Bài thực tập tốt nghiệp Tìm hiểu tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV

Ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới. Theo báo cáo của tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2012), hàng năm có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung và có khoảng 266.000 trường hợp ung thư cổ tử cung bị tử vong. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được phát hiện81. Theo WHO, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư cổ tử cung tăng cao nếu các trường hợp mắc bệnh được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp. HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae77, có hơn 100 type HPV. Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung, gồm có các type: 16, 18, 31, 33, 35,... Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata) gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44. Đáng lưu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới14167696. Bên cạnh đó, một số yếu tố nguy cơ khác dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của ung thư cổ tử cung như sự biến đổi epigenetics trong bộ gen, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá,…16.Một số công trình nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh ung526991. Tính chất methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen nêu trên được xem là dấu chứng sinh học (biomarker) trong tiên lượng, chẩn đoán sớm nhiều bệnh ung thư, trong đó có bệnh ung thư cổ tử cung41. Sự methyl hóa liên quan đến việc hình thành khối u ở ung thư cổ tử cung đã được phát hiện trên nhiều gen, ví dụ như DAPK, RARB, p16,…91.Gene DAPK (Deathassociated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21. Protein DAPK là nhân tố điều hòa dương cho cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)100. Ở trạng thái bình thường, DAPK ức chế khối u, tuy nhiên trong trường hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa thì hoạt động của DAPK bị ức chế dẫn đến ung thư cổ tử cung5991.Gene RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa cho thụ thể Retinoic acid beta. Protein RARB thuộc siêu họ thụ thể hormon thyroid steroid điều hòa quá trình phiên mã, tham gia vào đường truyền tín hiệu trung gian nội bào trong quá trình hình thành phôi, sự phát triển và biệt hóa tế bào101. Ở trạng thái bình thường, RARB ức chế khối u8, tuy nhiên trong trường hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa vượt mức thì hoạt động của RARB bị ức chế dẫn đến ung thư cổ tử cung5974.Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Tìm hiểu tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV”.Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ caonguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành).Nội dung nghiên cứu:Khảo sát dữ liệu: Thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung, tập trung xác định tần số methyl hóa bất thường (hypermethylation) trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen DAPK, RARB. Xác định phương pháp sinh học phân tử (MSP, NestedMSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB.Khảo sát in silico: Thu thập trình tự các gen DAPK, RARB và các đảo CpG trên vùng promoter thuộc các gen DAPK, RARB. Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với sinh học phân tử (MSP, NestedMSP) phù hợp nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB trên bộ mẫu có tính chất không nhiễm HPV (mẫu lành)nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc nguy cơ cao.

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người thầy, người

cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình và tâm huyết truyền đạt những kiến thức nền tảng về ngành học cho em trong suốt 4 năm qua Những kiến thức thầy cô truyền đạt thật sự rất cần thiết và quan trọng giúp em có cơ sở để viết lên bài Thực tập tốt nghiệp này

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Lê Huyền Ái Thúy và cô Trương Kim Phượng đã chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình Em mãi trân trọng và biết ơn về điều đó

Cảm ơn những người bạn cùng lớp, cùng phòng và những bạn cùng nhóm thí nghiệm đã luôn ở bên động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi những lúc tôi khó khăn nhất Cuối cùng, điều không thể thiếu sót, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã sinh con ra, nuôi dưỡng và đem đến cho con những điều tốt đẹp nhất trong cuộc sống này Con biết ơn rất nhiều vì ba mẹ đã tạo cho con điều kiện tốt nhất để con yên tâm học hành trong suốt 4 năm qua

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, kính mong thầy

cô có thật nhiều sức khỏe, mãi luôn đồng hành cùng sinh viên thân yêu trong sự nghiệp giáo dục của đất nước

Tôi xin chúc những người bạn của tôi sẽ hoàn thành xuất sắc đề tài thực tập tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, ngày 01/2016 Sinh viên thực tập

Trần Thị Thùy Trinh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

I.1 Tổng quan về ung thƣ 3

I.1.1 Khái niệm ung thư 3

I.1.2 Phân loại khối u 4

I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới 4_Toc440832480 I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam 5

I.2 Ung thƣ cổ tử cung 6

I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung 7

I.2.2 Phân loại ung thư cổ tử cung 7

I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung 8

I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới 9

I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 10_Toc440832489 I.3 Tổng quan về HPV 11

I.3.1 Human papillomavirus (HPV) 11

I.3.2 Phân loại type HPV 12

I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV 12

I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV 13

I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG 14

I.4.1 Epigenetics 14

I.4.2 Sự methyl hóa DNA 15

I.4.3 Đảo CpG 16

I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase) 16

I.5.1 Vị trí, cấu trúc 16

I.5.2 Chức năng 17

I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK 18

I.6 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) 19

I.6.1 Vị trí, cấu trúc 19

I.6.2 Chức năng 20

I.6.3 Sự methyl hóa trên gen RARB 21

I.7 Phương pháp xác định trạng thái methyl hóa DNA 22

I.7.1 Phương pháp MSP (Methylation – specific PCR) 22

I.7.2 Phương pháp Nested-MSP 24

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

II.1 Phương pháp nghiên cứu 25

II.1.1 Khảo sát dữ liệu 25

II.1.2 Khảo sát in silico 25

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

III.1 Kết quả khai thác dữ liệu 27

III.1.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) 27

III.1.2 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) 33

III.2 Kết quả khảo sát in silico 39

III.2.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) 39

III.2.2 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) 45

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

IV.1 Kết luận 51

IV.2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC PL1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Bp Base pairs

CIS Carcinomar in situ

CIN Cervical intraepithelial neoplasia

CpG Cytosine phosphodiester guanine

DNA Deoxyribonucleotic acid

HPV Human papillomavirus

IARC International Agency for Research on Cancer

IDT Integrated DNA Technologies

NCBI National Center for Biotechnology Information

NSCLC Non-small cell lung carcinoma

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymeration chain reaction

QMSP Quantitative MSP

RNA Ribonucleic acid

SCC Squamous cell carcinomar

SIL Squamous intraepithelial lesion

UTCTC Ung thƣ cổ tử cung

WHO World Health Organization

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu về gen DAPK

Bảng 3.2: Tần suất methyl hóa gen DAPK trong các loại ung thƣ

Bảng 3.3: Bộ dữ liệu tài liệu về gen RARB

Bảng 3.4: Tần suất methyl hóa gen RARB trong các loại ung thƣ

Bảng 3.5: Trình tự bộ mồi methyl và unmethyl gen DAPK

Bảng 3.6: Khảo sát thông số vật lý của bộ mồi methyl và unmethyl gen DAPK

Bảng 3.7: Trình tự bộ mồi methyl và unmethyl gen RARB

Bảng 3.8: Khảo sát thông số vật lý của bộ mồi methyl và unmethyl gen RARB

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thường và tế bào ung thư

Hình 1.2: Dự đoán về trường hợp ung thư trên toàn cầu năm 2012 – 2035

Hình 1.3: Vị trí cổ tử cung và cổ tử cung bị ung thư

Hình 1.4: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1 năm trên thế giới (2012)

