Phân tách bằng các phương pháp sắc ký và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang (LV00286)

- Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng các phương pháp sắc kí để phân tách và làm sạch enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, và nghiên cứu một số tính chất của enzyme này... Ngoài các RNase thuộc siêu

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học sư phạm hà nội 2

Nguyễn huy trí

Phân tách bằng các phương pháp sắc ký và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Ribonuclease (RNase) là một trong những nhóm enzyme được quan tâm nghiên cứu nhiều Đây là nhóm enzyme có phân bố rộng rãi, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của các acid nucleic, thực hiện chức năng tiêu hóa và tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể

Đặc biệt là trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện nhiều tính chất (hay hoạt tính) sinh học mới quan trọng của các enzyme thuộc siêu

họ RNase A (đây là nhóm RNase ngoại tiết ở các động vật có xương sống từ lưỡng

cư đến lớp thú), trong đó có hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin),các hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus và một số hoạt tính khác Ví dụ như: RNase

từ một số loài ếch (ếch đồng Nhật Bản Rana japonica, ếch bò Rana catesbeiana và ếch báo phương bắc Rana pipens) đều có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt là RNase

từ loài ếch báo phương bắc tác động rất đặc hiệu lên tế bào u mà không ảnh hưởng lên tế bào bình thường, do đó enzyme này được gọi là onconase (enzyme đặc hiệu với các tế bào ung thư) Ngoài ra enzyme này còn có hoạt tính chống HIV-1 cao Các enzyme thuộc nhóm RNase ngoại tiết khác nhau như RNase từ tinh dịch bò và nhiều RNase ngoại tiết ở người (các enzyme này tạo thành siêu họ RNase A ở người) cũng có hoạt tính chống virus và chúng là một bộ phận cấu thành trong hệ thống chống virus ở người như 2 enzyme RNase 2 và RNase 3 do các bạch cầu ưa eosin (bạch cầu ưa acid) tiết ra

Những năm gần đây ngoài việc tìm ra một số RNase nguồn gốc tự nhiên có đặc điểm như onconase & BS-RNase, các nhà khoa học còn nghiên cứu tạo ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư, nhờ vận dụng các phương pháp sinh học phân tử và công nghệ gen Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một hoặc một vài gốc amino acid cần cho tương tác với protein ức chế (RI) hoặc tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự nhạy cảm với protein trong tế bào Các nghiên cứu này đã mở ra một hướng nghiên

cứu mới trong lĩnh vực hóa dược nhằm sản xuất ra những chế phẩm dược cao cấp trên cơ sở RNase để phòng chống ung thư

Nọc rắn là nguồn dược liệu cổ truyền quý, không phải ngẫu nhiên mà biểu tượng của toàn ngành Y trên thế giới là hình ảnh con rắn đang nhả nọc

- Có tác dụng chống ung thư

(Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại)

Đáng chú ý là những chất mới được phát hiện trong nọc rắn, nuôi dưỡng sự hình thành các tế bào thần kinh mới có ý nghĩa với các bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer và những bệnh khác mà tế bào thần kinh trong não chết đi

Để góp phần tìm hiểu thêm về các RNase tự nhiên có khả năng có hoạt tính cytotoxin trong nguồn tài nguyên đa dạng và phong phú của Việt Nam Chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu RNase từ nọc rắn nhằm tìm hiểu tính chất của enzyme này

Luận văn của tôi có tiêu đề: “Phân tách bằng các phương pháp sắc kí và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang”

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

- Đánh giá khả năng tách chiết và làm sạch enzyme RNase bằng các phương pháp sắc kí

- Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng: RNase từ nọc rắn hổ mang

- Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng các phương pháp sắc kí để phân tách và làm sạch enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, và nghiên cứu một số tính chất của enzyme này

