Sự sản xuất các hợp chất thơm trong quá trình lên men rượu vang bởi saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng của nitơ đồng hóa bởi nấm men lên hai chủng mô hình

Sự sản xuất các hợp chấtthơm trong quá trình lên men ảnh hưởng của nitơ đồng hóa bởi nấm men lên hai chủng mô hình Tóm tắt Sự đóng góp của các chất chuyển hóa lên men nấm men đến hương t

Production of fermentation

aroma compounds by

Saccharomyces cerevisiae

wine yeasts: effects of yeast

assimilable nitrogen on two

model strains

Abstract

The contribution of yeast

fermentation metabolites to the

aromatic profile of wine is well

documented; however, the

biotechnological application of this

knowledge, apart from strain

selection, is still rather limited and

often contradictory Understanding

and modeling the relationship

between nutrient availability and

the production of desirable aroma

compounds by different strains

must be one of the main

objectives in the selection of

industrial yeasts for the beverage

and food industry In order to

overcome the variability in the

composition of grape juices, we

have used a chemically defined

model medium for studying yeast

metabolite production in response

to nitrogen upplementation so as

to identify an appropriate yeast

assimilable nitrogen level for strain

differentiation At low initial nitrogen

concentrations, strain KU1 produced higher

quantities of esters and fatty acids whereas

M522 producedhigher concentrations of

isoacids,γ-butyrolactone, higher alcohols

and 3-methylthio-1-propanol We propose

that although strains KU1 and M522 have a

similar nitrogen consumption profile, they

represent useful models for the chemicalcharacterization of wine strains in relation

to wine quality

Sự sản xuất các hợp chất

thơm trong quá trình lên men

ảnh hưởng của nitơ đồng hóa

bởi nấm men lên hai chủng

mô hình

Tóm tắt

Sự đóng góp của các chất chuyển hóa lên

men nấm men đến hương thơm của rượu

vang là dẫn chứng tốt; Tuy nhiên, việc áp

dụng công nghệ sinh học vào vấn đề này,

ngoài việc lựa chọn chủng vi khuẩn, vẫn

còn nhiều mặt khá hạn chế và mâu thuẫn

Để hiểu và mô hình hóa mối liên hệ giữa

lượng dinh dưỡng và việc sản xuất các hợp

chất hương thơm mong muốn bởi các

chủng khác nhau là một trong những mục

tiêu chính để lựa chọn của ngành công

nghiệp nấm men phục vụ cho các ngành

công nghiệp nước giải khát và thực phẩm

Để khắc phục những biến đổi trong thành

phần của các loại nước ép nho, chúng tôi đã

sử dụng một chủng mô hình xác định về

mặt hóa học cho việc nghiên cứu hoạt động

sinh lý nấm men và sản xuất chất chuyển

hóa, đáp ứng với sự bổ sung đạm để xác

định một mức men nitơ đồng hóa thích hợp

cho các chủng khác nhau Ở nồng độ nitơ

ban đầu thấp, chủng KU1 sản xuất với số

lượng lớn các este và acid béo trong khi

M522 sinh nhiều isoacids,γ-butyrolactone,

rượu và 3-methylthio-1-propanol Chúng

tôi đề xuất rằng mặc dù chủng KU1 và

M522 có lượng tiêu thụ nitơ như nhau,

nhưng chúng tiêu biểu cho mô hình hữu ích

về các đặc tính hóa học của các chủng loại

rượu liên quan đến chất lượng rượu

The differential production of aromacompounds by the two strains is discussed

in relation to their capacity for nitrogenusage and their impact on winemaking Theresults obtained here will help to developtargeted metabolic footprinting methods forthe discrimination of industrial yeasts.

Introduction

The role of yeasts in the fermentation ofsugars into alcohol and carbon dioxide hasbeen known for more than two centuries(Anderson, 1989) However, well over ahalf century elapsed before the role of yeaststrain in the production of different wineswas established by Pasteur in 1866(Pasteur, 1866) While the principal yeastused in today’s food and alcoholic beverageindustries for the production of bread, beer,spirits, cider and wine is classified as

Saccharomyces cerevisiae, it is well

recognized that not all S cerevisiae strains

are suitable for the fermentation processand the ability to produce quality foods andbeverages differs significantly among them.Because classical, physiological and geneticmethods are of limited use in thecharacterization of wine-making yeaststrains, researchers in wine biotechnologyhave been searching for new methods toreveal the genetic adaptations of industrial

yeast strains of the same species, i.e S.

cerevisiae (Pretorius & Hoj, 2005) On the

other hand, it is well established that S.