Hình 1.5: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1 năm tại Việt Nam (2012)

Hình 1.6: Một số bệnh ung thư gây ra bởi HPV

Hình 1.7: Sự methyl hóa bất thường trong ung thư

Hình 1.8: Vị trí gen DAPK trên NST số 9

Hình 1.9: Gen DAPK trong con đường apoptosis

Hình 1.10: Vị trí gen RARB trên NST số 3

Hình 1.11: Một con đường phân tử ức chế tăng sinh tế bào được kích hoạt bởi RARB

Hình 1.12: Một cơ chế chuyển đổi nucleotide từ Cytosine thành Uracil với sodium bisulfite

Hình 1.13: Sự biến đổi DNA gốc bởi sodium bisulfite

Hình 1.14: Bộ mồi cho phương pháp methylation-specific PCR

Hình 1.15: Sơ đồ phương pháp Nested–MSP

Hình 3.1: Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo

sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Hình 3.2: Đồ thị mô tả các loại mẫu được sử dụng trong các công trình nghiên

cứu khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát các loại ung thư liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Hình 3.4: Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để khảo

sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen RARB

Hình 3.5: Đồ thị khảo sát các loại ung thư liên quan đến tính chất methyl hóa

vùng promoter trên gen RARB

Hình 3.6: Định vị gen DAPK trên NST số 9

Hình 3.7: Định vị đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK (Methprimer)

Hình 3.8: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngược methyl trên trình tự vùng

promoter gen DAPK

Hình 3.9: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngược unmethyl trên trình tự

vùng promoter gen DAPK

Hình 3.10: Cấu trúc đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK, vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên đảo CpG và vị trí bắt cặp của mồi gen DAPK

Hình 3.11: Định vị gen RARB trên NST số 3

Hình 3.12: Định vị đảo CpG trên vùng promoter gen RARB (Methprimer)

Hình 3.13: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngược methyl trên trình tự vùng

promoter gen RARB

Hình 3.14: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngược unmethyl trên trình tự

vùng promoter gen RARB

Hình 3.15: Cấu trúc đảo CpG trên vùng promoter gen RARB, vị trí nhận biết nhân

tố phiên mã trên đảo CpG và vị trí bắt cặp của mồi gen RARB

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới Theo báo cáo của tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2012), hàng năm có khoảng 528.000 trường hợp mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung và có khoảng 266.000 trường hợp ung thư cổ tử cung bị tử vong

Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được phát hiện[81] Theo WHO, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư cổ tử cung tăng cao nếu các trường hợp mắc bệnh được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp

HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[77], có hơn 100 type HPV Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung, gồm có các type: 16, 18, 31, 33, 35, Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý sùi mào gà (Condyloma Acuminata) gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44 Đáng lưu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung trên toàn thế giới[14][16][76][96] Bên cạnh đó, một số yếu tố nguy cơ khác dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của ung thư cổ tử cung như

sự biến đổi epigenetics trong bộ gen, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá,…[16]

Một số công trình nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh ung[52[69][91] Tính chất methyl hóa vượt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen nêu trên được xem là dấu chứng sinh học (biomarker) trong tiên lượng, chẩn đoán sớm nhiều bệnh ung thư, trong đó có bệnh ung thư cổ tử cung[41

Sự methyl hóa liên quan đến việc hình thành khối u ở ung thư cổ tử cung đã được

phát hiện trên nhiều gen, ví dụ như DAPK, RARB, p16,…[91]

Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21

Protein DAPK là nhân tố điều hòa dương cho cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)[100] Ở trạng thái bình thường, DAPK ức chế khối u, tuy nhiên trong trường hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa thì hoạt động của DAPK bị

ức chế dẫn đến ung thư cổ tử cung[59][91]

Gene RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa cho thụ

thể Retinoic acid beta Protein RARB thuộc siêu họ thụ thể hormon thyroid- steroid điều hòa quá trình phiên mã, tham gia vào đường truyền tín hiệu trung gian nội bào trong quá trình hình thành phôi, sự phát triển và biệt hóa tế bào[101] Ở trạng thái

bình thường, RARB ức chế khối u[8], tuy nhiên trong trường hợp đảo CpG trên vùng

promoter bị methyl hóa vượt mức thì hoạt động của RARB bị ức chế dẫn đến ung

thư cổ tử cung[59][74]

Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Tìm hiểu tính chất methyl hóa

trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với

yếu tố nhiễm HPV”

Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen

DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ

mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm HPV (mẫu lành)

Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát dữ liệu:

 Thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen DAPK và gen RARB liên quan

đến bệnh ung thư cổ tử cung, tập trung xác định tần số methyl hóa bất thường

(hypermethylation) trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen DAPK, RARB

 Xác định phương pháp sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm

khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB

Khảo sát in silico:

 Thu thập trình tự các gen DAPK, RARB và các đảo CpG trên vùng promoter

thuộc các gen DAPK, RARB Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl

phù hợp với sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính

chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB trên bộ mẫu có tính chất không

nhiễm HPV (mẫu lành)/nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc nguy cơ cao

PHẦN I: TỔNG QUAN

I.1 Tổng quan về ung thư

I.1.1 Khái niệm ung thư

Ung thư là các dạng bệnh lý do một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát dẫn đến sự tăng sinh bất thường hình thành các khối u (u lành, u ác tính) (hình 1.1) Những tế bào bất thường có khả năng xâm lấn ở các vùng mô lân cận hoặc di trú đến nhiều cơ quan khác nhau thông qua hệ thống máu và hình thành sự di căn, cuối cùng gây ung thư gây tử vong[3]

Ung thư bao gồm hơn 200 bệnh khác nhau được đặc trưng bởi sự tăng sinh bất thường của tế bào khối u, tế bào ác tính (do vượt qua sự kiểm soát ―checkpoint‖ trong chu trình tế bào) để hình thành khối u trong cơ quan hoặc các mô Trong trường hợp của bệnh ung thư máu, tế bào bình thường bị ―áp chế hoặc chèn lấn‖ trong máu và tủy xương[105]

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới (WHO, 2013), ung thư là các dạng bệnh lý ảnh hưởng ở tất cả các đối tượng, trẻ em, phụ nữ và đàn ông Một số dữ liệu ghi nhận bệnh ung thư tập trung chủ yếu ở những nước kém phát triển và đang phát triển Đối với nam giới, các loại ung thư thường gặp là ung thư phổi, ung thư tuyến

Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thường và tế bào ung thư [105]

tiền liệt, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày và ung thư gan Trong khi đó, đối với nữ giới các loại ung thư thường gặp là ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, và ung thư dạ dày

I.1.2 Phân loại khối u [6]

Theo công bố của Alison năm 2001, khối u bao gồm khối u lành tính hay khối u ác tính

