KỸ THUẬT sắc ký cột hở pha thường powerpoint

Đây là tài liệu rất hay về sắc kí cột hở Đừng tìm thêm ơ đâu nữa MỘT SỐ VẤN ĐỀ TRONG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT HỞ PHA THƯỜNG Nội dung Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly 1. Chọn chất hấp thu 2 .Chọn dung môi Quá trình nạp cột 1 .Tính toán các tỉ lệ Nạp cột sệt Nạp cột khô Nạp mẫu chất phân tích 1. Nạp mẫu chất dạng dung dịch 2. Nạp mẫu chất dạng bột khô Quá trình giải ly 1. Giải ly nhờ trọng lực 2. Sử dụng lực đẩy (trong sắc ký chớp nhoáng) 3. Sử dụng lực hút (trong sắc ký nhanh – cột khô) 4. Vận tốc giải lý Giải lý sử dụng dung môi đơn nồng độ Giải ly có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang Giải ly với nồng độ tăng dần tuyến tính

TN 395

MỘT SỐ VẤN ĐỀ TRONG KỸ THUẬT SẮC KÝ

CỘT HỞ PHA THƯỜNG

1

L a ch n ch t h p thu và dung môi kh i đ u gi i ly ự ọ ấ ấ ở ầ ả

1. Ch n ch t h p thuọ ấ ấ

-.Tùy vào tính phân c c c a ch t c n phân tíchự ủ ấ ầ

3

* Đ i v i h p ch t r t phân c c, nên s d ng s c ký trao đ ion ho t s c ký l c gel ố ớ ợ ấ ấ ự ử ụ ắ ổ ặ ắ ọ

* V i các h p ch t phân c c bình th ớ ợ ấ ự ườ ng thì s d ng s c ký h p thu ử ụ ắ ấ

5

L a ch n ch t h p thu và dung môi kh i đ u gi i ly ự ọ ấ ấ ở ầ ả

2. Ch n dung môiọ

-.Dùng s c ký l p m ng đ dò tìm h dung môi phù h p, v i các bắ ớ ỏ ể ệ ợ ớ ước:

- B ướ c 1: Hòa tan m u trong trong dung môi phù h p ẫ ợ

- B ướ c 2: Ch m b n m ng ấ ả ỏ

- B ướ c 3: M i b n m ng khai tri n v i 1 lo i dung môi, sau đó hi n hình các v t T k t qu đó tìm h n h p dung môi phù ỗ ả ỏ ể ớ ạ ệ ế ừ ế ả ỗ ợ

h p ợ

- B ướ c 4:

- V i m u là k t qu c a ph n ng t ng h p h u c , l a ch n h dung môi đ y h p ch t c n quan tâm lên v i Rf = 0,2-0,3 ớ ẫ ế ả ủ ả ứ ổ ợ ữ ơ ự ọ ệ ẩ ợ ấ ầ ớ

- V i cao thô cây c , dung môi gi i ly đ u tiên đ y v t ít phân c c nh t lên v i Rf = 0,5 Dung môi ch m d t s c ký là dung môi đ y ớ ỏ ả ầ ẩ ế ự ấ ớ ấ ứ ắ ẩ

v t phân c c nh t lên Rf = 0,2 ế ự ấ

* B n m ng silica gel GFả ỏ 254 (MERCK)Dung môi khai tri n ể

A S c ký đ dắ ồ ưới ánh sáng t ngo i 254nmử ạ

B S c ký đ dắ ồ ưới ánh sáng t ngo i 366nmử ạ

C S c ký đ dắ ồ ưới ánh sáng thường Hi n màu b ng Vanilin/ Hệ ằ 2SO4

7

* L u ý: ư

- Pha tĩnh c a SKLM và SKC ph i gi ng nhau ủ ả ố

- Dung môi gi i ly c t là h dung môi đã ch n trong ph n th c nghi m nêu trên ả ộ ệ ọ ầ ự ệ

nh ng ph i đi u ch nh sao cho có tính kém phân c c m t ít ư ả ề ỉ ự ộ

N p ch t h p thu vào c t ạ ấ ấ ộ

N p c t s t ạ ộ ệ

- C đ nh c t trên giá, ch n ph n đ u ra c a c t b ng m t mi ng bông.ố ị ộ ặ ầ ầ ủ ộ ằ ộ ế

