Bài báo cáo thực hành môn Chăm sóc sức khỏe trong sinh học phân tử

Chuyên đề 1: Ứng dụng quy trình Multiplex – PCR phát hiện đồng thời các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm.CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬTChuyên đề 3: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi khuẩn lactic, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho con người.Chuyên đề 4: Tiếp cận các công cụ tin sinh học để khai thác dữ liệu, khảo sát in silico trong việc chuẩn đoán một số bệnh di truyền, bệnh ung thư ở người…

MỤC LỤC

A CHUYÊN ĐỀ 1 3

I TỔNG QUAN 3

1 Đối tượng vi sinh vật: 3

2 Kỹ thuật Multiplex - PCR: 3

II NỘI DUNG 3

1 Khảo sát dữ liệu 3

2 Vật liệu 5

3 Phương pháp 5

4 Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA 7

III KẾT QUẢ 8

1 Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 8

B CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT 10

 VI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THUỘC NHÓM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO 10

I TỔNG QUAN 10

1 Đông trùng hạ thảo 10

2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 11

II NỘI DUNG 11

1 Khảo sát dữ liệu 11

2 Vật liệu 12

3 Phương pháp 12

III KẾT QUẢ 16

 VI KHUẨN LACTIC DỰ TUYỂN LÀM PROBIOTIC CHO NGƯỜI 19

I TỔNG QUAN 19

II NỘI DUNG 20

1 Khảo sát dữ liệu 20

2 Vật liệu 21

3 Phương pháp 22

III KẾT QUẢ 25

- Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 25

- Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 25

- Dựng cây phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6) 27

C CHUYÊN ĐỀ 3 28

I TỔNG QUAN 28

II NỘI DUNG 28

1 Khai thác dữ liệu từ các bài báo chuyên đề trong nội dung lý thuyết môn học Sinh học phân tử trong chăm sóc sức khỏe 28

2 Tiến hành khảo sát in silico trên bài báo số 8: DNA Methylation at the RARβ Promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer 31

III KẾT LUẬN 37

A CHUYÊN ĐỀ 1

Mục tiêu: Ứng dụng quy trình Multiplex – PCR phát hiện đồng thời các tác nhân

gây ngộ độc thực phẩm

I TỔNG QUAN

1 Đối tượng vi sinh vật:

Hiện tượng ngộ độc thực phẩm xảy ra ngày càng nhiều ở nhiều địa phương trên cả nước và có nhiều trương hợp để lại hậu quả nghiêm trọng Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, trong đó vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiều nhất Các vi khuẩn gây ngộ độc thường gặp là:

Salmonella spp., Escherichia coli, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus,

Shigella spp., Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus…

2 Kỹ thuật Multiplex - PCR:

Là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi cho một phản ứng Sử dụng kỹ thuật Multiplex - PCR nhằm phát hiện nhanh và đồng thời các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm

II NỘI DUNG

1 Khảo sát dữ liệu

nghiên cứu

Phương pháp

hemolysin (hly),

Escherichia coli, Listeria monocytogene,

Multiplex PCR

Thực phẩm ở Macao

thermolabile hemolysin (tlh), thermostable nuclease (nuc)

spp., Vibrio cholerae, V.parahaemolyticus,

Staphylococcus aureus

(ipaH), attachment invasion locus (ail), invasion plasmid antigen

B (ipaB), enterotoxin extracellular secretion protein (epsM), a

species-specific region of the 16S–23S rDNA (Vpara)

Aeromonas hydrophila, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitca, Salmonella typhimurium, Vibrio

parahaemolytic

us

multiplex PCR

Mẫu nước biển ở Hồng Kong

Microbial

uidA, cth, invA, ctx và tl

Escherichia coli,

Multiplex PCR

Loài thủy sản (ốc, cua )

vulnificus, V

cholerae, and V

parahaemolytic

us

2 Vật liệu

3 Phương pháp

- Thu mẫu và xử lý mẫu

C/24h, thu huyền phù tế bào Tiếp tục ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa (sinh khối tế bào)

 Tách chiết DNA vi khuẩn (Phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn)

 Chuẩn bị 2 ống eppendorf đã ghi sẵn B4 (Mẫu rau) và B8 (Mẫu thịt)

 Hút lần lượt các thành phần sau:

- Khảo sát nhiệt độ lai

 Ta có thông số nhiệt độ lai của các mồi như sau:

- Lựa chọn nhiệt độ 53.0 0C, 54.9 0C, 56.70C, 59 0C, 63 0C để khảo sát

4 Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA

- Nhận xét chung:

 Phương pháp Multilex PCR đã khuếch đại thành công sản phẩm mẫu rau

và mẫu thịt ở khoảng nhiệt độ lai đã khảo sát Tuy nhiên, chưa trả lời được nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi

- Nhận xét riêng:

 Phương pháp Multilex PCR đã khuếch đại thành công sản phẩm mẫu rau B4 (Giếng 2) và mẫu thịt B8 (Giếng 9)

vi khuẩn E coli và Salmonella

nhiễm đồng thời 2 tác nhân một là E coli và Salmonella (307 bp), hai là Staphylococcus aureus (643 bp)

B CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH

DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT

 VI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THUỘC NHÓM ĐÔNG TRÙNG HẠ

THẢO

Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi nấm ký sinh côn

trùng thuộc nhóm đông trùng hạ thảo, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho con người

hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra, vươn dài như một ngọn cỏ và chui lên khỏi mặt đất, phát triển như một cái cây Từ đó mà cái tên đông trùng hạ thảo sinh ra

- Đông trùng hạ thảo là một loại dược liệu quí (mùa đông thì là dạng con thuốc, mùa hè là dạng cây thuốc), được phát hiện lần đầu tiên tại Trung Quốc từ rất lâu khoảng 620 sau công nguyên và chính thức được sử dụng vào thế kỷ 18, và ngày nay cũng được các nước phương Tây sử dụng làm loại thuốc hỗ trợ nhiều bệnh mạn tính

- Tại Việt Nam, sau thời gian nghiên cứu nhiều năm GS TSKH Đái Duy Ban

và TS Lưu Tham Mưu đã nhân nuôi được một giống đông trùng hạ thảo là

Isaria cerambycidae có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh virus, ung thư,

HIV/AIDS và một số chức năng khác

- Một số loài thuộc nhóm đông trùng hạ thảo Cordyceps acridophila,

Cordyceps ampullacea, Cordyceps bifusispora, Cordyceps brasiliensis, Cordyceps cardinalis, Cordyceps cicadae…

2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Là phản ứng chuỗi trùng hợp khuếch đại số lượng một phân đoạn DNA nào

đó trong ống nghiệm để tạo ra một số lượng lớn hơn hàng triệu đến hàng tỷ lần so với số lượng ban đầu nhằm các mục đích khác nhau như nhân dòng, đọc trình tự, phát hiện sự có mặt của bệnh tật, pháp y, phả hệ, an toàn thực phẩm…

II NỘI DUNG

ITS1 và ITS2 vùng bảo tồn 18S,5.8S

và 28S rDNA

stranded conformation polymorphism (PCR-SSCP)

PCR-single-Beauveria, Cordyceps và Paecilomyces

PCR amplification và DNA sequencing

Cordyceps

species,

Paecilomyces, Beauveria, Metarhizium, Hirsutella

PCR và Giải trình

tự

Cordyceps cf

Takaomontana, Cordyceps pruinosa,Isaria tenuipes,

Simplicillium chinense, Beauveria bassiana,

Hút lần lượt các thành phần trên vào ống eppendorf đã cho sẵn hệ sợi nấm

Thêm Cloroform (1V ) vào dịch nổi

vừa thu được

200µl

Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút

Tủa DNA

C trong 60 phút

Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 20 phút

Đổ dịch, thu cắn (thao tác dứt khoát)

 Chuẩn bị 2 ống eppendorf ký hiệu N4 và N4’

 Hút lần lượt các thành phần sau vào 2 eppendorf:

 Khảo sát ở 2 nhiệt độ 550

c Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA

Hệ số pha loãng bằng 80/3

- Bảng giá trị đo OD

 Nếu kết quả điện di có xuất hiện băng sản phẩm 950 bp là chính xác

- Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR

 Sau khi dùng phần mềm Chromas Lite để đọc kết quả giải trình tự, nhóm

có trình tự nucleotide như sau:

 Trình tự >LSSU2-F sequence exported from gttdv-vy DL0038B.ab1

LSSU2-F_A07_20140415-TGAAGAGTAGATCCAACAGGGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAA

ATTTGAAATCTGGCCCCCGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGCGAGGTG

CCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCACAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTCGGACAC

CGAGCCCGTGTGAAGCCCCTTCGAAGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGG

AGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGA

TCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGG

AAGCGCCCATGACCAGACTTGGGCCCGGTGAATCACCCGGCGTTCTCGCCGGTGCACTTT

GCCGGGCACAGGCCAGCATCAGTTTGGCGCGGGGGACAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCC

CTCGGGAGTGTTATAGCCCGCTGCGTAATACCCTGCGCCGGACTGAGGTACGCGCATCGC

AAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCGTC

TTCGTATGCGAGTGTTCGGGTGTCAAACCCCTACGCGGAATGAAAGTGAACGCAGGTGAG

AGCTTCGGCGCATCATCGACCGATCCTGATGTTCTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCATAC

GGGGCCGGACCCGAAAGAAGGTGAACTATGCCTGTATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCT

GGTGGAAGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCGAATCGATCGTCAAATATGGGCATGGGGGCG

AAAGACTAATCGAACCTTCTAGTAGCTGGTTTCCGCCGAAGCTCTCCTCTCTCACGGGAG

AGATAAAA

 Đưa trình tự này lên http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để so sánh với cơ sở dữ liệu trên NCBI Ta có hình ảnh sau:

- Nhận xét:

 Có thể kết luận kết quả giải trình tự này thuộc nấm ký sinh côn trùng

- Kết quả phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6)

 VI KHUẨN LACTIC DỰ TUYỂN LÀM PROBIOTIC CHO NGƯỜI

Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi khuẩn lactic, từ

đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho con người

I TỔNG QUAN

1 Vi khuẩn lactic

- Vi khuẩn lactic (LAB) đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khoẻ, được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp

- Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động,

không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase

âm Chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu

khí, là loại cơ thể có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như

kỵ khí

- Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau Tế bào của

chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus,

Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus Giống

Lactobacillus là giống lớn nhất trong 13 giống vi khuẩn sinh acid lactic với

hơn 100 loài được mô tả bởi Hugenholtz (1998)

II NỘI DUNG

l DNA

Species-specific PCR

Thịt (Artisanal Low-Acid Sausages)

Enterococcus faecalis hay Enterococcus durans

Randomly amplified polymorphic DNA-

polymerase chain reaction (RAPD-PCR)

men khô

2 Vật liệu

tục ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa (sinh khối tế bào)

Bổ sung lần lượt vào eppendorf chứa sẵn sinh khối tế bào vi khuẩn

Thêm Cloroform vào dịch nổi vừa thu

b Thực hiện phản ứng PCR

- Chuẩn bị 2 ống eppendorf ký hiệu L8 và L8’

 Hút lần lượt các thành phần sau:

 Chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 950

c Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA

 Hệ số pha loãng bằng 80/3

 Bảng giá trị đo OD

- Dựa vào chỉ số A260/A280, nhận thấy sản phẩm DNA sau tách chiết bị nhiễm protein ở mẫu vi khuẩn lactic L8

III KẾT QUẢ

- Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose

 Xuất hiện băng sản phẩm ở mẫu L8 và L8’ có kích thước 217 bp

- Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR

 Sau khi dùng phần mềm Chromas Lite để đọc kết quả giải trình tự, nhóm

có trình tự nucleotide như sau:

 Trình tự >1R sequence exported from 2R_D07_20130427-gttloc-(1).ab1

CATCGTATGTGCGTGTCCTTAGAGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTG

GATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTT

ACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTG

GAAGATTCCCACAATGGAGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTT

CGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGCGAGTAACTGTTGTCGGCGTGAC

GGTTCCACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCACCGCGGTAATACGTAGGTGGCA

AGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAGCGA

- Đưa trình tự này lên http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để so sánh với cơ sở dữ liệu trên NCBI Ta có hình ảnh sau:

- Nhận xét:

- Có thể kết quả giải trình tự này thuộc nhóm vi khuẩn lactic

- Dựng cây phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6)

C CHUYÊN ĐỀ 3

Mục tiêu: Tiếp cận các công cụ tin sinh học để khai thác dữ liệu, khảo sát in silico

trong việc chuẩn đoán một số bệnh di truyền, bệnh ung thư ở người…

I TỔNG QUAN

- Công cụ tìm kiếm thông tin và dữ liệu trên internet hiện nay rất rộng mở Với việc tiếp cận các thao tác cơ bản trên những phần mềm tin sinh học giúp sinh viên khai thác triệt để nguồn dữ liệu trên Google hay NCBI liên quan

đến các công trình nghiên cứu khoa học và khảo sát in silico liên quan đến

Công nghệ sinh học nói chung và Sinh học phân tử trong chăm sóc sức khỏe nói riêng