Khối u lành tính là các khối u có mức độ phát triển tạo khối chậm nhưng không xâm lấn đến các mô lân cận Khối u lành tính thường ít đặt ra mối đe dọa và thường dễ dàng cắt bỏ, ngoại trừ khi phát triển trong một không gian giới hạn như hộp sọ Tuy nhiên, nhiều khối u lành tính có tiềm năng ác tính đặc biệt xuất hiện ở trong ruột già Do vậy, cần loại bỏ trước khi khối u này phát triển thành khối u ác tính

Khối u ác tính là các khối u thường có mức độ phát triển nhanh chóng, có khả năng xâm lấn các mô xung quanh và di cư, lây lan đến các cơ quan khác của cơ thể Các

tế bào khối u ác tính có thể tách ra khỏi khối u nguyên phát theo hệ thống máu và bạch huyết để hình thành các khối u thứ phát

I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới

Theo Globocan (2012), có 14,1 triệu trường hợp mới mắc ung thư, 8,2 triệu ca tử vong do ung thư và 32,6 triệu người đang sống với ung thư (trong vòng 5 năm chẩn đoán) trên toàn thế giới Có khoảng 57% trong các trường hợp mắc ung thư mới, 65% của các trường hợp tử vong do ung thư và 48% trong các trường hợp ung thư (phổ biến trong 5 năm) xảy ra ở các khu vực kém phát triển

Hơn 60% trong tổng số các trường hợp mới mắc ung thư hàng năm xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và Nam Mỹ Những khu vực này chiếm khoảng 70% các ca tử vong do ung thư trên thế giới[104]

Theo Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research

on Cancer, IARC) của WHO đã dự đoán số trường hợp mắc mới ung thư ước tính

từ 14 triệu người vào năm 2012 sẽ lên 22 triệu người sau 2 thập kỷ nữa (hình 1.2)

Cũng trong giai đoạn này, số trường hợp tử vong do ung thư ước tính sẽ tăng từ 8,2 triệu mỗi năm lên 13 triệu người

I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam

Theo số liệu báo cáo tại một hội nghị khoa học quốc tế về phòng chống và kiểm soát ung thư được tổ chức tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội (2013), Việt Nam có khoảng 110.000 trường hợp mới mắc ung thư ở Việt Nam mỗi năm và hơn 73% trường hợp mắc ung thư đã tử vong Đây là một trong những tỷ lệ cao nhất trên thế giới Theo báo cáo tại hội nghị, 15 dạng ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam gồm có: ung thư phổi, ung thư vú, ruột già, dạ dày, gan, tuyến tiền liệt, tử cung, cổ tử cung, thực quản, bàng quang, u lympho không hodgkin, khoang miệng, ung thư máu, tụy, buồng trứng và thận

Bệnh nhân bị ung thư vú ở Hà Nội cao hơn ở TP.HCM 1,5 lần Ung thư gan là rất phổ biến ở nam giới tại TP.HCM trong khi đó ung thư phổi là loại ung thư phổ biến

ở Hà Nội Tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội, số lượng bệnh nhân ung thư có xu hướng tăng và số người chết hàng năm do ung thư trung bình khoảng 82.000 người, chiếm 73,5% trong tổng số bệnh nhân tại bệnh viện[97]

Hình 1.2: Dự đoán về trường hợp ung thư trên toàn cầu năm 2012 - 2035

Tại Bệnh viện K (Hà Nội), số lượng bệnh nhân ung thư tăng 20-30% mỗi năm Hầu hết bệnh nhân tìm đến bác sĩ khi họ đang ở vào giai đoạn cuối, do đó tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư là thấp[97]

I.2 Ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung (cervical cancer) là dạng ung thư ác tính, hình thành từ tầng tế bào biểu mô trong vùng cổ tử cung[98] Các tế bào bình thường của cổ tử cung trải qua quá trình bị biến đổi từ giai đoạn tiền ung thư chuyển biến thành ung thư cổ tử cung Giai đoạn tiền ung thư gồm các dạng tổn thương và loạn sản (dysplasia): tân sản (loạn sản) nội biểu mô (cervical intraepithelial neoplasia, CIN), tổn thương biểu

mô vảy (squamous intraepithelial lesion, SIL)[99] (hình 1.3)

Các loại ung thư cổ tử cung: ung thư biểu mô tế bào vảy (squamous cell carcinoma, SCC) và ung thư tuyến (adenocarcinoma) Các loại khác của bệnh ung thư cổ tử cung, chẳng hạn như u mêlanin và ung thư hạch bạch huyết,…[99]

Hình 1.3: Vị trí cổ tử cung và cổ tử cung bị ung thư [95]

I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung [95]

Sàng lọc ung thư cổ tử cung được thực hiện bởi thử nghiệm Pap’ Smear nhằm phát hiện các tế bào tiền ung thư, tế bào bất thường Nếu ung thư không được phát hiện sớm, nó có thể lây lan từ cổ tử cung vào âm đạo và các khu vực quanh cổ tử cung Giai đoạn phát triển tiếp tục của ung thư cổ tử cung có thể lây đến hạch bạch huyết vùng chậu và các cơ quan lân cận vùng chậu Cuối cùng, các tế bào ung thư có thể

di căn đến các cơ quan nội tạng khác như thận, gan và phổi, thông qua hệ thống bạch huyết hoặc máu

Có 4 giai đoạn của ung thư cổ tử cung:

 Giai đoạn I: Đây là giai đoạn hình thành u nhú, khối u khu trú hoàn toàn tại

I.2.2 Phân loại ung thư cổ tử cung

Dựa vào những thay đổi tổn thương biểu mô tế bào vảy (squamous intraepithelial lesion, SIL), có thể phân chia thành hai loại:

SIL mức độ thấp (low squamous intraepithelial lesion, LSIL) đề cập tới những thay đổi sớm về kích thước, hình dáng và số lượng tế bào biểu mô cổ tử cung Thông thường, một số tổn thương LSIL có thể tự biến mất Tuy nhiên, theo thời gian, một

số tổn thương khác có thể phát triển rộng hơn hoặc trở nên bất thường hơn, tạo nên tổn thương mức độ cao (high squamous intraepithelial lesion, HSIL)[93]

Ở mức độ tiền ung thư, các dạng LSIL được phân loại theo hiện tượng loạn sản nhẹ hoặc hiện tượng tân tạo trong biểu mô cổ tử cung 1 (CIN 1) Những thay đổi ban

đầu như vậy thường xảy ra nhất ở những phụ nữ tuổi từ 25-35 nhưng cũng có thể xuất hiện ở những nhóm tuổi khác[93]