- Cho ch t h p thu vào becher có s n dung môi (lo i b t đ u gi i ly) đ u đ n t ng lấ ấ ẵ ạ ắ ầ ả ề ặ ừ ượng nh , khu y đ u Lỏ ấ ề ượng dung môi ph i v a đ không đả ừ ủ ược quá s t cũng không đệ ược quá l ng.ỏ

- Rót h n h p s t vào c t qua m t ph u, m khóa dỗ ợ ệ ộ ộ ễ ở ưới cho dung môi ch y ra, h ng vào m t becher, dung môi ả ứ ộnày được s d ng l i đ rót tr lên đ u c t.ử ụ ạ ể ả ầ ộ

- Ti p t c rót cho h t lế ụ ế ượng ch t s t V a rót h n h p s t v a gõ nh thành c t.ấ ệ ừ ỗ ợ ệ ừ ẹ ộ

- Sau khi n p h t ch t h p thu cho dung môi ch y ra và rót tr l i đ u c t vài l n đ ch t h p thu trong c t có ạ ế ấ ấ ả ả ạ ầ ộ ầ ể ấ ấ ộ

d ng đ ng nh t.ạ ồ ấ

11

N p c t s t ạ ộ ệ

• L u ý:ư

- Không được đ khô c t, nghĩa là luôn ph i có dung môi ph trên đ u c t.ể ộ ả ủ ầ ộ

- Sau khi n p xong, m t thoáng ch t h p thu đ u c t ph i n m ngang.ạ ặ ấ ấ ở ầ ộ ả ằ

- Đ i v i s c ký trao đ i ion và s c ký l c gel (s d ng lo i ch t h p thu có th trố ớ ắ ổ ắ ọ ử ụ ạ ấ ấ ể ương n ) trở ước khi rót vào c t ộ

c n ngâm trong dung môi v a đ kho ng m t đêm.ầ ừ ủ ả ộ

N p c t khô ạ ộ

- C đ nh c t th ng đ ng.ố ị ộ ẳ ứ

- Cho dung môi lo i kém phân c c nh t vào kho ng 2/3 c t.ạ ự ấ ả ộ

- Cho t ng lừ ượng nh ch t h p thu d ng b t khô vào trong c t v a cho v a gõ nh thành c t.ỏ ấ ấ ạ ộ ộ ừ ừ ẹ ộ

- Khi chi u cao ch t h p thu vào kho ng 2cm thì m khóa dề ấ ấ ả ở ưới cho dung môi ch y ra.ả

- Sau khi n p xong, cho dung môi ch y qua ch t h p thu vài l n đ ch t h p thu có d ng đ ng nh t.ạ ạ ấ ấ ầ ể ấ ấ ạ ồ ấ

13

-.M khóa cho dung môi ch y xu ng v a sát m t thoáng ch t h p thu.ở ả ố ừ ặ ấ ấ

-.Đóng khóa l i, n p dung d ch m u vào đ u c t b ng pipette.ạ ạ ị ẫ ầ ộ ằ

-.M khóa cho dung môi ch y ra, ch t phân tích th m vào ch t h p thu, không đ ch t h p thu đ u c t khô.ở ả ấ ấ ấ ấ ể ấ ấ ở ầ ộ

N p m u ch t phân tích ạ ẫ ấ

1. N p m u ch t d ng dung d chạ ẫ ấ ạ ị

-.Dùng pipette cho m t lộ ượng nh dung môi m i lên đ u c t, dùng lỏ ớ ầ ộ ượng dung môi này r a s ch thành ng do ch t ử ạ ố ấphân tích dính lên L i m khóa cho dung môi ch y ra.ạ ở ả

-.L p l i nh th cho đ n khi cho dung môi vào đ u c t, dung môi trong su t.ặ ạ ư ế ế ầ ộ ố

