Báo cáo thực hành Kỹ thuật phân tích vi sinh

PHẦN IPHƯƠNG PHÁP THU – BẢO QUẢN CHUẨN BỊ MẪU1.Tại sao các quy trình kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm đều có thêm các bước nuôi tăng sinh và bước tăng sinh chọn lọc?2.Trình bày những yêu cầu chung trong việc lấy và xử lý mẫu?3.Mật độ vi sinh vật trong mẫu các mẫu nước, thực phẩm và mỹ phẩm khác với mẫu bệnh phẩm như thế nào?PHẦN IIPHÂN TÍCH VI SINH TRONG THỰC PHẨMBài 1PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS Escherichia coli 1.Coliform, Coliform chịu nhiệt, E. coli giả định, E. Coli là gì? Thí nghiệm cấy từ ống (+) BGBL qua ống môi trường EC, ủ 44,50C có cần thiết không? Giải thích tại sao?2.Trình bày cơ chế môi trường EMB, EC, BGBL?3.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng E.coli theo một phương pháp đếm đĩa?Bài 2PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Streptococcus faecalisTRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc S. faecalis trên môi trường thạch TTC natri azit?2.Trình bày cơ chế môi trường canh thang Natri azit , môi trường thạch TTC natri azit?3.Tại sao kiểm tra chỉ tiêu S. faecalis phải đồng nhất mẫu vào đệm muối 3%? Có thể thay thế bằng môi trường khác được không?4.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng S. faecalis theo một phương pháp đếm đĩa?Bài 3PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureusTRONG THỰC PHẨM1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc S. aureus trên môi trường Baird – Parker?2.Trình bày cơ chế môi trường Baird – Paker?3.Trình bày cơ chế của phản ứng coagulase?4.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng S. aureus theo phương pháp MPN?Bài 4PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Bacillus cereusTRONG THỰC PHẨM1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc B. cereus trên môi trường Mossel?2.Trình bày cơ chế môi trường Mossel?3.Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn thử xây dựng quy trình định lượng B.cereus theo phương pháp đếm đĩa?Bài 5PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH Vibrio parahaemolyticusTRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN1.Giải thích sự hình thành khuẩn lạc V. parahaemolyticus trên môi trường TCBS?2.Trình bày cơ chế môi trường TCBS?3. Có thể bỏ qua bước tăng sinh mẫu trong peton kiềm, ủ 24h trong quy trình kiểm tra chỉ tiêu này được không?

PHẦN I PHƯƠNG PHÁP THU – BẢO QUẢN- CHUẨN BỊ MẪU

1 Tại sao các quy trình kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm đều có thêm các bước nuôi tăng sinh và bước tăng sinh chọn lọc?

- Nuôi tăng sinh: Phục hồi vi sinh vật đang bị tổn thương  tăng sinh cho vi sinh vật mạnh lên Đây giống như môi trường tăng sinh cơ sở cho vi sinh vật

- Tăng sinh chọn lọc: Trên môi trường đặc hiệu  tạo điều kiện cho vi sinh vật cần phát hiện phát triển, ức chế vi sinh vật khác

2 Trình bày những yêu cầu chung trong việc lấy và xử lý mẫu?

- Lấy mẫu:

+ Thời gian: • Nên: Lấy mẫu ở nhiều công đoạn, tốt nhất là công đoạn trọng tâm vào nhiều thời điểm

• Có thể: Tập trung lấy mẫu ở công đoạn thành phẩm

+ Dụng cụ: • Lấy mẫu: Sát trùng để tách thành lượng mẫu cần thiết, dùng dụng cụ thích hợp (dao, thìa, kéo ) đưa mẫu vào dụng cụ chứa mẫu

• Chưa mẫu: Nên sử dụng bình nhựa, chất dẻo có nắp, tránh sử dụng bình thủy tinh dễ bị bể vỡ

+ Vận chuyển và bảo quản:

• Mẫu được bảo quản bằng bao nước đá không tan chảy trọng quá trình vận chuyển

• Mẫu được bảo quản ở tủ - 20 0C hoặc tủ lạnh 0 – 40C (Tùy thuộc vào thời gian phân tích mẫu, nếu phân tích sớm thì có thể để ở tủ lạnh 40C, nếu chưa

có thời gian phân tích ngay thì để ở tủ - 20 0C)