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thực nghiệm và áp dụng các biện pháp phân tách hiện đại (bằng máy sắc kí)

và các phương pháp nghiên cứu động học xúc tác enzyme

5 GIẢ THIẾT KHOA HỌC

- RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong Y học Ngoài chức năng tiêu hóa và tham gia (trực tiếp hay gián tiếp) các hoạt động sao

mã, phiên mã, sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun…

Nồng độ và hoạt tính của RNase trong dịch bào và các dịch thể có liên quan đến trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng là kết quả của phản ứng cơ thể chống lại bệnh tật (ví dụ: Bệnh tăng bạch cầu tủy mãn tính, hội chứng mệt mỏi kinh niên đã phát hiện thấy lượng RNase tăng lên trong các tế bào ngoại vi)

- Trong tương lai nhiều dạng RNase vẫn sẽ được nghiên cứu để tạo ra các loại thuốc tác động hiệu quả lên khối u Nhiều bệnh hiểm nghèo được phòng chống

và chữa trị hiệu quả

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NHÓM RNASE

1.1 Lịch sử nghiên cứu

RNase (RNase) bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1920 khi Walter Jones phát hiện ra một chất tác từ tuyến tụy có khả năng thủy phân acid nucleic của nấm men, mặc dù vào thời điểm này cấu trúc hóa học của acid nucleic nói chung và acid ribonucleic (ARN) nói riêng còn chưa được biết đến Sau đó Dubos và Thompson khi tinh sạch ARN cũng phát hiện ra chất này và đặt tên là RNase vì chúng tham gia vào quá trình depolymer hóa ARN Tới năm 1940, Kunitz đã kết tinh được RNase, tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu sau này Vào đầu những năm 1950, ba nhà khoa học Salganik (Liên Xô), Bernet (Úc), Leclerk (Bỉ) đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên về khả năng chữa bệnh virus bằng nuclease nói chung và RNase nói riêng [6461] Kết quả bước đầu cho thấy các enzyme này có khả năng kìm hãm

sự phát triển của một số loại virus gây bệnh như ospovaxin, herpes, adenovirus (chứa ADN) hay virus viêm não, viêm tủy, virus cúm (chứa ARN) Năm 1958, Sie Kevitz Palade đã xác định nơi khư trú của enzyme này là tuyến tụy nhờ kỹ thuật kháng thể huỳnh quang

Những năm 1960-1970 nhờ ưu thế về nguồn vật liệu, khả năng tinh chế cũng như kích thước phân tử nhỏ (~ 14kDa), RNase tuyến tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5) trở thành mô hình mẫu trong các nghiên cứu về enzyme nói riêng và nghiên cứu về protein nói chung RNase A là enzyme đầu tiên được xác định trình tự amino acid

và là enzyme thứ 3 được xác định cấu trúc 3D (sau lysozyme và carboxy-peptidase A) Vào năm 1972 giải thưởng Nobel hóa học đã được trao cho Stanford Moor, William Stein và Christian Anfinsen với những công trình nghiên cứu của họ về RNase Năm 1984 Bruce Merifield đã vinh dự nhận giải thưởng cao quý này với công trình nghiên cứu cũng liên quan đến RNase A [50, 51, 52] Từ những năm cuối thập kỷ 80 tới nay, nhiều nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu theo hướng ứng

dụng của RNase đã được tiến hành song song và liên quan chặt chẽ với nhau, đặc biệt là những nghiên cứu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng sinh học của các RNase Kết quả các nghiên cứu này đã mở ra triển vọng cho nghiên cứu nhằm sản xuất ra các dược phẩm mới trên cơ sở RNase có khả năng chữa trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư và các bệnh do virus [13, 18, 28, 40, 41, 50]

1.2 Tính đặc hiệu cơ chất và cơ sở phân loại RNase

Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác cũng như giữa enzyme này với enzyme khác Nhóm nuclease tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của acid nucleic Chúng được đặc trưng bởi tính đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau

Việc phân loại các nuclease rất khó khăn và không thống nhất Ngoài các phản ứng thủy phân, các enzyme thuộc nhóm này còn tham gia xúc tác các phản ứng chuyển nhóm: RNase tụy tạo thành 2’,3’-monophosphate vòng nhờ phản ứng chuyển vị nhanh hơn khoảng 1000 lần so với phản ứng thủy phân ở giai đoạn sau của phản ứng tạo thành 3’-monophosphate [26]