HSIL diễn ra khi có sự tăng sinh bất thường của các tế bào có dấu hiệu tiền ung thư trên vùng biểu mô cổ tử cung Do ở giai đoạn sớm, nên khó phân biệt nhóm tế bào này với tế bào thường (lành) Những tế bào tiền ung thư có thể không trở thành tế bào ung thư và không xâm lấn vào những lớp tế bào sâu hơn của cổ tử cung trong nhiều tháng, có thể trong nhiều năm Diễn tiến ung thư cổ tử cung xuất hiện khi có HSIL với hiện tượng loạn sản mức độ vừa hoặc nặng (CIN 2 hoặc 3) hoặc ung thư

biểu mô tại chỗ (carcinomar in situ, CIS) Sự tiến triển ung thư thường xuất hiện

nhiều nhất ở những phụ nữ trong độ tuổi từ 30-40 nhưng cũng có thể xảy ra ở những độ tuổi khác[93]

I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung

I.2.3.1 Nhiễm Human papillomavirus (HPV)

Human papillomavirus là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến ung thư cổ tử cung[81] Bên cạnh đó, có nhiều bằng chứng cho thấy rằng, HPV là một yếu tố có liên quan đến ung thư đường sinh dục khác (other anogenital cancer) như hậu môn, âm hộ, âm đạo, dương vật, ung thư đầu và cổ[81]

Các bằng chứng khoa học nhận định các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sự phát triển của ung thư cổ tử cung bao gồm: sự biến đổi bất thường cơ chế epigenetics, mang thai nhiều lần, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá, thuốc ức chế miễn dịch, nhiễm trùng với các bệnh lây truyền qua đường tình dục và chế độ dinh dưỡng[16]

I.2.3.2 Mang thai nhiều lần

Theo báo cáo của Trung tâm nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer, IARC), phụ nữ mang thai đủ tháng ba hay bốn lần hoặc phụ nữ

có từ khoảng bảy lần sinh trở lên có nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung lần lượt cao gấp 2,6 lần và 3,8 lần so với những người chưa sinh con[16]

I.2.3.3 Sử dụng thuốc tránh thai

Theo báo cáo của Trung tâm nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), việc sử dụng thuốc tránh thai trong suốt mười năm có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung lên gấp 4 lần ở phụ nữ bị nhiễm HPV[16] Ngoài ra, việc sử dụng thuốc ngừa thai uống trong năm năm hay lâu hơn có thể làm tăng đến 4 lần nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung ở phụ nữ nhiễm HPV[56]

I.2.3.4 Hút thuốc lá

Hút thuốc lá được cho là có liên quan đến ung thư cổ tử cung từ cuối những năm

1970[83] Tổng hợp dữ liệu từ Trung tâm nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) cho thấy rằng, việc hút sáu điếu thuốc mỗi ngày hoặc nhiều hơn có thể làm tăng nguy cơ

bị ung thư cổ tử cung ít nhất 2 lần so với người không hút thuốc[16]

I.2.3.5 Nhiễm trùng với các bệnh lây truyền qua đường tình dục

Phụ nữ có nhiễm HPV và đồng thời bị nhiễm bệnh lây truyền qua đường tình dục

như Chlamydia trachomatis và Herpes simplex vius-2 (HSV-2) thì có nhiều khả

năng mắc UTCTC hơn so với phụ nữ không bị đồng nhiễm IARC ghi nhận phụ nữ

đồng nhiễm HPV và Chlamydia trachomatis hoặc HSV-2 có thể có nguy cơ mắc

ung thư cổ tử cung tăng gấp hai lần so với phụ nữ bình thường[16]

I.2.3.6 Chế độ dinh dưỡng

Mặc dù công bố khoa học về mối liên hệ giữa chế độ dinh dưỡng với ung thư cổ tử cung chưa được công bố nhiều, nhưng một số nghiên cứu đã cho thấy mối liên quan giữa chế độ ăn các loại trái cây, rau quả với việc giảm nguy cơ UTCTC Ngoài ra,

có nhiều minh chứng vai trò của vitamin A, các hợp chất carotenoid, vitamin C và vitamin E có khả năng giảm nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung[16]

I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới (WHO, 2012), ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến thứ 4 trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới, với khoảng 528.000 trường hợp mới và 266.000 trường hợp tử vong

Theo Globocan (2012), ung thư cổ tử cung là bệnh ung thư phổ biến nhất trên phụ

nữ ở Đông và Trung Phi Hầu hết các trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung xảy

ra ở khu vực các nước kém phát triển

I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Ung thư cổ tử cung đứng hàng thứ 2 trong nhóm ung thư gây tử vong cao nhất ở phụ nữ Việt Nam trong độ tuổi 15 – 44 Hàng năm có khoảng 5.146 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được chẩn đoán[81]

Theo số liệu chính thức phát hành tại một hội nghị khoa học quốc tế về phòng chống và kiểm soát ung thư được tổ chức tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội (2013), tỷ

lệ phụ nữ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở TP.HCM là cao hơn so với Hà Nội 6 lần

Hình 1.4: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1

năm trên thế giới (2012)

I.3 Tổng quan về HPV

I.3.1 Human papillomavirus (HPV)

Human papillomavirus (HPV) là virus thuộc họ Papillomaviridae[77], được phát hiện ở nhiều vật chủ khác nhau bao gồm cả động vật và con người[14]

HPV có hơn 200 type khác nhau về vật liệu di truyền trong đó có khoảng 85 type

đã biết rõ đặc điểm và khoảng 40 type đã được xác định ở niêm mạc đường sinh dục người[14][57]

Hình 1.5: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thư tính trên 100.000 người/ 1

năm tại Việt Nam (2012)

I.3.2 Phân loại type HPV

Dựa vào mối liên quan với ung thư cổ tử cung, u nhú và thương tổn da (precursor lesions), HPV có thể được chia thành HPV type nguy cơ cao (high-risk HPV types)

và HPV type nguy cơ thấp (low-risk HPV types)[14]

HPV nhóm nguy cơ thấp bao gồm các type: 6, 11, 42, 43 và 44[14] HPV type nguy

cơ thấp với bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ, thường chỉ gây ra các u lành biểu

mô (u nhú gai, mụn cóc )[2] Tuy nhiên, một số HPV type nguy cơ thấp được tìm thấy trong mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung[14]

HPV nhóm nguy cơ cao bao gồm các type: 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56,

58, 59, 66, 68 và 70[14] HPV type nguy cơ cao được phát hiện ở những trường hợp

bị tổn thương biểu mô vảy (squamous intraepithelial lesions, SIL) HPV type nguy

cơ cao có khả năng gắn chèn DNA vào bộ gen tế bào chủ, dẫn đến sự rối loạn quá trình tăng sinh và phân bào, hình thành khối u ác tính và ung thư[19] Đáng lưu ý, HPV type 16 và 18 là nguyên nhân gây ra khoảng 70% các trường hợp ung thư cổ

tử cung trên toàn thế giới[39][81]

Ngoài ra, một số tác giả còn đề cập đến HPV nhóm nguy cơ trung bình (intermediate- risk HPV types) bao gồm các type: 9, 10, 15, 38, 42, 65, 66, 67, 68,

69, 70, 71, 72, 76, 79, 80, 82, 90, 91, 105 và 122[14]

