơn vị pentasaccharide lặp đi lặp lại hình thành bởi hai đơn vị glucose, hai đơn vị mannose,

và một đơn vị acid glucuronic Dung dịch của xanthan thu được bằng cách hòa tan ở nhiệt độ trung bình có xu hướng có độ nhớt cao Nhiệt độ hòa tan ảnh hưởng lớn đến

độ nhớt bằng cách kiểm soát cấu tạo phân tử và sự xuất hiện của cấu trúc được yêu cầu Các phân tử xanthan dường như có hai hình dạng, xoắn và cuộn ngẫu nhiên, tùy thuộc vào nhiệt độ hòa tan (Horton và ctv, 1985)

Xanthan gum hòa tan cao trong cả nước lạnh và nóng Dung dịch xanthan có độ nhớt cao ngay cả ở nồng độ polymer thấp Các tính chất này rất hữu ích trong nhiều ứng dụng công nghiệp, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm, nơi xanthan được sử dụng như một chất làm đặc, và để ổn định huyền phù và nhũ tương (García-Ochoa và ctv, 2000)

2.3.3.4 Tinh bột acetate

Thành phần chính của tinh bột bao gồm amylose và amylopectin Tỉ lệ amylose thường khoảng 15-25% Ngoài amylose và amylopectin, hạt tinh bột còn chứa một số thành phần nhỏ như protein, lipid, các chất vô cơ và polysaccharides không tinh bột Phân tử amylose có xu hướng tự định hướng theo kiểu song song và chặt chẽ đủ để cho phép liên kết hydro giữa các chuỗi liền kề Điều này dẫn đến việc giảm ái lực của polymer cho nước, do đó các dung dịch trở nên mờ đục Amylopectin không có tính di động tốt trong dung dịch do kích thước lớn của nó và tính chất phân nhánh (Liu, 2005

- Trích dẫn bởi Duong Thi Ngoc Diep, 2013)

Tinh bột tự nhiên không thuận lợi cho các ứng dụng trong thực phẩm do nhiều hạn chế như không tan trong nước lạnh, mất nhớt và dày lên sau khi nấu ăn Để khắc phục những thiếu sót này, tinh bột có thể bị biến đổi về mặt hóa học hoặc vật lý Các

bao gồm ester hóa và ether hóa Tinh bột biến tính bằng acid có độ bền màng cao, thích hợp trong việc ứng dụng đặc tính tạo gel, tạo màng cho sản phẩm Độ bền gel của tinh bột tăng lên bằng cách hiệu chỉnh điều kiện sản xuất Vì vậy nếu dưới điều kiện thường mà sự biến đổi được tiến hành với H2SO4 0,1N thì sẽ tạo thành tinh bột biến tính có độ bền gel lớn (Chen và ctv, 1999)

Tinh bột acetate được tạo ra bằng cách cho phản ứng tinh bột với acetic anhydride hoặc vinyl acetate Tinh bột này được báo cáo là có khả năng tạo thành liên kết tuyệt vời, thích hợp cho ứng dụng tạo màng bao Hiện nay, tinh bột acetate đã được tổng hợp, mô tả và đánh giá như là một tác nhân vi bao (Chowdary và ctv, 2011)

2.3.3.5 Maltodextrin

Theo định nghĩa của cơ quan thực phẩm và thuốc của Hoa Kỳ, maltodextrin là một polysaccharide thu được bằng cách thủy phân một phần tinh bột (bằng enzyme hoặc acid), dạng bột màu trắng, dễ hút ẩm, thường hòa tan trong nước Cấu trúc của nó bao gồm nhiều đơn vị glucose liên kết bởi các liên kết α: 1 → 4 glycosidic Số lượng các đơn vị glucose là một biến quyết định mức đương lượng dextrose (DE) Thông thường maltodextrin có đương lượng dextrose từ 4 đến 20

Nhìn chung, maltodextrin được xác nhận như là một chất vi bao tốt cũng như một prebiotic vừa phải cho sự tồn tại cao của chế phẩm sinh học (Cortés-Arminio và ctv, 2010) Protein (đạm đậu nành và whey protein) thường được sử dụng như là chất phụ trợ cùng với maltodextrin theo tỷ lệ quy định để cải thiện vi bao của vi sinh vật được lựa chọn (Chavez và Ledeboer, 2007) Năm 1991, Reineccius đã chỉ ra rằng, dịch tạo màng chứa maltodextrin có DE cao có khả năng thẩm thấu oxi thấp hơn, do đó bảo vệ tốt hơn các thành phần vi bao