cerevisiae produces different concentrations

of aroma compounds as a function offermentation conditions and musttreatments, for example, temperature, grapevariety, micronutrients, vitamins andnitrogen composition of the must.Moreover, many commercial yeastsproduce undesirable off-flavors, such as H2

S, and a high concentration of higher

alcohols, acetic acid and ethyl acetate,

depending on the concentration of

Việc sản xuất các hợp chất hương thơm

khác nhau từ hai chủng được thảo luận liên

quan đến khả năng sử dụng nitơ và tác động

đến sản xuất rượu vang Các kết quả thu

được ở đây sẽ giúp phát triển các phương

pháp footprinting trao đổi chất mục tiêu để

phân biệt nấm men công nghiệp

Giới thiệu

Vai trò của nấm men trong quá trình lên

men đường thành rượu và CO2 đã được biết

đến từ hơn hai thế kỷ (Anderson, 1989)

Tuy nhiên, hơn một nửa thế kỷ trôi qua

trước khi vai trò của nấm men trong sản

xuất các loại rượu vang khác nhau được tìm

ra bởi Pasteur vào năm 1866 (Pasteur,

1866) Trong khi các men chính được sử

dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm

và đồ uống có cồn hiện nay để sản xuất

bánh mì, bia, rượu mạnh, rượu táo và rượu

vang được phân loại như Saccharomyces

cerevisiae, nó cũng được công nhận rằng

không phải tất cả các chủng S cerevisiae là

thích hợp cho quá trình lên men và khả

năng sản xuất thực phẩm chất lượng cùng

đồ uống khác nhau đáng kể trong số đó Bởi

vì phương pháp cổ điển, sinh lý và di truyền

bị hạn chế sử dụng do đặc tính của các

chủng nấm men rượu vang, các nhà nghiên

cứu công nghệ sinh học trong rượu vang đã

tìm kiếm các phương pháp mới để thích

nghi di truyền của chủng nấm men công

nghiệp của cùng một loài, tức là S.

cerevisiae (Pretorius & Hoj, 2005) Mặt

khác, nó được thiết lập tốt để S cerevisiae

sản xuất nồng độ hợp chất thơm khác nhau

dựa trên điều kiện lên men và nghiên cứu,

ví dụ: nhiệt độ, giống nho, vi chất dinh

dưỡng, vitamin và thành phần nitơ cần

thiết Hơn nữa, nhiều nấm men thương mại

ngoài hương vị còn tạo ra sản phẩm không

mong muốn, chẳng hạn như H2S, alcohol

bậc cao, acid acetic và ethyl acetate, tùythuộc vào

assimilable nitrogen present in the grape

must (Bell & Henschke, 2005)

Additionally, slow, sluggish and stuck

fermentations have often been related to

nitrogen deficiency (Bisson, 1999) In the

late 1970s, these fermentation problems

were partially solved by the addition of

ammoniumsalts to deficient musts, which

not only increased fermentation rate but

also the sensory desirability of the wines

(Bell & Henschke, 2005) As a

consequence, the routine addition of

ammoniacal nitrogen to musts to correct

nitrogen limitation is widely used by

enologists in most wine regions of the

world Although today some useful

methods are accessible for measuring the

yeast assimilable nitrogen (YAN) content

of grape musts inwineries, they are not

commonly used, and so the cause and effect

relationship that results in wines with an

undesirable flavor is not usually correlated

Initial studies have attempted to relate the

yeast nitrogen demand concept with the

profile of aroma compounds in wines.

Paradoxically, the various studies reported

to characterize the yeast aroma compounds

of wines made with various wine yeasts

have not considered the importance of

nitrogen level of the grape must or the

fermentation medium utilized (Rankine,

1967; Rankine & Pocock, 1969; Daudt &

Ough, 1973; Di Stefano et al., 1981;

Cabrera et al., 1988; Cavazza et al., 1989;

Giudici et al., 1990; Herraiz et al., 1990;

Mateo et al., 1991; Delteil & Jarry, 1992;

Longo et al., 1992; Lurton et al., 1995;

Lema et al., 1996; Zoecklein et al., 1997;

Antonelli et al., 1999; Vila et al., 2000;