I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV

Theo công bố khoa học của Cutts và cộng sự (2007), HPV là nguyên nhân chính dẫn đến một số bệnh ung thư: ung thư cổ tử cung (100%), ung thư hậu môn (90%), ung thư bộ phận sinh dục ngoài (âm hộ, âm đạo và dương vật) (40%), ung thư hầu họng (>= 12%) và ung thư miệng (>=3%) (hình 1.6)[24]

I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV

Số trường hợp dương tính với HPV-16 chiếm khoàng 50% tổng số trường hợp bệnh nhân ung thư cổ tử cung Thêm vào đó, hơn 50% các trường hợp bệnh nhân có khối

u ác tính dương tính với HPV-18 Điều này cho thấy rằng, sự tích hợp bộ gen HPV trong một số trường hợp đã góp phần dẫn đến hình thành khối u ác tính

Trong những thương tổn có episome của HPV, protein E2 trực tiếp ức chế sự biểu

hiện của gen sớm như là một phần của cơ chế điều hòa quá trình sao chép Sự chèn

bộ gen virus HPV thường làm mất biểu hiện protein E2, dẫn đến việc giải mã biểu

hiện của 2 oncogenes là E6 và E7[55], đây là hai yếu tố quan trọng dẫn đến rối loạn

sự tăng sinh và sự chết theo chương trình của tế bào chủ[55][68]

Protein E6 ức chế hoạt động của p53 khóa cơ chế chết theo chương trình của tế bào

[68] Trong khi đó, protein E7 ức chế pRB kiểm soát chu trình tế bào (cell-cycle)[68]

Do vậy, việc chèn bộ gen virus HPV là một bước cốt yếu trong quá trình dẫn đến ung thư[96]

Hình 1.6: Một số bệnh ung thư gây ra bởi HPV [24]

Protein E6 của HPV type nguy cơ cao bao gồm khoảng 150 acid amin và bao gồm 2 motif ngón tay kẽm (zinc finger) Protein E6 định vị ở cả nhân và tế bào chất của tế bào sừng nhiễm HPV Một trong những chức năng chính của E6 là khả năng tương tác gián tiếp với p53 thông qua sự điều hòa chu kỳ tế bào P53 là một protein ức chế khối u tham gia vào sự điều khiển điểm dừng ―checkpoints‖ trong chu trình tế bào của cả pha G1/S và pha G2/M Để đối phó với sự hỏng DNA và hủy tế bào (cellular

stress), gen ức chế khối u p53 hoạt động phiên mã sự biểu hiện của nhân tố điều hòa

khác nhau, nó bao gồm việc kìm hãm chu trình tế bào hoặc/và gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) Protein E6 tương tác với p53 bởi sự hình thành phức hợp với E6AP Protein p53 bị ubiquitin hóa bởi enzym ubiquitin dẫn đến việc giảm trạng thái ổn định của p53 qua đó làm giảm khả năng tổng hợp DNA trong tế bào và cho phép virus sao chép[33]

Protein E7 bao gồm khoảng 98 acid amin và bao gồm 3 vùng bảo tồn gọi là CR1, CR2 và CR3 Vùng domain CR1 bao gồm motif đầu tận cùng N, CR2 bao gồm motif LXCXE gián tiếp gắn kết E7 với protein ức chế khối u Rb (retinoblastoma) và CR3 bao gồm 2 motif ngón tay kẽm (zinc finger) Một trong những chức năng chính của protein E7 trong chu kỳ sống của HPV là liên kết và làm suy giảm protein

Rb[33] Protein Rb là yếu tố điều hòa chính của chu trình tế bào Phosphory hóa Rb kiểm soát chu trình tại pha G1/S của chu trình tế bào thông qua sự gắn kết với yếu

tố phiên mã E2F, điều này kích hoạt sự phiên mã của nhiều thành phần tham gia vào sự sao chép trong pha S Sự liên kết giữa protein E7 và Rb có thể phá vỡ phức hợp Rb-E2F qua đó giải phóng phức hợp E2F dẫn đến kết quả thúc đẩy sớm pha S

và tổng hợp DNA[33][55] Các phức hợp E2F được tìm thấy ở vùng promoter của nhiều gen, nó có liên quan đến sự điều hòa chu trình tế bào, biệt hóa (differentiation), phân bào (mitosis) và chết theo chương trình (apoptosis)[55]

I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG

I.4.1 Epigenetics

Epigenetics lần đầu tiên được C H Waddington định nghĩa là ―sự tương tác nhân quả giữa gen và sản phẩm của gen, điều đó dẫn đến kiểu hình được hình thành‖

Hiện nay, epigenetics được nhận định là ―sự biến đổi di truyền trong biểu hiện gen xảy ra độc lập với sự biến đổi xảy ra trong trình tự DNA ban đầu‖[69]

Cơ chế epigenetics giữ vai trò cho sự phát triển bình thường của tế bào và giữ ổn định cho biểu hiện gen ở động vật có vú Sự bất thường của quá trình epigenetics có thể dẫn đến biến đổi chức năng gen và hình thành tế bào ác tính Sự biến đổi epigenetics trong bộ gen được coi là một dấu hiệu hình thành của ung thư Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, sự biến đổi histone, định vị nucleosome, các RNA không mã hóa và sự biểu hiện chuyên biệt của microRNA[68]

I.4.2 Sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA là một trong những biến đổi epigenetics được nghiên cứu nhiều nhất ở động vật có vú[69] Nhiều nghiên cứu cho thấy methyl hóa DNA đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý ở động vật có vú: biểu hiện gen, phát triển của phôi thai, tăng sinh tế bào, biệt hóa, in dấu bộ gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và ổn định nhiễm sắc thể[47][54] Sự methyl hóa DNA thường xảy ra

ở base Cytosine (C) đứng trước base Guanosine (G) ở vùng điều hòa gen thuộc vùng promoter[4][47]

Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi nhóm enzym DNA methyltransferase, là phản ứng hóa học chuyển một nhóm methyl (CH3) từ S-adenosyl-methionine (SAM) đến

vị trí C5 của phân tử Cytosine tạo thành dạng 5-methylcytosine (5mC)[54]

Sự methyl hóa bất thường gồm có methyl hóa vượt mức (hypermethylation) và giải methyl hóa (hypomethylation) Sự methyl hóa vượt mức tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u dẫn đến sự ―im lặng‖ của các gen này Ngược

lại, sự giải methyl hóa tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của các ―oncogene‖ dẫn đến kích hoạt sự biểu hiện của các ―oncogene‖, dập tắt cơ chế chết theo chương

trình của tế bào (hình 1.7)[88]

I.4.3 Đảo CpG

CpG là các cặp dinucleotide được hình thành bởi liên kết phosphodiester giữa cytosine và guanine Ở cơ thể người, các đảo CpG có kích thước trong khoảng 300-

3000 bp, tập trung ở đầu 5’ của các gen và thuộc 60% các vùng promoter của gen[4]

I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)