- Xử lý mẫu:

+ Giải đông mẫu: Thực hiện ở 20C – 50C/18h ( Tùy thuộc vào người làm thí nghiệm xử lý mẫu)  Lắc mẫu liên tục để giải đông và đồng nhất nhiệt độ + Đông nhất mẫu: Mẫu đồng nhất, phân bố đều

+ Cân mẫu

3 Mật độ vi sinh vật trong mẫu các mẫu nước, thực phẩm và mỹ phẩm khác với mẫu bệnh phẩm như thế nào?

- Mật độ vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm THẤP HƠN NHIỀU lần (vài chục đến vài triệu) so với mẫu bệnh phẩm

PHẦN II PHÂN TÍCH VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Bài 1

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS/ Escherichia coli

CÂU HỎI:

1 Coliform, Coliform chịu nhiệt, E coli giả định, E Coli là gì? Thí nghiệm cấy

từ ống (+) BGBL qua ống môi trường EC, ủ 44,5 0 C có cần thiết không? Giải thích tại sao?

- Coliform: trực khuẩn đường ruột, gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, lên men sinh hơi lactose 370C/24-48h

- Coliform chịu nhiệt: Vi sinh vật có khả nnawg lên men sinh hơi lactose trên môi trường EC/44.50C trong 24h

- E.coli giả định: coliform chịu nhiệt sinh endole trong canh Tryptone/44.50C trong 24h

- E.coli: là coliform giả định cho kết quả IMViC là + + - -

- Thí nghiệm cấy từ ống + BGBL cho qua ống môi trường EC, ủ 44,5 0C là cần thiết

 Vì đây là bước cần thiết để vừa để tăng sinh chọn lọc, vừa là bước xác định Coliform chịu nhiệt

2 Trình bày cơ chế môi trường EMB, EC, BGBL?

 Môi trường EC:

- Pep ton: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn N)

- Lactose: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn C)

- Bile salt: Ức chế vi khuẩn Gram (+)

- Sodium chloride: Cân bằng áp suất thẩm thấu.

- Di-potassium hydrogenphosphate: Đệm  Ổn định pH môi trường.

- Potassium di-hydrogenphosphate: Đệm  Ổn định pH môi trường.

- Nước cất vừa đủ

- pH sau thanh trùng: 6.9  0.2

- Hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút

 Môi trường BGBL:

- Pepton: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn N)

- Lactose: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn C)

- Ox bile: Ức chế vi khuẩn Gram (+)

- Brilliant green: + Ức chế vi khuẩn Gram (+)

+ Chất chỉ thị màu

- Nước cất vừa đủ

- pH sau thanh trùng: 7.2  0.2

- Hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút

 Môi trường EMB:

- Pep ton: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn N)

- Lactose: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn C)

- Eosin Y, yellowish: + Ức chế vi khuẩn Gram (+)

+ Chất chỉ thị màu

- Methylene blue: + Ức chế vi khuẩn Gram (+)

+ Chất chỉ thị màu

- Di-potassium hydrogenphosphate: Đệm  Ổn định pH môi trường

- Agar

- Nước cất vừa đủ

- pH sau thanh trùng: 7.1  0.2

- Hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút

3 Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn

thử xây dựng quy trình định lượng E.coli theo một phương pháp đếm đĩa?

Mẫu

Đồng nhất 10ml mẫu trong 90ml dung dịch NaCl 0,85%

Pha loãng mẫu ở nồng độ liên tiếp

Cấy lên môi trường EMB

Ủ 370C/24h Đếm khuẩn lạc điển hình (Khuẩn lạc màu tím ánh kim)

Thử nghiệm sinh hóa (IMViC (++ ))

Bài 2

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Streptococcus faecalis

TRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA

KẾT QUẢ KIỂM TRA

ST

T

1 Cấy trên canh

thang natri azit

- Kết quả 1 1 0 (ở nồng độ 10-2

và 10-3 cho kết quả dương tính)