Trong hệ thống phân loại enzyme năm 1964, enzyme này cũng được xếp vào nhóm transferase (EC 2.7.7.16 và EC 2.7.7.17) Việc phân loại này không hợp lí vì deoxyRNase (DNase) có cùng chức năng sinh học với RNase là thủy phân acid nucleic lại được xếp vào nhóm hydrolase (EC 3.1.4.6) [25]

Những nghiên cứu tiếp theo chỉ ra rằng sự khác biệt này chỉ là tương đối, tùy thuộc vào từng enzyme cụ thể Ví dụ ở một số vi khuẩn tốc độ chuyển nhóm và thủy phân của RNase là tương đương nhau nên các chất trung gian (nucleotide vòng) không được tích lũy trong quá trình phản ứng Để đặc trưng cho tính đặc hiệu của một enzyme bất kỳ thuộc nhóm nuclease, Laskovski đã đưa ra các dấu hiệu (tương đối không phụ thuộc) khác nhau [20, 23, 24]

1 Theo tính đặc hiệu của gốc đường cấu trúc nên nucleotide, nuclease được phân chia thành hai nhóm lớn: RNase và DNase

2 Theo vị trí liên kết bị thủy phân, nuclease được phân chia thành exonuclease và endonuclease

3 Theo sản phẩm thủy phân: Liên kết phosphodiester bị thủy phân từ phía nào của phân tử ARN, tạo thành sản phẩm 5’-phosphate hay 3’-phosphate Một số exonuclease chỉ tác động vào phân tử polynucleotide từ phía đầu 3’, số khác lại chỉ tác động vào phía đầu 5’

4 Theo tính đặc hiệu với bazơ trong đơn vị nucleotide liền kề với nucleotide

bị thủy phân: Tính đặc hiệu này của nhiều enzyme là không đáng kể Chẳng hạn các

RNase thực vật và Escherichia coli (EC 3.1.27.1) thủy phân các liên kết theo vị trí

3’ của cả purine và pyrimidine nucleotide; RNase tuyến tụy (EC 3.1.27.5) chiếm vị trí trung gian: Thủy phân các liên kết theo vị trí 3’ của pyrimidine nucleotide bất kỳ Trong khi đó, enzyme mã số EC 3.1.27.3 là endonuclease đích thực, thủy phân ARN ở vị trí 3’ của gốc Guanine nucleotide

5 Tính đặc hiệu cấu trúc: mạch đơn hay mạch kép (đa số các nuclease thể hiện độ đặc hiệu cao theo dấu hiệu này)

- Phân loại nuclease dựa trên tính đặc hiệu cơ chất, phân biệt:

+ DNase (thủy phân ADN)

+ RNase (thủy phân ARN)

+ Nuclease hỗn tạp hay không đặc hiệu (theo gốc) đường thủy phân cả ADN và ARN

- Phân loại nuclease dựa trên vị trí liên kết bị thủy phân, phân biệt:

+ Endonuclease

+ Exonuclease

3’-exonuclease

5’-exonuclease

1.3 Cơ chế xúc tác của RNase

Phản ứng hóa học mà RNase xúc tác là phản ứng thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử acid nucleic Quá trình thủy phân ARN do RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm - acid chung với sự tham gia của

2 gốc His-12 và His-119 [20, 26, 37, 47, 51, 52]

- Giai đoạn 1: Phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản phẩm trung gian là phosphate vòng mà không giải phóng nhóm acid Trong giai đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H+ ở vị trí 2’) His-119 đóng vai trò

là acid chung (proton hóa nhóm đi khỏi RNA-O-) diễn ra khá nhanh

- Giai đoạn 2: Giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc gốc phosphate trong quá trình thủy phân dẫn xuất phosphate vòng Giai đoạn này diễn ra chậm hơn trong đó vai trò của hai gốc His-12 và His-119 lại ngược lại His-119 tương tác với H2O theo

cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12 đảm nhận việc proton hóa nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2’