Romano et al., 2003) Moreover, many

studies were conducted under conditions of

excess nitrogen, above 300 mgN/L

(Houtman & Du Plessis, 1986; Carrau,

2003) This experimental approach has,

however, not proved to be suitable because

nồng độ nitơ đồng hóa trong nho (Bell &Henschke, 2005) Ngoài ra, quá trình lênmen chậm và khó khăn thường liên quanđến thiếu hụt nitơ (Bisson99) Vào cuốinhững năm 1970, những vấn đề lên men đãđược giải quyết một phần bằng cách chothêm muối amoni, điều đó không chỉ tăngtốc độ quá trình lên men mà còn tạo mùi vịmong muốn của các loại rượu vang (Bell &Henschke, 2005) Như một hệ quả, việc bổsung thường xuyên nitơ amoniac để cungcấp nitơ được sử dụng rộng rãi bởi các nhàlàm rượu ở hầu hết các vùng sản xuất rượuvang của thế giới Mặc dù ngày nay một sốphương pháp hữu ích có thể sử dụng để đohàm lượng nitơ có thể được đồng hóa bởinấm men (YAN) của nho trong sản xuất,nhưng chúng không được sử dụng phổ biến,

và đó là nguyên nhân ảnh hưởng kết quảsản xuất rượu với một hương vị khôngmong muốn

Nghiên cứu ban đầu đã cố gắng liên hệ cáckhái niệm nhu cầu men nitơ với các hợpchất thơm trong rượu vang Nghịch lý thay,nhiều nghiên cứu đã báo cáo mô tả các hợpchất thơm được tạo ra từ nấm men trongcác loại rượu vang khác nhau, có hàmlượng nitơ trong nho hoặc môi trường lênmen không được xem xét (Rankine, 1967;Rankine & Pocock, 1969; Daudt & ough,1973; Di Stefano et al., 1981; Cabrera et al.,1988; Cavazza et al., 1989; Giudici et al.,1990; Herraiz et al., 1990; Mateo et al.,1991; Delteil & Jarry, 1992; Longo et al.,1992; Lurton et al., 1995; Lema et al.,1996; Zoecklein et al., 1997; Antonelli etal., 1999; Vila et al., 2000; Romano et al.,

2003 ) Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã đượctiến hành trong điều kiện nitơ dư thừa, trên

300 mgNL-1 (Houtman & Du Plessis, 1986;Carrau, 2003) Cách tiếp cận này, tuy nhiên,không được xem là phù hợp vì

S cerevisiae yeast strains that show similar

profiles of assimilable nitrogen

consumption can nevertheless produce very

different profiles of fermentation rate and

aromatic compounds under industrial

conditions of lower initial nitrogen levels

(Jiranek et al., 1991; Carrau, 2003;

Taillandier et al., 2007) There are few

reports of investigations into the sensory

characteristics of wines made with different

strains under low nitrogen fermentation

conditions (Carrau et al., 1993; Medina et

al., 1997; Carrau, 2003) Only recently,

have the first chemometric studies provided

data on the significance of yeast aroma

compounds to perceived flavor in wine

(Smyth et al., 2005)

From the chemical point of view, only a

few studies have investigated the yeast

aroma compounds of wines prepared under

defined conditions of YAN contents similar

to winemaking conditions (Bosso, 1996;

Guitart et al., 1999; Nicolini et al., 2000a,

b; Carrau, 2003; Bell & Henschke, 2005;

Beltran et al., 2005; Carrau et al., 2005;

HernandezOrte et al., 2006; Vilanova et al.,

2007) Nevertheless, it is difficult to draw

any firm conclusions concerning the

relationship between YAN and the different

aroma compounds produced by the yeast

strains studied due to the different

experimental conditions used

The aim of this study was to characterize S.

cerevisiae strains for the production of key

yeast aroma compounds (esters, alcohols,

acids and lactones) after fermentation of a

chemically defined medium, which models

the nutrient composition of grape must

covering a wide range of initial nitrogen

concentrations The model yeast strains

used in this study were selected from a

wide group of strains because both showed

similar nitrogen consumption when tested

under different nitrogen conditions,

chủng nấm men S cerevisiae tiêu thụ nitơ

đồng hóa như nhau vẫn có thể tạo ra sựkhác nhau về tỷ lệ lên men và các hợp chấtthơm trong điều kiện công nghiệp củalượng nitơ ban đầu thấp hơn (Jiranek et al.1991; Carrau, 2003; Taillandier et al 2007)

Có vài báo cáo về đặc tính của các loạirượu vang được thực hiện với các chủngkhác nhau trong điều kiện lên men nitơ thấp(Carrau et al 1993; Medina et al., 1997;Carrau, 2003) Chỉ mới gần đây, có nhữngnghiên cứu về mặt hóa học đầu tiên cungcấp dữ liệu đáng kể về tầm quan trọng củacác hợp chất thơm đối với hương vị rượu(Smyth et al 2005)