Năm 2011, Anekella đã đã sử dụng maltodextrin làm vật liệu vi bao

Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus rhamnosus trong bột mâm xôi bằng

phương pháp sấy phun Kết quả cuối cùng cho thấy, tỉ lệ sống sót của vi khuẩn sau khi sấy phun lên đến 84,33% Kumalaningsih và cộng sự (2011) đã thành công khi vi bao

Lactobacillus sp với dịch chiết của lá chùm ngây cho thực phẩm bổ sung Trong dịch

sấy phun, maltodextrin cũng được bổ sung 15% làm chất hỗ trợ vi bao

2.3.3.6 Whey protein

Whey protein là thuật ngữ mô tả những protein sữa còn lại trong huyết thanh sau

khi kết tủa casein tại pH 4,6 ở khoảng 20 oC Nó chủ yếu là một hỗn hợp của β-lactoglobulin, α-lactalbumin, albumin huyết thanh và globulin miễn dịch với một

điểm đẳng điện ở pH gần 5,0 (Fitzsimons và ctv, 2007)

Whey protein đã được tìm thấy là có đặc tính đóng gói tuyệt vời và cao hơn các

tác nhân thường sử dụng (Young và ctv 1993) Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng whey

protein rất hiệu quả trong việc đóng gói các chất dễ bay hơi, không bay hơi, các phân

cực cũng như không cực, chất lỏng và tinh thể cho thực phẩm và dược phẩm, có thể sử

dụng cho vi bao hòa tan trong nước và không tan trong nước

Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng whey protein làm chất vi bao trong phương pháp

sấy phun Trong nghiên cứu vào năm 2015, Khem đã đề xuất whey protein có thể sử

dụng như là yếu tố cấu trúc và chất mang probiotic Sau quá trình sấy phun (nhiệt độ

đầu vào là 110 oC, nhiệt độ đầu ra gần 70 oC), sự sống của Lactobacillus plantarum

A17 và B21 vẫn đạt 109 cfu/g sau 4 và 8 tuần bảo quản Liêu Mỹ Đông và ctv (2015)

đã kết luận: chế phẩm vi bao bằng phương pháp sấy phun với 10% whey protein và

5 % maltodextrin cho hiệu quả bảo vệ Lactobacillus casei cao

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh, phòng Kỹ Thuật Thực Phẩm khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu

Giống vi khuẩn Lactobacillus fermentum 3872 đã được phân lập từ hạt ca cao lên

men và cung cấp bởi phòng Thí Nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Giống vi khuẩn được hoạt hóa và bảo quản trong ống thạch nghiêng để phục vụ đề tài Sau mỗi một tháng, vi khuẩn sẽ được giữ giống lại để đảm bảo chất lượng của giống trong suốt quá trình nghiên cứu

Maltodextin DE 12 (Ấn Độ) được mua tại cửa hàng hóa chất Bách Khoa, đường

Tô Hiến Thành, quận 10, TP HCM

Tinh bột acetate do công ty TNHH xuất nhập khẩu Nam Bảo Tín, 23/6 đường 26, khu phố 7, phường Linh Đông, quận Thủ Đức, TP.HCM sản xuất và cung cấp

Trái ca cao được cung cấp bởi công ty ca cao Nguyên Lộc, huyện Cẩm Mỹ, thị xã Long Khánh, tỉnh Đồng Nai

 Thiết bị

Cân điện tử 2 số lẻ Ohaus Corp.pine Brook

Máy phân tích ẩm bằng hồng ngoại SHS, Nhật Bản

3.2.3 Hóa chất sử dụng

 Môi trường MRS agar, MRS broth ( Biokar, Pháp)

 Dung dịch NaOH 0,1N ( ống chuẩn NaOH 0,1 N, Việt Nam)

 Phenolphtalein 1%

 Dung dịch nước muối NaCl (0,85%)

TN1: Khảo sát vật liệu

vi bao

3.3 Nội dung thí nghiệm

Quy trình tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun trong nghiên cứu này được

mô tả sơ lược như Hình 3.1 Bao gồm sơ đồ thực hiện và tiến trình thí nghiệm

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm sấy phun dịch vi khuẩn Lactobacillus fermentum

TN2: Khảo sát tỉ lệ bổ

sung vật liệu vi bao

TN3: Khảo sát nhiệt độ

sấy đầu vào

TN4: Theo dõi thời

gian bảo quản chế phẩm

TN5: Thử nghiệm hoạt

tính chế phẩm sau thời gian bảo quản