2 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA RNASE

RNase A là một enzyme có khối lượng phân tử nhỏ (~ 14 kDa) được cấu tạo

từ một mạch polypeptide từ 124 gốc amino acid, trong thành phần amino acid của

nó có 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein (không có amino acid Trytophan) Công thức phân tử ở dạng không tích điện của RNase A là

C575H907N171O192S12 với khối lượng phân tử chính xác Mr = 13686 Da [50, 51, 52]

Về hình dạng, RNase A giống như quả thận, các gốc amino acid của trung tâm hoạt động nằm trong vùng “hốc” (cleff) - là vùng lõm của quả thận [51] Cấu trúc bậc hai điển hình của RNase A gồm 4 phiến cấu trúc  nằm song song ngược chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn  ngắn Trong phân tử có 4 cầu nối disulfide được tạo thành từ 8 gốc Cysteine ở các vị trí 26-84, 40-95, 58-110 và 65-72 Các cầu nối này có thể bị phá vỡ bởi lượng -mercaptoethanol dư thừa, tạo thành 8 nhóm SH tự

do dẫn tới sự biến tính và làm mất hoạt tính của enzyme [26, 51]

Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều có cấu trúc monomer, duy chỉ

có RNase trong tinh dịch bò (RNase) có cấu trúc bậc 4 (dimer) [15, 17] RNase được tách ra ở dạng dimer trong đó hai tiểu đơn vị thành phần nối với nhau bởi hai cầu disunfide [1917] Enzyme này là một đồng đẳng của RNase A, ở trạng thái cân bằng một hỗn hợp gồm 2 cấu trúc bậc IV hoàn toàn khác nhau [36]

BS-Trung tâm hoạt động của RNase A ngoài hai nhóm chức tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác là nhóm imidazol của các gốc His-12 và His-119 (trong đó một nhóm đóng vai trò như một acid, một nhóm đóng vai trò như một bazơ trong quá trình xúc tác) còn có mạch bên của các gốc Lys-7, Lys-41, Lys-66, Asp-121 và mạch carbon chính của gốc Phe và Gly-11 [13, 20, 28]

3 TÍNH ĐA HÌNH PHÂN TỬ CỦA RNASE TRONG TẾ BÀO

Nhiều công trình nghiên cứu về RNase tiến hành ở trên các nhóm sinh vật từ dạng có cấu tạo đơn giản như vi khuẩn đến các sinh vật bậc cao như con người đã cho thấy sự muôn hình muôn vẻ của các enzyme thuộc nhóm này Trong một cá thể

có tồn tại nhiều dạng RNase khác nhau, ví dụ ở vi khuẩn E.coli có tới 20 loại RNase

[46]; trong nọc rắn hổ mang Ấn Độ chứa 2 dạng RNase liên hợp-phân li (phụ thuộc vào nồng độ NaCl) [42]; các kết quả nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam cho thấy cũng tồn tại ít nhất 2 dạng RNase khác nhau trong nọc rắn hổ mang Việt Nam [5, 7]

Ở người, tới nay đã phát hiện được 8 enzyme khác nhau thuộc siêu họ RNase

A Chúng được đánh số từ 1 đến 8 để phân loại dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và chức năng sinh học Các gen mã hóa cho các protein này liên kết với nhau trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể số 14 [61] Dưới đây là những đặc điểm chính của nhóm RNase ở người thuộc siêu họ RNase A

3.1 RNase 1

RNase này có nhiều ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể nhưng có nhiều nhất ở tuyến tụy Trình tự amino acid tương đồng tới 70% so với RNase A Chức năng chính của RNase 1 là tiêu hóa - thủy phân ARN trong thức ăn [55, 61]

3.2 RNase 2 (EDN - eosinophil derived neurotoxin)

RNase 2 đầu tiên được phát hiện là một độc tố thần kinh có nguồn gốc từ các

tế bào bạch cầu ưa acid nên còn được gọi là EDN Đây là 1 trong 2 protein của tế bào lympho có hoạt tính ribonucleolytic Một số gốc amino acid như: Gly-2, Lys-