Từ quan điểm hóa học của vấn đề, chỉ cómột vài nghiên cứu về các hợp chất thơm từnấm men được chuẩn bị dưới điều kiệnlượng YAN được xác định tương tự nhưđiều kiện sản xuất rượu vang (Bosso, 1996;Guitart et al, 1999; Nicolini et al., 2000a, b;Carrau, 2003; Bell & Henschke, 2005;Beltran et al., 2005; Carrau et al., 2005;Hernandez-Orte et al., 2006; Vilanova etal., 2007) Tuy nhiên, rất khó để rút ra bất

kỳ kết luận chắc chắn về mối quan hệ giữaYAN và các hợp chất thơm khác nhau đượcsản xuất bởi các chủng nấm men sử dụngnghiên cứu ở các điều kiện thí nghiệm khácnhau

Mục đích của nghiên cứu này là để mô tả

các chủng S cerevisiae sản xuất các hợp

chất men hương thơm chính (este, rượu,axit và lactones) sau khi lên men trên mộtmôi trường được xác định về mặt hóa học,trong đó thành phần dinh dưỡng của nhophải bao gồm một loạt các nồng độ nitơ banđầu Các chủng nấm men được sử dụngtrong nghiên cứu này đã được lựa chọn từmột nhóm lớn các chủng bởi vì chúng chothấy việc tiêu thụ nitơ tương tự khi đượcthử nghiệm trong điều kiện nitơ khác nhau,

but from a sensory and chemical point of

view they produced different wines at a low

nitrogen concentration (75 mgN/L) The

differential behavior of yeast strains at

different initial nitrogen concentrations was

examined for a better understanding of this

phenomenon in our model system

Application of these results for future

discrimination of industrial yeast strains in

relation to the type of aroma compounds

produced will allow the development of

data models for metabolic footprinting

methods (Kell et al., 2005; Carrau et al.,

2008)

Materials and methods

Yeast strains

Saccharomyces cerevisiae strains utilized

were: Montrachet UCD 522 (University of

California, Davis), referred to as M522 in

this work, and KU1 [Uruguayan selected

strain, (Carrau et al., 1993; Medina et al.,

1997)] Both strains are used in the

commercial production of wine Inocula

were prepared in the same synthetic

medium by incubation for 12h in a rotary

shaker at 150r.p.m and 25℃ Inoculum

size was 5.105 cells/mL of medium for both

strains The widely studied wine yeast

strains, S cerevisiae M522 and KU1, were

characterized as strains having similar

nitrogen demands (i.e consuming a similar

amount of nitrogen under 50–400mgN/L of

YAN)

Fermentation conditions

Chemically defined fermentation medium

(nutrient components of grape juice) was

prepared as described previously (Henschke

& Jiranek, 1993), but modified as follows:

the total nitrogen content was adjusted to a

basic amount of 50mgN/L with each amino

acid and ammonium component added in

nhưng từ một điểm cảm quan và hóa họccủa vấn đề, chúng sản xuất các loại rượuvang khác nhau ở nồng độ nitơ thấp (75mgN/L) Các hoạt động khác biệt của cácchủng nấm men ở nồng độ nitơ ban đầukhác nhau đã được kiểm tra cho thấy sựhiểu biết tốt hơn về hiện tượng này trong hệthống mô hình của chúng tôi

Áp dụng các kết quả phân tích trong tươnglai của các chủng nấm men công nghiệpliên quan đến các loại hợp chất thơm đượcsản xuất sẽ cho phép sự phát triển của môhình dữ liệu của các phương phápfootpriting trao đổi chất (Kell et al., 2005;Carrau et al., 2008)

Vật liệu và phương pháp Chủng nấm men

Chủng Saccharomyces cerevisiae được sử

dụng là: Montrachet UCD 522 (Đại họcCalifornia, Davis), được gọi là M522 trongnghiên cứu này, và KU1 (Carrau et al,1993; Medina et al., 1997) Cả hai chủngđều được sử dụng trong sản xuất thươngmại rượu vang Chủng đã được chuẩn bịtrong môi trường tổng hợp tương tự bằngcách ủ trong máy lắc 12 giờ tại 150 r.p.m

và 25℃ Hàm lượng chung cho tất cả cácchủng là 5.105 tế bào/mL Các chủng nấmmen rượu vang được nghiên cứu rộng rãi,

S cerevisiae M522 và KU1, được mô tả

như là các chủng có nhu cầu nitơ tương tự(nghĩa là tiêu thụ một số lượng tương tự củanitơ dưới 50-400 mgN/L của YAN)