- Giải thích: Kết quả dương tính

do vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn đường glucose làm acid hóa môi trường  Chỉ thị màu Brommocresol purple chuyển màu môi trường thành màu vàng

canh thang natri azit cấy ria lên môi trường Entero) Hai đĩa ở nồng độ 10-2 và 10-3 không có khuẩn lạc mọc

- Giải thích:

+ Trường hợp 1: Không có sự hiện diện của vi khuẩn

Streptococcus faecalis

+ Trường hợp 2: Nếu có sự hiện diện của vi khuẩn mà không phân lập được thì có thể do đồng nhất mẫu chưa đồng đều,

do thao tác cấy chưa tốt

3 Thử nghiệm

sinh hóa:

- Catalase

- Nitrate

Không có kết quả do không có khuẩn lạc

5 Tính số lượng

S feacalis có

trong mẫu thực

phẩm

Không có kết quả do không có khuẩn lạc

CÂU HỎI:

1 Giải thích sự hình thành khuẩn lạc S faecalis trên môi trường thạch TTC

natri azit?

- Khuẩn lạc đặc trưng có màu nâu đỏ

- Giải thích: Trên môi trường TTC natri azit có chất chỉ thị màu TTC, TTC bị khử thành formazan _ là một chất khó tan và có màu nâu đỏ Tạo màu nâu đỏ cho khuẩn lạc

2 Trình bày cơ chế môi trường canh thang Natri azit , môi trường thạch TTC natri azit?

 Môi trường canh thang Natri azit

- Peptone: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn N)

- Glucose: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn C)

- NaCl: Cân bằng áp suất thẩm thấu.

- K2HPO4: Đệm  Ổn định pH môi trường

- Natri azit: Ức chế phần lớn vi khuẩn gram (-)

- Bromocresol màu tía: chất chỉ thị màu

 Môi trường thạch TTC natri azit

- Peptone: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn N)

- Cao nấm men: Cung cấp nguồn năng lượng (Dinh dưỡng, vitamin)

- Glucose: Cung cấp nguồn năng lượng (Nguồn C)

- K2HPO4: Đệm  Ổn định pH môi trường

- Natri azit: Ức chế phần lớn vi khuẩn gram (-)

- Triphenyltetrazoiumchlorit (TTC): Chất chỉ màu nhận diện khuẩn lạc vi khuẩn (Màu đỏ, màu đỏ hồng)

- Agar

- Nước cất

- pH 7,2

3 Tại sao kiểm tra chỉ tiêu S faecalis phải đồng nhất mẫu vào đệm muối 3%?

Có thể thay thế bằng môi trường khác được không?

- Phải đồng nhất mẫu vào đệm muối 3%:

 Bản thân vi khuẩn Streptococcus là một loài ưa muối nên nồng độ này là thích hợp cho Streptococcus phát triển nhưng lại ức chế nhiều hệ vi sinh vật khác

- Có thể thay bằng đệm pepton 3% muối

4 Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn

thử xây dựng quy trình định lượng S faecalis theo một phương pháp đếm

đĩa?

Mẫu

Đồng nhất mẫu trong dung dịch NaCl 3%

Pha loãng mẫu ở nồng độ liên tiếp

Cấy lên môi trường TTC Natri azit

Ủ 350C/ 18-24h Đếm khuẩn lạc điển hình (khuẩn lạc màu nâu đỏ)

Nhuộm Gram (+) Thử nghiệm test sinh hóa

Catalase (-) Nitrate (-)

Bài 3

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus

TRONG THỰC PHẨM

KẾT QUẢ KIỂM TRA

ST

T

điển hình tâm đen, vòng trắng đục ở cả hai nồng độ pha loãng

10-2 và 10-3 Ở nồng độ pha loãng

10-2 khuẩn lạc dày hơn so với nồng độ pha loãng 10-3

- Giải thích: Do vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc; vi khuẩn có hoạt tính làm giảm Potassium tellurite làm khuẩn lạc có màu đen

2 Thử nghiệm

Coagulase

(Chưa chụp được hình ảnh)

- Coagulase (-)

- Kết quả: Coagulase âm tính

- Giải thích:

Trường hợp 1:

+ Do khuẩn lạc đặc trưng được lấy trong thử nghiệm này khá nhỏ, làm ảnh hưởng đến kết quả

+ Do thao tác thí nghiệm

Trường hợp 2:

+ Khuẩn lạc được lấy không phải

là Staphylococcus aureus mà nó chỉ thuộc chi Staphylococcus nên

ở nó vẫn cho khuẩn lạc điển hình tâm đen và vòng trắng đục bao quanh khuẩn lạc

3 Số lượng

Staphylococci

dương tính

coagulase có

trong mẫu thực

phẩm

Không có

Staphylococcus

dương tính coagulase

CÂU HỎI:

1 Giải thích sự hình thành khuẩn lạc S aureus trên môi trường Baird –

Parker?