66, Lys-7, Arg-10, Phe-120, Asp-14 bị thay đổi không bảo thủ đóng vai trò quan trọng về chức năng; các gốc amino acid His-12, His-119, Lys-41 và nhiều gốc khác được giữ lại tạo nên trung tâm hoạt động (TTHĐ) của phân tử enzyme [55, 61]

3.3 RNase 3 (ECP - eosinophil cationic protein)

Cũng giống như RNase 2, RNase 3 đầu tiên được phát hiện là protein mang điện dương của tế bào bạch cầu ưa acid, điểm đẳng điện của protein này là pI = 10,8 (enzyme này là một protein rất kiềm) và tương đồng tới 70% với RNase 2 ECP là RNase người đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn, kháng côn trùng và độc với tế bào thần kinh Hoạt tính nuclease của ECP thấp hơn nhiều so với RNase 2 nhưng các đặc tính xúc tác bình thường thì gần như không đổi so với RNase 2 Tuy vậy hoạt tính ribonucleolytic của ECP lại không cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn [22, 55,

3.4 RNase 4

RNase 4 có trình tự amino acid tương đồng 43% với RNase 1, 31% với RNase 2 và 30% với RNase 3 Enyme này cũng tương đồng với RNase gan bò và gan lợn tới 90%, điều này chứng tỏ tính bảo thủ của RNase là rất lớn [55, 61] 3.5 RNase 5 (Angiogenin)

Angiogenin có trọng lượng phân tử là 14 400 Da và giống RNase A tới 65%

về trình tự amino acid, 3 trong 4 cầu disunfide và các gốc amino acid chức năng chủ yếu trong TTHĐ của RNase vẫn được bảo tồn ỏ angiogenin So với RNase 1, 2 và 4 thì trình tự amino acid của angiogenin tương đồng lần lượt là 35%, 27% và 39% Angiogenin có tính đặc hiệu yếu với cơ chất chuẩn của RNase nhưng bù lại, hoạt tính ribonucleolytic của angiogienin lại rất quan trọng trong việc hình thành mạch máu mới [61]

3.6 RNase 6 (RNase K6)

RNase 6 tồn tại chủ yếu ở thận và một ít ở các cơ quan khác như nhau thai, tim, phổi Gen mã hóa protein này dài 120 Kb và mARN tương ứng có trong các tế bào bạch cầu trung tính và các bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi Trong các RNase người thì RNase 6 gần với 2 protein của tế bào bạch cầu acid nhất [55, 61]

3.7 RNase 7

RNase 7 là enzyme kiềm tính hoạt động mạnh (pI = 10,1) có Mr là 14 546

Da, được tìm thấy trong các tế bào và mô biểu bì (đường tiêu hóa, đường sinh dục

và đường ruột) RNase biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh, tham gia vào hệ miễn dịch không đặc hiệu, bảo vệ đường hô hấp… [30]

3.8 RNase 8

RNase 8 là enzyme cuối cùng trong siêu họ RNase ở người được biết đến cho tới nay Gen mã hóa cho RNase 8 liên kết với 7 gen mã hóa cho 7 RNase còn lại trên nhiễm sắc thể số 14 Phân tử RNase có trình tự amino acid rất giống với RNase 7 (tương đồng 78%) và khác nhiều với RNase 5 nhất (tương đồng 29%)

RNase 8 gồm 154 amino acid với đoạn peptide tín hiệu dài 27 amino acid; 8 gốc Cys, 1 gốc Lys và 2 gốc His nằm trong TTHĐ của enzyme Phân tử mARN mã hóa enzyme này có kích thước khoảng 1 Kb chỉ tìm thấy duy nhất ở nhau thai mà không có ở một mô nào khác Hoạt tính ribonucleolytic của RNase 8 thấp hơn hoạt tính của các RNase 1 - 3, 6, và 7 phát hiện trước đó [53, 58]