Điều kiện lên men

Môi trường lên men được xác định thànhphần hóa học (thành phần dinh dưỡng củanước ép nho) được chuẩn bị như mô tảtrước đó (Henschke & Jiranek, 1993) nhưngbiến đổi như sau: tổng hàm lượng nitơ đãđược điều chỉnh lượng cơ bản là 50 mgN/Lvới mỗi amino acid và amonium thành phầnđược thêm vào với tỉ lệ

the same proportions as indicated

previously (Henschke & Jiranek, 1993)

Media with YAN concentrations of 75, 125,

180, 250 and 400mgN/L were made by

increasing the basic concentration by

supplementation with diammonium

phosphate (DAP) None of these YAN

amounts was a limiting concentration for

complete fermentation of sugars by the

yeast strains used The final pH of each

medium was adjusted to 3.5 with HCl

Equimolar concentrations of glucose and

fructose were added to reach 120g/L and

the mixed vitamins and salts as described

previously (Henschke & Jiranek, 1993)

Tween 80 was excluded from the medium

because it was not found to be necessary for

complete fermentation and it had a negative

impact on the sensory characteristics of the

resultant wines Ergosterol was added as the

only supplemented lipid at a final

concentration of 10 mg/L Fermentations

were carried out in 125 mL of medium

contained in 250mL Erlenmeyer flasks,

closed with Muller valves, filled with pure

sulfuric acid YAN was chosen as the

variable for this investigation because it

was found previously that this factor

significantly affected production of

fermentation aroma compounds by these

yeasts under similar experimental

conditions (Carrau, 2003) Static batch

fermentation conditions were conducted at

20℃ in triplicate, simulating winemaking

conditions Fermentation activity was

measured as CO2 weight loss and expressed

in grams per 100 mL, and total residual

sugars were analyzed using the Fehling

method (Zoecklein et al., 1995) Once a

day, samples were taken to measure cell

growth in an improved Neubauer chamber

Samples for sensory and GC-MS analysis

were taken 2 days after the end of

fermentation, filtered through 0.45-μmm pore

membranes and SO2 was added as

giống như được mô tả trước đó (Henschke

& Jiranek, 1993) Môi trường với nồng độYAN là 75, 125, 180, 250 và 400 mg N/Lđược làm tăng nồng độ cơ bản bởi sự cungcấp diamonium phosphate (DAP) Không

có nồng độ YAN nào trong những nồng độtrên là nồng độ giới hạn trong quá trình lênmen hoàn toàn đường bởi chủng nấm menđược sử dụng PH cuối của mỗi môi trườngđược điều chỉnh 3.5 với HCl Nồng độ đẳngphân tử của glucose và fructose được thêmvào để đạt 120g/L và hỗn hợp vitamin vàmuối như được mô tả trước đó (Henschke

& Jiranek, 1993) Tween 80 được loại trừkhỏi môi trường vì nó không cần thiết choquá trình lên men hoàn toàn và nó có tácđộng tiêu cực lên đặc tính cảm quan củarượu thành phẩm Ergosterol được thêmvào như là nguồn bổ sung lipid duy nhất ởnồng độ cuối là 10mg/L Sự lên men đãđược thực hiện trong 125mL môi trườngchứa trong bình Erlenmeyer 250 mL, đónglại bằng van Muller, đầy H2SO4nguyênchất YAN đã được chọn như là biến sốcho nghiên cứu này vì nó được nhận thấyrằng yếu tố này ảnh hưởng đáng kể đến sảnlượng của các hợp chất lên men thơm củachủng nấm men này dưới điều kiện thínghiệm tương tự (Carrau, 2003) Điều kiệnlên men tĩnh được tiến hành ở 20oC trong 3lần, kích thích các điều kiện làm rượu Hoạtđộng lên men được đo bởi hàm lượng CO2

mất đi, tính bằng g/100mL và tổng lượngđường còn lại được phân tích bằng phươngpháp Fehling (Zoecklein et al., 1995) Mỗingày, mẫu được lấy đi đo sự tăng trưởng tếbào trong phòng Neubauer được cải tiến.Mẫu cho phân tích cảm quan và phân tíchGC-MS được lấy sau khi kết thúc quá trìnhlên men 2 ngày, lọc qua màng lọc lỗ 0,45

μmm và SO2 được thêm vào là

50mg/L of sodium metabisulfite.