I.5.1 Vị trí, cấu trúc

Gene DAPK (Death-Associated Protein Kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21, có

kích thước 211.407 bp, định vị ở nucleotide 87.497.228 đến 87.708.634 trên nhiễm

sắc thể số 9 Gen DAPK mã hóa protein DAPK, là nhân tố điều hòa dương cho cơ

chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)[67][102]

Hình 1.7: Sự methyl hóa bất thường trong ung thư [88]

Hình 1.8: Vị trí gen DAPK trên NST số 9 [100]

I.5.2 Chức năng

Gen Death-associated protein kinase (DAPK) mã hóa cho enzyme kinase

Serine/Threonine được điều hòa bởi Calcium (Ca2+

)/calmodulin (CaM) có cấu trúc chỉ khoảng 160 kD[100]

Enzym kinase Serine/Threonine tham gia vào nhiều đường tín hiệu tế bào kích hoạt

tế bào sống, cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) và sự tự tiêu của tế bào (autophagy)[100][51]

Gen DAPK gián tiếp điều hòa apoptosis bằng cách kiểm soát con đường ổn định

protein (protein stability) và tình trạng phosphory hóa[92]

DAPK là một thành phần nội tại dọc theo con đường p19/MDM2/p53 và được kích

hoạt bởi oncogen c-Myc hoặc E2F-1 nhằm tạo ra apoptosis DAPK được

―up-regulated‖ bởi tín hiệu tăng sinh vượt mức và hoạt động ―upstream‖ của p19 và p53 dẫn đến sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Sự bất hoạt hoặc giảm tín hiệu của DAPK sẽ làm giảm sự đáp ứng của p53 với c-Myc hoặc E2F-1, theo đó làm giảm hoạt động của p53 trong kìm hãm sự tăng trưởng của tế bào (hình 1.9)[67]

Hoạt động của DAPK đi theo 2 con đường độc lập, một là con đường

p19/MDM2/p53 và hai là con đường phosphoryl hóa vách tế bào (cytoskeleton) thông qua MLC (myosin light chain) Hoạt động của riêng rẽ từng con đường không

đủ để cảm ứng cho sự gây chết tế bào, sự hội tụ của cả hai con đường mới dẫn đến việc kích hoạt caspase và apoptosis[67]

I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK

Nhiều công trình nghiên cứu tính đến năm 2015 cho thấy trạng thái methyl hóa trên

gen DAPK có liên quan đến nhiều loại ung thư như ung thư cổ tử cung, ung thư

phổi, ung thư dạ dày, ung thư bàng quang, ung thư bạch cầu, ung thư da, ung thư đại trực tràng và ung thư thận[5][7][20][21][26][45][58][91]…

Công trình nghiên cứu của Narayan và cộng sự (2003) xác định tần suất methyl hóa

gen DAPK là 45,1%, tương ứng với 37/82 mẫu ung thư cổ tử cung[59]

Một công trình nghiên cứu của Jeong và cộng sự (2006) ghi nhận tính chất methyl

hóa vượt mức vùng promoter gen DAPK trên ung thư cổ tử cung Kết quả nghiên

cứu xác định tần suất methyl hóa ở mẫu mô ung thư cổ tử cung và mẫu mô cổ tử cung bình thường (mẫu lành) lần lượt là 44,9% (35/78 mẫu bệnh phẩm ung thư) và 4,2% (1/24 mẫu lành)[40]

Hình 1.9: Gen DAPK trong con đường apoptosis[67]

Công trình nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2008) khảo sát sự methyl hóa trên

vùng promoter thuộc gen DAPK trên 52 mẫu biểu mô ung thư cổ tử cung và 60 mẫu

ung thư biểu mô tại chỗ (cervical intraepithelial neoplasia, CNI) Công trình nghiên cứu xác định tần suất methyl hóa lần lượt là 65,4% (34/52) và 18,3% (11/60) Trong

khi đó, tất cả mẫu lành không có tính chất methyl hóa trên gen DAPK [91]

Công trình nghiên cứu của Tang và cộng sự (2000) nghiên cứu về sự methyl hóa

trên gen DAPK trên ung thư phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung carcinoma,

NSCLC) Trong tổng số 135 mẫu bệnh phẩm thuộc các bệnh nhân giai đoạn 1 đã trải qua phẫu thuật Kết quả nghiên cứu ghi nhận trạng thái methyl hóa vượt mức

xảy ra ở vùng promoter thuộc gen DAPK là 44% (59/135 mẫu bệnh phẩm)[73]

Năm 2015, công trình nghiên cứu của Almeida và cộng sự thực hiện nghiên cứu về

sự methyl hóa trên ung thư đại trực tràng Công trình được tiến hành trên 5 mẫu sinh thiết khối u của bệnh nhân ung thư đại trực tràng và 7 mẫu sinh thiết liền kề

khối u Kết quả cho tần số trạng thái methyl hóa gen DAPK ở hai trường hợp lần

lượt là 80% tương ứng với 4/5 trường hợp và 100% tương ứng với 7/7 trường hợp[7]

I.6 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta)

I.6.1 Vị trí, cấu trúc

Gene RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) nằm trên nhiễm sắc thể 3p24, có kích

thước 423.601 bp, định vị ở nucleotide 25.174.332 đến 25.597.932 trên nhiễm sắc

thể số 3 Gen RARB mã hóa cho thụ thể retinoic acid beta RARB Gen RARB thuộc

siêu họ thụ thể hormon thyroid - steroid điều hòa quá trình phiên mã[86][101][103]

Hình 1.10: Vị trí gen RARB trên NST số 3[101]

I.6.2 Chức năng

RARB có bản chất là vitamin A ở trạng thái hoạt động, tham gia vào đường truyền

tín hiệu trung gian nội bào (con đường kinh điển) trong quá trình hình thành phôi,

sự phát triển và biệt hóa tế bào (hình 1.1)[101]

Gen RARB được biết như một gen ức chế khối u bởi sự tương tác với retinoic acid

Sự biểu hiện của gen RARB thường vắng mặt (absent) hoặc điều hòa ngược trong

mô khối u[32][88]

RARB là một trong ba thụ thể retinoic acid (RAR alpha, RAR beta, RAR gama)

thường xuyên bị xóa bỏ hoặc im lặng ở giai đoạn đầu trong quá trình hình thành khối u[8] Nhiều nghiên cứu với mô hình in vitro của khối u ác tính trong ung thư tinh hoàn, tế bào ung thư vú và tế bào ung thư cổ tử cung chứng minh rằng RARB là

cần thiết cho tác dụng chống tăng sinh nhờ vào retinoid[8] Hơn nữa, sự biểu hiện

của gen RARB thường xuyên bị mất trong mô tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ,

ung thư biểu mô đầu và cổ tế bào vảy và ung thư vú[8]

Hình 1.11: Một con đường phân tử ức chế tăng sinh tế bào được

kích hoạt bởi RARB[23]