- Khuẩn lạc đặc trưng: vòng sáng, tâm đen

- Giải thích:

+ Vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc;

+ Vi khuẩn có khả năng giảm Potassium tellurite làm khuẩn lạc có màu đen

2 Trình bày cơ chế môi trường Baird – Paker?

- Peptone: Cung cấp nguồn năng lượng (nguồn N)

- Meat extract: Cung cấp protein, vitamin

- Yeast extract: Cung cấp protein, vitamin, khoáng

- Sodium pyruvate: Chất chọn lọc cho sự phát triển của Staphylococci

- Glycine: Chất chọn lọc cho sự phát triển của Staphylococci

- Lythium chloride: Chất ức chế các vi khuẩn khác

- Potassium tellurite: Chất ức chế các vi khuẩn khác

- Egg – yolk tellurite:

+ Vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc

+ Vi khuẩn có khả năng giảm Potassium tellurite làm khuẩn lạc có màu đen

- Sulfamethazine/ litre: Chất ức chế proteus

3 Trình bày cơ chế của phản ứng coagulase?

- Staphylococcus có khả năng tổng hợp enzyme coagulase làm đông huyết tương người hoặc thỏ

4 Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn

thử xây dựng quy trình định lượng S aureus theo phương pháp MPN?

Mẫu

Đồng nhất mẫu trong dung dịch NaCl 0,85%

Pha loãng mẫu ở nồng độ liên tiếp

Tăng sinh trong môi trường MSB

Ủ 370C/ 24h Chọn ống dương (màu vàng) cấy lên môi trường BP

Ủ 370C/ 24h Chọn khuẩn lạc điển hình

Thử nghiệm Coagulase Tra bảng MPN tính mật độ

Bài 4

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Bacillus cereus

TRONG THỰC PHẨM

CÂU HỎI:

1. Giải thích sự hình thành khuẩn lạc B cereus trên môi trường Mossel?

- Khuẩn lạc đặc trưng: có màu hồng, vòng sáng xung quanh

- Giải thích:

+ B cereus không có khả năng lên men đường manitol nên khuẩn lạc sẽ sử

dụng nguồn pepton  kiềm hóa môi trường  không làm đổi màu chất chỉ thị phenol red  Màu của khuẩn lạc chính là màu của môi trường

+ Enzyme lecithinase sẽ thủy phân lecithin có trong lòng đỏ trứng tạo ra vòng sáng xung quanh

2 Trình bày cơ chế môi trường Mossel?

- Pepton: Cung cấp nguồn năng lượng (nguồn N)

- Manitol: Cung cấp nguồn năng lượng (nguồn C)

- Meat extract: Cung cấp protein, vitamin

- Sodium chloride: Duy trì áp suất thẩm thấu

- Phenol red: Chất chỉ thị màu

- Polymycin B sulfate : Chất ức chế vi khuẩn Gram (-), tạo điều kiện cho vi khuẩn gram (+) phát triển

- Egg – yolk: Vi khuẩn có khả năng sinh ra enzyme lecithinase phân hủy lòng đỏ trứng làm xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc

- Agar

- pH sau thanh trùng: 7.2  0.2

- Hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút

3 Sau khi hiểu được nguyên tắc của quy trình định lượng chỉ tiêu trên, các bạn

thử xây dựng quy trình định lượng B.cereus theo phương pháp đếm đĩa?