Sensory analysis

Fermentation products were subjected to

sensory analysis through a paired

preference test Fermentations at 75 mgN/L

were presented to a trained panel of 12–15

persons, in order to determine the

significance of the sensory differences

between the strains Samples fermented

with both strains with or without addition of

YAN in the chemically defined medium

containing the basic concentration of

nitrogen (75 mgN/L) were presented to a

group of five winemakers so as to evaluate

aroma defects and positive characteristics

A free description of desirability and aroma

characteristics was presented in the tasting

sheet

GC and GC-MS analysis

Higher alcohols

Higher alcohol and ethyl acetate analysis

was performed by distillation of 50 mL of

sample and direct injection of 0.5 μml of

sample of the distillate and analyzed using

the GC-FID with a glass column (2m x 2

mm; Carbopack C, 60–80 mesh, 0.2% CW

1500, Supelco) in a Shimatzu C-17,

equipped with EZ-CHROM software The

experimental conditions were as follows:

program temperature 65℃ (5 min), 60–150

℃ at 4℃/min; injector temperature 200℃;

and detection temperature, 250℃ The

carrier gas was nitrogen (20 mL/min)

Aroma volatile compounds

Extraction of aroma compounds was

performed using adsorption and separate

elution from an Isolute (IST Ltd, Mid

Glamorgan, UK) ENV1 cartridge packed

with 1g of a highly cross-linked

styrene-divinyl benzene (SDVB) polymer

Treatment of samples and GC analysis were

50mg/L sodium metabisulfite

Phân tích cảm quan

Sản phẩm lên men được phân tích cảmquan thông qua một bài kiểm tra kết hợp ở75mgN/L trình bày bởi một nhóm 12-15người, để xác định ý nghĩa cảm quan khácnhau giữa các chủng Mẫu lên men với cảhai chủng có hoặc không có thêm YANtrong môi trường đã xác định thành phầnhóa học chứa nồng độ nitơ cơ bản (75 mgN/L) được trình bày bởi một nhóm 5 ngườilàm rượu để đánh giá sự thiếu mùi thơm vàcác đặc tính tốt được trình bày trong bảngthử

Phân tích GC và GC-MS Acohol bậc cao

Phân tích alcohol bậc cao và ethyl acetateđược thực hiện bởi chưng cất 50ml mẫu vàphun trực tiếp 0,5μmlmẫu sản phẩm chưngcất và phân tích bằng GC-FID với một cộtthủy tinh (2m x 2mm, Carbopack C, 60-80mắt lưới 0.2% CW 1500, Supelco) trongmột Shimatzu C-17, được trang bị phầnmềm EZ-CHROM Điều kiện thí nghiệmnhư sau: nhiệt độ quá trình 65oC ( 5 phút),60–150 oC tại 4℃/phút; nhiệt độ phun 200

℃ Và nhiệt độ phát hiện là 250oC Khímang là nitơ (20 mL/phút)

Hợp chất thơm dễ bay hơi

Tách chiết hợp chất thơm được thực hiệnbằng hấp phụ và ly giải từ một Isolute(ISTLtd, Mid Glamorgan, UK) ENV + hạt đượcđóng gói với 1g SDVB ( nhiều liên kết chéostyrene-divinyl benzene polymer) Xử límẫu và phân tích GC được thực hiện

performed as described previously (Boido

et al., 2003)

Identification and quantification

The components of wine aromas were

identified by comparison of their linear

retention indices, with pure standards or

data reported in the literature Comparison

of mass spectral fragmentation patterns

with those stored on databases was also

performed GC-FID and GC-MS

instrumental procedures using an internal

standard (1-heptanol) were applied for

quantitative purposes, as described

previously (Boido et al., 2003)

Statistical analysis

A stepwise discriminant analysis was

carried out with the aroma compounds

analyzed of the 12 wines produced using

both strains in triplicate in a basic

fermentation medium containing a initial

YAN of 75 mgN/L, with and without an

extra YAN addition of 63 mgN/L as DAP

ANOVA for initial YAN concentration,

yeast strain and aroma compounds were

determined with STATISTICA 5.1

Differences of free volatile compounds

were evaluated; the mean rating and least

significant differences for initial YAN

concentrations for each strain were

calculated from an ANOVA

Results

A preference sensory test was performed

where significant differences were found

between fermentations of KU1 and M522

(P < 0.01) at a low nitrogen concentration

(75 mgN/L), while no significant

differences were found between them at a

higher nitrogen concentration (400 mgN/L)

At a low nitrogen concentration, wines

were described as fruity and pleasant for

KU1 and unpleasant (soapy and sweaty) forM522, confirming our previous work with như mô tả trước đó(Boido et al., 2003)