Ngoài các RNase thuộc siêu họ RNase A ở người đã kể ở trên thì trong nhiều

tế bào, mô và các cơ quan khác của người còn có mặt nhiều enzyme thuộc các nhóm lớn khác như: RNase H, RNase P, RNase L và một số protein có hoạt tính ribonucleolytic như Lactoferrin, kháng thể (ABzyme) [61]

4 CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA RNASE

4.1 Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic

Một chức năng rất quan trọng của RNase trong tế bào là tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN [41, 50, 61] Trong số các enzyme đó phải kể đến RNase H tách từ dòng tế bào ung thư K562 ở người có hoạt tính 3’- và

5’-exonuclease thủy phân ARN trong thành phần phân tử lai ADN-ARN tạo nên các đoạn chứa 5’-P và 3’-OH Có hai loại RNase H ở người:

- RNase H1: Mr = 89 kDa giữ vai trò loại bỏ các đoạn ARN mồi trong quá trình sao chép ADN Để hoạt hóa tốt RNase H1 cần có cation hóa trị 2, enzyme

pHopt = 8 - 8,5

- RNase H2: Mr = 33 kDa tách từ nhau thai và tham gia vào quá trình sao mã tổng hợp ARN Hoạt động của RNase H2 trong vùng pHopt = 8,5 - 9 và cần ion

Mg2+

4.2 Chức năng tiêu hóa

Chức năng tiêu hóa là chức năng sinh lý rất quan trọng của RNase Một lượng lớn ARN có trong thức ăn bị phân hủy bởi RNase A hay RNase 1 (ở người) Dưới tác dụng của RNase, mạch ARN bị phân giải từng bước thành các oligonucleotide hoặc mononucleotide và phosphate vô cơ Sau đó các dạng này được chuyển hóa nhờ các enzyme tiêu hóa khác thành những sản phẩm dễ hấp thụ [55, 61]

4.3 Tham gia vào quá trình chế biến và chín của ARN

Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hóa phức tạp với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau Một trong những RNase đó là RNase P Enzyme này có mặt ở cả các sinh vật thuộc nhóm đơn giản như vi khuẩn

cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn (Eucaria) RNase P là một enzyme có hai thành phần chính là ARN và protein gắn với nhau, trong đó tiểu đơn

vị protein chiếm khối lượng phân tử nhỏ còn tiểu đơn vị lớn ARN đóng vai trò là trung tâm hoạt động và chiếm khối lượng chủ yếu trong thành phần enzyme ARN

có cấu trúc bậc 2 và có biểu hiện hoạt tính ngay cả khi không có tiểu phần protein

RNase P giữ vai trò thủy phân liên kết phosphodieste trên phân tử tiền chất tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein Ngoài ra RNase P còn cắt mARN đặc hiệu trình tự bằng cách dùng các trình tự định hướng để liên kết với cơ chất thông qua các liên kết cặp đôi base, sau

đó cắt rồi phân li sản phẩm [27, 61]

4.4 Vai trò trong các phản ứng miễn dịch của cơ thể

Phản ứng miễn dịch của cơ thể xảy ra để chống lại các yếu tố gây bệnh xâm nhập vào cơ thể như các vi sinh vật (vi khuẩn, virus), độc tố vi sinh vật, các phân tử lạ… Ngoài RNase L tham gia vào các phản ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể chống virus còn có RNase 7 và các RNase từ bạch cầu acid ECP và EDP thuộc siêu

họ RNase A của người cũng tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể [21, 22,

RNase L là endonuclease được tế bào tổng hợp cảm ứng bởi interferon, tham gia thủy phân cả ARN của virus và của tế bào tạo ra sản phẩm có đầu cuối 3’-phosphate và 5’-OH Hoạt động của enzyme này cần phải có mặt các ion Mg2+ hoặc

Mn2+ và ATP RNase L bị ức chế bởi protein đặc hiệu: RL-I (là protein ức chế việc thực hiện cơ chế chống virus của interferon) [16, 34, 48]