- Khảo sát in silico liên quan đến hướng chuẩn đoán/tiên lượng một số bệnh di truyền, bệnh ung thư ở người đang ngày được quan tâm và trở nên cần thiết

II NỘI DUNG

1 Khai thác dữ liệu từ các bài báo chuyên đề trong nội dung lý thuyết môn học Sinh học phân tử trong chăm sóc sức khỏe

Đột biến trên gen

Methyl hóa CpG trên promoter

Real-Time PCR

methyl và unmethyl

2 cặp mồi methyl và unmethyl

1 mồi ngược

và 7 mồi xuôi

2 cặp mồi methyl và unmethyl

Phenol-chloroform và biến Epited Kit

chloroform và biến đổi

Phenol-bisulfic bằng Epited Kit

TP.HCM

83 mẫu Pap smear từ bệnh viện Âu Lạc, Việt Nam

19 mẫu ung thư

32 mẫu gồm

27 mẫu Pap mear và 5 mẫu

mô

Đột biến trên LDLR

PCR

SSCP, giải trình tự Sanger

SSCP, giải trình tự trên pha bán rắn tự động

xuôi, một một ngược, một mồi đặc hiệu) LOL,UOL, ASO

18 cặp mồi cho phương pháp SSCP

Hai cặp mồi: cặp 1: mồi xuôi có gắn

biotin.(hoặc ngược lại) cặp 2: mồi ngược có gắn biotin.(hoặc ngược lại.)

Blood DNA Isolation Kit

2 Tiến hành khảo sát in silico cụ thể trên bài báo số 8: DNA Methylation

at the RARβ Promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer

- Thu thập cơ sở dữ liệu từ GenBank

phút

cao Cholesterol từ bệnh viện Shariati trong

đó có 30 mẫu bệnh nhân FH

80 mẫu bệnh nhân ở

Petrozavordk

20 bệnh nhân FH

- Từ đây ta khảo sát được đoạn có thể sử dụng làm mồi xuôi

 Trình tự chưa biến đổi bisulfite

5’CCGAGAACGCGAGCGATCCGAGCAGGGTTTGTCTGGGCACCGTCGGGGTAGGATCCGGAACGCATTCGGAAGGCTTTTGCAAGCATTTACTTGGAAGGAGAACTTGGGATCTTTCTGGGAACCCCCCGCCCCGGCTGGATTGGCC3’

3’GGCTCTTGCGCTCGCTAGGCTCGTCCCAAACAGACCCGTGGCAGCCCCATCCTAGGCCTTGCGTAAGCCTTCCGAAAACGTTCGTAAATGAACCTTCCTCTTGAACCCTAGAAAGACCCTTGGGGGGCGGGGCCGACCTAACCGG 5’

 Trình tự sau khi biến đổi bisulfite

 Trình tự sản phẩm MSP lần 1 (Chu kỳ 1)

5’TCGAGAACGCGAGCGATTCGAGTAGGGTTTGTTTGGGTATCGTCGGGGTAGGATTCGGAACGTATTCGGAAGGTTTTTGTAAGTATTTATTTGGAAGGAGAATTTGGGATTTTTTTGGGAATTTTTCGTTTCGGTTGGATTGGTT3’

3’AGCTCTTGCGCTCGCTAAGCTCATCCCAAACAAACCCATAGCAGCCCCATCCTAAGCCTTGCATAAGCCTTCCAAAAACATTCATAAATAAACCTTCCTCTTAAACCCTAAAAAAACCCTTAAAAAGCAAAGCCAACCTAACCAA5’

 Trình tự sản phẩm MSP lần 2 (Chu kỳ 2)

3’AGCTCTTGCGCTCGCTAAGCTCATCCCAAACAAACCCATAGCAGCCCCATCCTAAGCCTTGCATAAGCCTTCCAAAAACATTCATAAATAAACCTTCCTCTTAAACCCTAAAAAAACCCTTAAAAAGCAAAGCCAACCTAACCAA5’

5’TCGAGAACGCGAGCGATTCGAGTAGGGTTTGTTTGGGTATCGTCGGGGTAGGATTCGGAACGTATTCGGAAGGTTTTTGTAAGTATTTATTTGGAAGGAGAATTTGGGATTTTTTTGGGAATTTTTCGTTTCGGTTGGATTGGTT3’

III KẾT LUẬN

mồi GC trên mạch âm gắn vào mạch dương

(2) mồi CA trên mạch âm gắn vào mạch dương