Nhận biết và định lượng

Thành phần của các hương liệu rượu đượcnhận biết bằng cách so sánh chỉ số duy trìtuyến tính của nó với tiêu chuẩn thuần hoặc

dữ liệu được ghi lại So sánh các mẫu phânmảnh quang phổ khối lượng với dữ liệuđược lưu trữ trong cơ sở dữ liệu Phươngpháp GC-FID và GC-MS sử dụng một tiêuchuẩn nội bộ (1-heptanol) được áp dụngcho mục đích định lượng như được mô tảtrước đó (Boido et al., 2003)

Phân tích thống kê

Phương pháp phân tích từng bước một đượcthực hiện với việc phân tích hợp chất thơmcủa 12 loại rượu được sản xuất sử dụng cả 2chủng 3 lần trong môi trường lên men cơbản chứa một nồng độ YAN ban đầu 75mgN/L, có hoặc không có thêm vào 63mgN/L DAP

ANOVA (phân tích phương sai) cho nồng

độ YAN ban đầu, chủng nấm men và hợpchất thơm được xác định với STATISTICA5.1 (phép thống kê) sự khác nhau của hợpchất dễ bay hơi được đánh giá; đánh giátrung bình và sự khác biệt đáng kể nhất chonồng dộ YAN ban đầu của mỗi chủng đượctính toán từ một ANOVA

Các kết quả

Một thử nghiệm cảm quan được thực hiệnnhiều nơi tìm thấy sự khác biệt giữa quátrình lên men của KU1 và M522 (P < 0.01)

ở nồng độ nitơ thấp (75 mgN/L), trong khikhông có sự khác biệt đáng kể nào được tìmthấy giữa chúng ở nồng độ nitơ cao hơn(400 mgN/L) Ở nồng độ nitơ thấp, rượu

vang được mô tả như trái cây và dễ chịu

cho KU1 và không dễ chịu cho M522, được

xác nhận trong những kết quả nghiên cứu

trước đây

these two strains (Carrau, 2003) Table 1

shows the odor active values (OAV) of the

main aroma compounds analyzed for these

two nitrogen concentrations

Table 1 Average OAV for the studied

fermentations with the model strains at two

YAN levels (75 and 400 mgN/L)

On the left side, it can be seen that from the

7 compounds that resulted in higher OAVs

for KU1 at a low YAN level, four were

described as fruity (esters) and the others

were mediumchain fatty acids, considered

as precursors of fruity esters Conversely,

seven compounds that resulted in lower

OAVs for KU1 at this YAN level were the

higher alcohols and isoacids, corresponding

to unpleasant aroma descriptions At the

higher nitrogen concentration, although

wines could not be differentiated by the

sensory analysis, M522 produced high

concentrations (OAVs) of practically all the

compounds, indicating that chemically,strains have a very different behavior at thisnitrogen concentration On the other hand,addition of YAN to the low nitrogenconcentration (75 mgN/L) of 63 mgN/L as của chúng tôi về hai chủng này(Carrau,2003) Bảng 1 cho thấy các giá trị nồng độmùi (OAV) của các hợp chất thơm chínhđược phân tích ở hai nồng độ nitơ

Bảng 1 OAV trung bình của nghiên cứuquá trình lên men với chủng mô hình tại hainồng độ YAN (75 và 400 mgN/L)

Ở bên trái, có thể thấy rằng từ 7 hợp chấttrong OAVs của KU1 cao hơn ở mức YANthấp, bốn hợp chất cho mùi trái cây (este)

và những loại khác là các chuỗi axit béotrung bình, được coi là tiền thân của cáceste có mùi trái cây Ngược lại, bảy hợpchất của KU1 cho kết quả OAVs thấp hơn ởmức YAN này là alcohol bậc cao vàisoacids, cùng với mùi hương khó chịu Ởnồng độ nitơ cao hơn, mặc dù các loại rượuvang không thể được phân biệt bởi cácphân tích cảm quan, nồng độ cao (OAVs)của tất cả các hợp chất được sản xuất bởiM522, chỉ ra rằng về mặt hóa học, các