4.5 Tham gia vào quá trình sinh sản

Ở nhiều loại cây ra hoa lưỡng tính có các cơ chế phá vỡ sự tự thụ phấn gọi là

sự tự kị (self-incopatubility-SI) SI cho phép nhụy nhận biết phấn của mình (có quan hệ về mặt di truyền) và phấn lạ (sai khác di truyền) trong cùng một loài nhờ vậy sẽ ức chế sự phát triển của phấn mình trong ống phấn chính mình nhưng lại cho phép phấn lạ thụ tinh Do đó, SI đã ngăn ngừa hiện tượng lại trực huyết và cho phép lai chéo tạo nên sự đa dạng di truyền trong phạm vi loài Một trong các cơ chế của

SI được thực hiện nhờ S-RNase - một RNase có tính đa hình phân tử rất cao ở nhiều loài thực vật tương ứng [43, 47]

Ở động vật, BS-RNase tách từ tinh dịch bò cũng đóng vai trò đặc biệt về mặt sinh sản BS-RNase ức chế phản ứng miễn dịch của bò cái chống lại tinh trùng nên tạo điều kiện cho quá trình thụ tinh xảy ra Ngoài ra, protein này còn thể hiện hoạt tính chống sinh tinh trùng [36]

4.6 Hoạt tính cytotoxin

Hoạt tính cytotoxin là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng của RNase.[41, 50] Trong số hơn 100 enzyme thuộc siêu họ RNase A được biết cho đến nay, chỉ có BS-RNase (enzyme từ tinh dịch bò) [11, 14, 36, 49,] và các RNase từ 3

loài ếch: ếch báo phương bắc Rana pipiens [38, 50], ếch bò Rana catesbeiana [32, 50] và ếch đồng Nhật Bản Rana japonica [50] - là có hoạt tính cytotoxin Cơ sở của

hoạt tính cytotoxin là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein ức chế RNase (RI) trong bào tương [12, 28, 29, 44, 45], nhờ đó RNase dễ dàng phân cắt cơ chất ARN đặc hiệu trong tế bào, giúp diệt hiệu quả khối u Hai enzyme có hoạt tính cytotoxin được nghiên cứu nhiều là onconase (ONC) và BS-RNase

- Onconase kìm hãm sự phân chia tế b ào ở giai đoạn G1 bằng cách liên kết với các vị trí đặc hiệu trên màng huyết tương của tế bào đích glioma (mô đậm thần kinh) Sau đó ONC tiếp cận với ARN tế bào đích rồi phân giải ARN qua đó ngăn cản quá trình tổng hợp protein làm cho tế bào bị tiêu diệt [35]

Hoạt tính cytotoxin của ONC có thể bị ức chế bởi NaNO3 và deoxyglucoze Khả năng ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào của ONC đã

2-bị ankyl hóa giảm tới 100 lần tương ứng với hoạt tính ribonucletylic còn lại khoảng 2% so vói dạng ban đầu [56]

- BS-RNase là đồng đẳng với RNase A được tách từ tinh dịch bò có hoạt tính độc với các động vật có vú Hoạt tính cytotoxin của enzyme này phụ thuộc vào cấu trúc bậc 4 của nó: dạng BS-RNase monomer không độc với tế bào vì chúng liên kết chặt chẽ với chất ức chế RI trong tế bào chất Chỉ có dạng BS-RNase dimer mới có hoạt tính gây độc tế bào Trong hai dạng dimer của BS-RNase thì dạng trao đổi chéo MxM có hoạt tính cytotoxin cao hơn vì nó tồn tại bền vững trong môi trường khử của bào tương [36]

Hiện nay, ngoài các RNase tự nhiên có hoạt tính chống ung thư người ta đã tạo ra nhiều dạng biến thể (variant) của RNase A và RNase tụy người mang hoạt tính cytotoxin, kể cả ở dạng dimer [18, 54] và monomer [28, 39, 40]

4.7 Các chức năng sinh học khác

Ngoài những chức năng chính đã kể trên, RNase còn biểu hiện nhiều hoạt tính sinh học đặc biệt khác như:

- Tham gia vào sự hình thành mao mạch (angiogenin) [31, 33, 61]

- Gây ức chế miễn dịch (BS-RNase) [36]

- Thể hiện độc tính chọn lọc kháng côn trùng (ECP, EDP)… [61].