-.Cho dung môi vào đ y c t đ b t đ u quá trình gi i ly.ầ ộ ể ắ ầ ả

15

N p m u ch t phân tích ạ ẫ ấ

2. N p m u ch t d ng b t khôạ ẫ ấ ạ ộ

-.Trong bình c u dùng đ cô quay, m u ch t (x g) đầ ể ẫ ấ ược hòa tan trong dung môi nh ethyl acetate ho c ư ặmethanol (50x g), cho thêm vào silica gel c h t l n (10x g) H n h p đỡ ạ ớ ỗ ợ ược cô quay trong chân không đ n khi ế

có b t silica gel khô, m u c n phân tích đã độ ẫ ầ ượ ẩc t m lên b m t c a silica gel khô.ề ặ ủ

-.Cho l p silica gel này lên đ u c t (c t đã đớ ầ ộ ộ ược n p ch t h p thu) dùng m t ít dung môi th m ạ ấ ấ ộ ấ ướt ph n silica ầgel

-.Cho dung môi vào đ y c t b t đ u quá trình gi i ly.ầ ộ ắ ầ ả

Biotage Isolera Automated Flash Chromatography System

Quá trình gi i ly ả

3. S d ng l c hút (trong s c ký nhanh – c t khô) ử ụ ự ắ ộ

-.S d ng máy b m hút chân không đ u ra c a c t ử ụ ơ ở ầ ủ ộ

-.Vi c l y dung môi có ph n b t ti n Tuy v y, k thu t ệ ấ ầ ấ ệ ậ ỹ ậ này an toàn h n ơ

19

Quá trình gi i ly ả

4. V n t c gi i lyậ ố ả

Thông thường trong đa s s c ký c t, v n t c gi i ly là kho ng 5 -50 gi t/phút ho c 1-2 cm/phút.ố ắ ộ ậ ố ả ả ọ ặ

•.V n t c dung môi gi i ly không đậ ố ả ược quá nhanh (s không k p cân b ng v i ch t h p thu), cũng không đẽ ị ằ ớ ấ ấ ược quá

ch m ho c b cho ng ng l i m t th i gian vì lúc đó các dãy ch t tan s khu ch tán ho c trãi dài theo m i hậ ặ ị ừ ạ ộ ờ ấ ẽ ế ặ ọ ướng làm x u quá trình tách.ấ

21

Dung môi gi i ly ả

- Dung môi đ m b o tinh khi tả ả ế

- Tránh s d ng m t vài dung môi cho silica gel nh t là cho alumin d ng acid ho c base ho c d ng ho t tính ử ụ ộ ấ ạ ặ ặ ạ ạ

m nh (pyridin, methanol, nạ ước, acid acetic => hòa tan và gi i ly luôn c ch t h p thu silica gel).ả ả ấ ấ

- Đ phân c c c a m t s đ n dung môi: (tăng d n theo th t )ộ ự ủ ộ ố ơ ầ ứ ự

Hexan < cyclohexan < diclorometan < isopropanol < propanol < cloroform < etyl acetat < aceton < metanol < etanol < acetonitril

(Nguy n Kim Phi Ph ng, Ph ễ ụ ươ ng pháp cô l p h p ch t h u c , 193) ậ ợ ấ ữ ơ

Gi i ly s d ng dung môi đ n n ng đ ả ử ụ ơ ồ ộ

Ch s d ng đ n dung môi ho c h n h p dung môi nh ng trong h n h p t l gi a các thành ph n không thay đ i ỉ ử ụ ơ ặ ỗ ợ ư ỗ ợ ỉ ệ ữ ầ ổ

đ gi i ly cho đ n khi vi c tách ch t hoàn t t.ể ả ế ệ ấ ấ

23

Gi i ly có n ng đ tăng theo ki u b c thang ả ồ ộ ể ậ

- Trong quá trình s c ký c n thay đ i nhi u lo i dung môi khác nhau, có l c m nh tăng d n đ có th đu i h t ắ ầ ổ ề ạ ự ạ ầ ể ể ổ ế

Gi i ly v i n ng đ tăng d n tuy n tính ả ớ ồ ộ ầ ế

25

Thay đ i dung môi gi i ly ổ ả

- V i h p ch t có màu, đ i dung môi khi tách xong m t l p màu.ớ ợ ấ ổ ộ ớ

- V i ch t không màu, ki m tra b ng SKLM ớ ấ ể ằ

- L u ý đu i b t dung môi trư ổ ớ ước khi ch m SKLM.ấ