chủng có biểu hiện khác nhau ở nồng độ

nitơ khác nhau Mặt khác, việc bổ sung

YAN (75 mgN/L) với các nồng độ nitơ thấp

63 mgN/L

DAP (resulting in a final YAN of 138 mgN/

L) shows that the M522 strain requires a

higher nitrogen concentration to produce a

similar aroma profile when compared with

KU1, as shown in Fig 1

Fig 1 In the following experiment, the two

selected strains were fermented with and

without the addition of 63 mgN/L of YAN

The graph shows the discriminant analysis,

where 28 compounds determined using

GC-MS were used The compounds that were

discriminant in this analysis were:β

-phenylethyl alcohol,β-phenylethyl acetate,

the isobutanoic and isovaleric acids, ethyl

octanoate and 2-ethyl hexanol

A discriminant analysis using 28

compounds determined using GC-MS

shows a clear discrimination in three

fermentation groups The discriminant

compounds in this analysis were:β

-phenylethyl alcohol, β -phenylethyl acetate,

the isobutanoic (isoC4) and isovaleric acids

(isoC5), ethyl octanoate and 2-ethyl

hexanol The YAN addition to M522

resulted in fermentations with a response

similar to that of unsupplemented KU1, as

the discriminant analysis could not separate

these two cases

Conditions of growth and fermentationactivity could affect the profile of volatileyeast metabolites that contribute to winearoma The growth and fermentation

như DAP (kết quả 138 mgN/L là kết quảcuối cùng của YAN) cho thấy chủng M522đòi hỏi phải có một nồng độ nitơ cao hơn

để sản xuất một lượng chất thơm tương tựvới KU1, như trong hình 1

Hình 1 Theo như trong thí nghiệm, haichủng được chọn để lên men và không bổsung 63 mgN/L của YAN Đồ thị biểu thịvùng phân tích riêng biệt, nơi 28 hợp chấtđược xác định bằng GC-MS Những hợpchất được phân biệt trong phân tích này là:

β-phenylethyl alcohol, β-phenylethylacetate, the isobutanoic và isovaleric acids,ethyl octanoate and 2-ethyl hexanol

Phương pháp phân biệt 28 hợp chất sử dụngGC-MS cho thấy một sự khác biệt rõ ràngtrong ba nhóm lên men Các hợp chất khácnhau trong phân tích này là: β-phenylethylalcohol, β-phenylethyl acetate, cácisobutanoic (isoC4) và các acid isovaleric(isoC5) ethyl octanoate và 2-ethyl hexanol.YAN được thêm vào M522 dẫn đến lênmen với một phản ứng tương tự như củaKU1, phương pháp phân tích không thểphân biệt hai trường hợp này

Điều kiện của sự phát triển và quá trình lên

men có thể ảnh hưởng đến các chất chuyển

hóa men dễ bay hơi tạo hương thơm rượu

Sự tăng trưởng và động học quá trình lên

men

kinetics of the two strains were first

characterized over the wide range of

nitrogen concentrations utilized in this

study (50–400 mgN/L) No significant

differences in cell growth were found

between strains (Fig 2a), but a significantly

smaller total population was found for both

strains in fermentations at an initial YAN of

75 mgN/L

Fig 2 (a) Growth response to different

nitrogen concentrations for M522 and KU1

strains Results are the average of duplicate

fermentations

(b) Fermentation rate curves, determined byculture weight loss due to CO2 evolutionfor M522 and KU1 at low YANconcentrations (50–125 mgN/L) Resultsare the average of duplicate fermentationsand SEs of the mean < 5%

của hai chủng này là hình mẫu đầu tiênđược nghiên cứu trong phạm vi nồng độnitơ rộng (50-400 mgN/L) Không có sựkhác biệt đáng kể trong tăng trưởng tế bàođược tìm thấy giữa các chủng (Hình 2a).,nhưng tổng sinh khối nhỏ hơn đáng kể đượcnhận thấy giữa hai chủng trong lên men vớinồng độ YAN ban đầu là 75 mgN/L

Hình 2 (a) Đáp ứng tăng trưởng với nồng

độ nitơ khác nhau của các chủng M522 vàKU1 Kết quả là mức trung bình của quátrình lên men trùng lặp

(b) Đường cong tỷ lệ lên men, xác định bởi

lượng môi trường mất đi do quá trình tạo

CO2 của M522 và KU1 ở nồng độ YAN

thấp Kết quả là trung bình của quá trình lên

men trùng lặp và SEs có nghĩa < 5%

Fermentation activity (CO2 evolution rate)

of the two strains was found to depend on

the initial YAN concentration up to 125

mgN/L, (Fig 2b) All fermentations were

completed (final residual sugars below 2 g/

L) at low nitrogen concentrations and

fermentation curves were not significantly

different for strains at higher YAN

concentrations (data not shown)

Production of higher alcohols and

isoacids in response to initial nitrogen

concentration

Fig 3 Relationship between the accumulation

of higher alcohols and isoacids in wines made

with two Saccharomyces cerevisiae yeast

strains in response to the initial nitrogenconcentration

(a) Sum of propanol, butanol and b-phenylethyl alcohol

2-methyl-1-(b) Sum of the isobutanoic and isovaleric acids