Dưới tác động của quá trình oxy hóa retinaldehyde (RDH), vitamin A (retinol) được chuyển hóa thành retinal Nhờ xúc tác của enzyme retinaldehyde dehydrogenase (RALDH), retinal tiếp tục biến đổi thành retinoic acid (RA) Các phân tử RA được đưa đến nhân tế bào nhờ vào protein Cellular Retinoic Acid Binding Protein (CRABP) Sau đó, RA tương tác với thụ thể RARα (retinoic acid receptor α) thúc

đẩy sự điều hòa biểu hiện ―downstream‖ của một số gen, trong đó có gen RARβ[23]

I.6.3 Sự methyl hóa trên gen RARB

Nhiều công trình nghiên cứu (cập nhật đến năm 2015) ghi nhận trạng thái methyl

hóa trên gen RARB có liên quan đến nhiều loại ung thư như ung thư cổ tử cung, ung

thư vú, ung thư phổi, ung thư bàng quang, ung thư đầu và cổ[19][75][79][15][63]…

Công trình nghiên cứu của Ivanova và cộng sự (2002) xác định tần suất methyl hóa

gen RARB là 40% tương ứng với 8/20 mẫu ung thư cổ tử cung[37]

Công trình nghiên cứu của Choi và cộng sự (2007) ghi nhận tính chất methyl hóa

trên vùng promoter thuộc gen RARB Kết quả nghiên cứu xác định tần suất methyl

hóa ở mẫu mô ung thư cổ tử cung và mẫu mô cổ tử cung bình thường (mẫu lành) lần lượt là 41% (15/37 mẫu bệnh phẩm ung thư) và trạng thái methyl hóa vượt mức không được phát hiện ở mô bình thường[19]

Công trình nghiên cứu của Narayan và cộng sự (2007) ghi nhận tính chất methyl

hóa gen RARB trên 82 mẫu ung thư cổ tử cung Kết quả nghiên cứu xác định tần

suất methyl hóa là 29,3% (24/82 mẫu bệnh phẩm ung thư)[59]

Một công trình nghiên cứu của Widschwendter và cộng sự (2000) khảo sát sự

methyl hóa gen RARB vùng promoter gen RARB trên ung thư vú Kết quả nghiên

cứu xác định tần suất methyl hóa là 37,5% (6/16 mẫu bệnh phẩm)[82]

Năm 2014, công trình của Bhagat và cộng sự thực hiện nghiên cứu về sự methyl

háo gen RARB trên ung thư buồng trứng Kết quả cho tần số trạng thái methyl hóa gen RARB là 52% tương ứng với 12/23 mẫu bệnh phẩm[12]

I.7 Phương pháp xác định trạng thái methyl hóa DNA

I.7.1 Phương pháp MSP (Methylation – specific PCR)

Methylation – specific PCR (MSP) là phương pháp đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép xác định tình trạng methyl hóa ở hầu hết đảo CpG thuộc vùng promoter trên từng gen[34]

 Nguyên tắc phản ứng MSP

Đầu tiên, DNA bộ gen được biến đổi bằng sodium bisulfite Sau quá trình biến đổi, Cytosine không bị methyl hóa (unmethylated cytosines) được chuyển đổi thành Uracil, trong khi đó Cytosines bị methyl hóa (5-methylcytosines) vẫn không bị thay đổi (hình 1.12)[25]

Tiếp theo, phản ứng PCR thực hiện với hai cặp mồi: (1) một cặp mồi chuyên biệt cho DNA bị methyl hóa (M); (2) một cặp mồi chuyên biệt cho DNA không bị methyl hóa (U)

Để phân biệt trạng thái DNA methyl hóa hay DNA không bị methyl hóa thì trình tự mồi phải chứa nhiều hơn một cặp dinucleotide CpG Tuy nhiên, các cặp mồi methyl hóa (M) và không methyl hóa (U) có chứa vị trí CpG giống nhau nhưng vị trí khởi đầu khuếch đại (start point) và kích thước sản phẩm MSP có thể không giống nhau[43]

Kết quả MSP xác định các tình trạng methyl hóa: (a) methyl hóa hoàn toàn khi chỉ khuếch đại thành công sản phẩm PCR với cặp mồi methyl hóa (M); (b) không methyl hóa khi chỉ khuếch đại thành công sản phẩm PCR với cặp mồi không methyl hóa (U); (c) methyl hóa không hoàn toàn khi khuếch đại thành công với cặp mồi M

và U [43] (hình 1.14)

Hình 1.12: Một cơ chế chuyển đổi nucleotide từ Cytosine thành Uracil với

sodium bisulfite [25]

Hình 1.13: Sự biến đổi DNA gốc bởi sodium bisulfite

(Trình tự DNA gốc từ vùng promoter của gen RUNX3, mã số truy cập

NM_004350) [43]

Hình 1.14: Bộ mồi cho phương pháp methylation-specific PCR [43]

I.7.2 Phương pháp Nested-MSP

Phản ứng Nested-MSP là phản ứng MSP cải tiến, được tiến hành với hai bộ mồi [43](hình 1.15) Trong phản ứng PCR đầu tiên, một cặp mồi khuếch đại vùng trình tự bao phủ vùng trình tự đảo CpG mục tiêu trên DNA mạch khuôn, đó là DNA bộ gen

đã được biến đổi bisulfite Sản phẩm PCR lần đầu là mạch khuôn trong hai phản ứng PCR tiếp theo: mỗi phản ứng PCR tương ứng lần lượt với cặp mồi U và cặp mồi M Hai cặp mồi M, U này chính là cặp mồi trong phản ứng MSP thông thường[43]

Trình tự cặp mồi trong phản ứng PCR đầu tiên phải không chứa các vị trí CpG, để có thể khuếch đại tất cả trạng thái alelle methyl hóa, alelle không methyl hóa[43]

Hình 1.15: Sơ đồ phương pháp Nested–MSP [43]

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Phương pháp nghiên cứu

II.1.1 Khảo sát dữ liệu

Thu thập các công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa gen DAPK và gen

RARB ở đảo CpG thuộc vùng promoter đối với các loại ung thư nói chung và ung

thư cổ tử cung nói riêng trên nguồn dữ liệu NCBI, Google

Xử lý số liệu xác định tần số methyl hóa gen DAPK và gen RARB

II.1.2 Khảo sát in silico

II.1.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK và gen RARB

Thu thập trình tự gen DAPK và gen RARB trên Ngân hàng dữ liệu NCBI (GenBank)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, National Center for Biotechnology Information)

Thu thập trình tự vùng promoter gen DAPK và RARB trên nguồn dữ liệu NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, National Center for Biotechnology Information), GeneCards (http://www.genecards.org/, GeneCards Human gene database) và các công trình nghiên cứu khoa học đã được công bố

II.1.2.2 Xác định vị trí đảo CpG và vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB

Công cụ tin sinh học được sử dụng:

- Methprimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi): Xác định vị trí các đảo CpG trên vùng promoter của gen

- Gene Promoter Miner (http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/): xác định vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng promoter của gen

II.1.2.3 Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với phương pháp MSP, Nested–MSP