\

Mẫu

Đồng nhất trong dung dịch NaCl 0,85%

Pha loãng mẫu ở nồng độ liên tiếp

Cấy trang trên môi trường Mosel

Ủ 370C/24h Chọn khuẩn lạc đặc trưng ở nồng độ thích hợp (Màu hồng, vòng sáng)

Làm thuần trên môi trường NA

Nhuộm Gram (+) Thử nghiệm sinh hóa

Nitrate(+)

VP (+)

Bài 5

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH Vibrio parahaemolyticus

TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

KẾT QUẢ KIỂM TRA

STT Chỉ tiêu kiểm tra Kết quả Giải thích kết quả

lạc màu xanh trên môi trường TCBS

- Giải thích: Mẫu này nghi

ngờ có nhiễm Vibrio parahaemolyticus do nó

không có khả năng lên men đường Sucrose và sử dụng nguồn pepton  làm kiềm hóa môi trường  Thay đổi màu chất chỉ thị Bromithymol blue và Thymol blue

2 Thử nghiệm sinh hóa:

- KIA

- Oxidase

- Indol

- VP

- Di động

- LDC

- TSB 0% NaCl

- TSB 3% NaCl

- TSB 6% NaCl

- TSB 8% NaCl

- TSB 10% NaCl

- Thử nghiệm Indol (-): có thể là khuẩn lạc lấy thử nghiệm test sinh hóa không thuần  Cho kết quả sai khác (Do nhóm lấy khuẩn lạc ở những khóm khác nhau, không phải ở chung một khuẩn lạc)

- Thử nghiệm TSB: ở 0% muối vi khuẩn vẫn lên men làm đục môi trường  có thể là khuẩn lạc đem test sinh hóa không thuần, chính sự hiện diện của vi khuẩn khác làm đục môi trường TSB 0%

3 Có hay không V

paraheamolyticus

trong mẫu thực

phẩm?

Có sự hiện diện của V

paraheamolyticus Tuy

nhiên nhóm phân lập khuẩn lạc chưa được thuần dẫn đến sai lệch kết quả test sinh hóa

cho sự hiện diện của V.

paraheamolyticus

CÂU HỎI:

1 Giải thích sự hình thành khuẩn lạc V parahaemolyticus trên môi trường

TCBS?

- Khuẩn lạc đặc trưng: dạng tròn, hơi lồi, nhô cao và màu xanh

- Giải thích:

+ V parahaemolyticus không có khả năng lên men nguồn đường sucrose.

+ Chúng sử dụng nguồn peptone làm nguồn dinh dưỡng nên làm kiềm hóa môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu Bromothymol blue và Thymol blue

2 Trình bày cơ chế môi trường TCBS?

- Peptone : Cung cấp nguồn năng lượng (nguồn N)

- Sucrose: Cung cấp nguồn năng lượng (nguồn C)

- Yeast extract: Cung cấp protein, vitamin

- NaCl (CM cao): Tạo môi trường muối mặn

- Sodium citrate: Chất ức chế trực khuẩn đường ruột

- Sodium thiosunfate: Chất ức chế trực khuẩn đường ruột, khảo sát khả năng sinh khí H2S

- Sodium cholate: Ức chế cầu khuẩn đường ruột

- Mật bò:Ức chế cầu khuẩn đường ruột

- Ferico citrate: Khảo sát khả năng sinh H2S

- Bromothymol blue (6 -7,6): Chỉ thị màu

- Thymol blue (8 -9,6): Chỉ thị màu

- pH = 8,6 (kiềm cao)

3 Có thể bỏ qua bước tăng sinh mẫu trong peton kiềm, ủ 24h trong quy trình kiểm tra chỉ tiêu này được không?

- Không được bỏ qua bước tăng sinh mẫu trong peton kiềm

- Giải thích: Theo TCVN và theo tiêu chuẩn xét nghiệm thủy sản thì không được bỏ qua bước này

- Giải thích thêm: Bước tăng sinh trong pepton kiềm tạo điều kiện cho

V.parahaemolyticus tăng sinh với số lượng lớn  Trong quy trình định tính, đây là một lợi thế nhằm phát hiện sự có mặt của V parahaemolyticus Mặt khác, pepton

kiềm ức chế hầu hết hệ vi sinh vật khác nhưng lại điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển

 Đây là một bước rất quan trọng trong quá trình ĐỊNH TÍNH V.parahaemolyticus