Thu thập bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với phương pháp nghiên cứu từ các công trình khoa học đã được công bố

Công cụ tin sinh học được sử dụng:

- IDT analyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer, Integrated DNA Technologies): đánh giá thông số vật lý của bộ mồi như chiều dài, kích thước sản phẩm, %GC, nhiệt độ nóng chảy Tm (0C), cấu trúc kẹp tóc (Hairpin), cấu trúc tự bắt cặp (Self – dimer) và cấu trúc dị bắt cặp (Hetero – dimer)

- Annhyd 4.946: Kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi methyl và mồi unmethyl trên trình

tự gen DAPK và gen RARB, đồng thời kiểm tra kích thước sản phẩm cho mỗi cặp

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

III.1 Kết quả khai thác dữ liệu

III.1.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase)

III.1.1.1 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

III.1.1.1.1 Các công trình nghiên cứu trên các loại ung thư khác nhau liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Bằng cách khai thác nguồn cơ sở dữ liệu (PubMed) trên NCBI và Google, chúng tôi

đã thu thập đƣợc các công trình nghiên cứu liên quan đến gen DAPK Với các từ

khóa ―DAPK gene‖, ―promoter methylation of DAPK gene‖, ―methylation of DAPK gene and cancer‖, ―cervical cancer‖, ―lung cancer‖,…chúng tôi đã thu thập đƣợc 35 công trình nghiên cứu bằng tiếng Anh (bảng 3.1) Trong đó, 3 bài báo khoa

học cung cấp các kiến thức tổng quan (mô tả đặc điểm, chức năng gen DAPK) và 31 công bố khoa học khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK ở

các loại ung thƣ nói chung và UTCTC nói riêng

Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu khoa học về gen DAPK

III.1.1.1.2 Các loại ung thư được nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Chúng tôi ghi nhận có nhiều công trình nghiên cứu về tính chất methyl hóa vượt

mức của gen DAPK trong nhiều loại ung thư khác nhau (hình 3.3) Tuy nhiên, trong

bài báo cáo này, chúng tôi tập trung tìm hiểu các công bố khoa học liên quan đến sự

xác định tần suất methyl hóa gen DAPK trong tổng số 8 loại ung thư thường gặp:

ung thư phổi (LC) (7 công trình nghiên cứu), ung thư cổ tử cung (CC) (6 công trình nghiên cứu), ung thư dạ dày (GASC) (4 công trình nghiên cứu), ung thư bàng quang (BLC) (3 công trình nghiên cứu), ung thư bạch cầu (LEUC) (2 công trình nghiên cứu), ung thư buồng trứng (OVC) (1 công trình nghiên cứu), ung thư đại trực tràng (COLC) (2 công trình nghiên cứu) và ung thư thận (KIDC) (2 công trình nghiên cứu)

III.1.1.1.3 Phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để nghiên cứu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Dựa vào tài liệu thu thập được, chúng tôi ghi nhận có nhiều phương pháp sinh học phân tử như phương pháp MSP, QMSP hay Nested-MSP được sử dụng để xác định

tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK (hình 3.1) Tuy nhiên, chúng tôi

nhận thấy phương pháp MSP là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất (85,7%) trong các nghiên cứu chúng tôi khảo sát Điều này phần nào cho thấy phương pháp MSP có nhiều ưu điểm cho sự lựa chọn phương pháp trong những nghiên cứu phân

tích tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu, cụ thể là gen DAPK

Chú thích: BLC (Bladder cancer): ung thư bàng quang; CC (Cervical cancer):

UTCTC; COLC (Colorectal cancer): ung thư đại trực tràng; GASC: (Gastric cancer): ung thư dạ dày; KIDC (Kidney cancer): ung thư thận; LC (Lung cancer): ung thư phổi; LEUC (Leukemia cancer): ung thư bạch cầu; OVC (Ovarian cancer):

tích tính chất methyl hóa trên gen DAPK, vào khoảng 46,7% (trên tổng số công

trình nghiên cứu) Bên cạnh đó, mẫu bệnh phẩm huyết thanh (máu) được sử dụng trong các công trình nghiên cứu liên quan đến bệnh ung thư cổ tử cung, ung thư phổi, ung thư bàng quang, ung thư buồng trứng và ung thư bạch cầu với tỷ lệ 43,5% (trên tổng số công trình nghiên cứu)

Hình 3.1: Đồ thị mô tả các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để

khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

Chú thích: BLC (Bladder cancer): ung thƣ bàng quang; CC (Cervical cancer):

UTCTC; COLC (Colorectal cancer): ung thƣ đại trực tràng; GASC: (Gastric cancer): ung thƣ dạ dày; KIDC (Kidney cancer): ung thƣ thận; LC (Lung cancer): ung thƣ phổi; LEUC (Leukemia cancer): ung thƣ bạch cầu; OVC (Ovarian cancer):

ung thƣ buồng trứng

III.1.1.2 Bộ dữ liệu về tần suất methyl hóa gen DAPK trong các loại ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng

Kết quả hiển thị ở hình 3.3 cho thấy tần suất methyl hóa gen DAPK xuất hiện trong

từng loại ung thƣ khác nhau dao động ở khoảng 11% - 61%, kết quả phân tích có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Chúng tôi ghi nhận tần suất tính chất methyl hóa trung

bình có trọng số trên gen DAPK xấp xỉ hơn 50% ở một số bệnh lý: ung thƣ cổ tử

cung, ung thƣ dạ dày, ung thƣ buồng trứng và ung thƣ thận Bên cạnh đó, tần suất

methyl hóa trung bình có trọng số trên gen DAPK vào khoảng hơn 60% ở ung thƣ

bàng quang

Riêng với ung thƣ cổ tử cung, các công trình nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2008), Jeong và cộng sự (2006), Nakayama và cộng sự (2001), Banzai và cộng sự

(2014) và Niyazi và cộng sự (2012) xác định tần suất methyl hóa gen DAPK trên

Hình 3.2: Đồ thị mô tả các loại mẫu đƣợc sử dụng trong khảo sát tính chất

methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

loại ung thƣ khác nhau lần lƣợt là 65,4%, 44,9%, 45,1%, 75,5% và 63,3% (bảng

3.2) Theo đó, tần suất methyl hóa trung bình có trọng số gen DAPK trên ung thƣ cổ

tử cung là 52,1% (hình 3.3)

Chú thích: : Tần suất methyl hóa trung bình có trọng số; : Tần suất

methyl hóa trong một công trình nghiên cứu; BLC (Bladder cancer): ung thƣ bàng

quang; CC (Cervical cancer): UTCTC; COLC (Colorectal cancer): ung thƣ đại trực tràng; GASC: (Gastric cancer): ung thƣ dạ dày; KIDC (Kidney cancer): ung thƣ thận; LC (Lung cancer): ung thƣ phổi; LEUC (Leukemia cancer): ung thƣ bạch cầu; OVC (Ovarian cancer): ung thƣ buồng trứng

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát các loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl

hóa vùng promoter trên gen DAPK