Bên cạnh các RNase, trong cơ thể người còn có một số protein biểu hiện hoạt tính ribonucleotylic như lactoferrin, ABzyme… Lactoferrin là protein liên kết Fe có trong sữa, huyết thanh và dịch ngoại tiết của cơ thể, giữ vai trò diệt khuẩn, tăng cường sự phân chia tế bào, điều hòa quá trình tạo nguyên bào tủy xương và kích thích miễn dịch ABzyme là kháng thể thủy phân ARN có trong máu các bệnh nhân mắc chứng lao ban đỏ, bệnh tự miễn và trong sữa người Người ta giả định rằng các kháng thể này là các antidiotype thứ cấp bắt chước trung tâm hoạt động của RNase [61]

Hiện nay, ngày càng nhiều protein có hoạt tính RNase với chức năng bảo vệ được tìm thấy ở cả vi sinh vật và thực vật như các ribotoxin -sarcin từ nấm mốc

Aspergillus giganteus, antigen Asp f1 của Aspergillus fumigatus… góp phần đa

dạng hóa nguồn RNase tự nhiên tạo cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị bệnh

5 RNASE TỪ NỌC RẮN

5.1 Khái quát

Từ xưa cho tới nay, người ta vẫn sử dụng gần như toàn thân con rắn: thịt, xương, da, mật, mỡ, máu, nọc… làm nguồn thực phẩm và dược liệu quí để bồi bổ sức khỏe và chữa trị bệnh tật Trong các sản phẩm từ rắn thì nọc rắn được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là nọc của loài rắn độc

Rắn có thành phần chủ yếu sau:

Thịt rắn có: protein, mỡ, 0,55% chất saporozit

Mật rắn: chlestrin, acid panmitic, acid stearic và taurin

Nọc rắn: glycoprotein thrombin, lipase và 3 loại chất chống đông

Nọc rắn mới tiết ra là một chất lỏng trong, màu hơi vàng với tỉ trọng 1,01 - 1,03 và độ dính cao, hàm lượng nước lên tới 70-80% Sau 24h nọc rắn có thể bị biến chất Nếu làm khô, nọc rắn sẽ ở dạng tinh thể nhỏ, màu răng và giữ nguyên tính độc hàng chục năm Về thành phần, nọc rắn là hỗn hợp của nhiều chất có hoạt tính sinh học, trong đó chủ yếu là các enzyme như proteinase, phospholipase (A, B,

C, D), ATPase, hydrolase, phosphatase kiềm, phosphatase acid, DNase, RNase, ATPase, cholinesterase… Trong số các enzyme của nọc rắn, chỉ có phospholipase

và protease là được nghiên cứu nhiều còn RNase thì mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam Độc tố chủ yếu của nọc rắn gây ra bởi các toxin mang bản chất peptide và các protein phân tử lượng thấp như độc tố neutotoxin, độc tố cardiotoxin, laticotoxin, erabutoxin b, các chất gây chảy máu và chống đông máu, các chất gây dị ứng Chúng tác động lên hệ cơ, hệ thần kinh, hệ tim mạch, hệ hô hấp… gây nên nhiều triệu chứng như tê liệt thần kinh cơ, giảm khả năng đông máu, tổn thương thành mạch máu trong, tan tiểu cầu dẫn đến xuất huyết

ở phổi, màng bụng và tim

Nọc rắn được sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: Thuốc gây mê, thuốc giảm đau sau mổ, thuốc an thần, thuốc chống viêm…

5.2 Một vài đặc điểm và tính chất quan trọng của RNase tách từ nọc rắn

Theo các nghiên cứu về RNase tách từ nọc của loài rắn hổ mang vùng Trung

Á của Liên Xô trước đây và Ấn Độ thì hoạt tính RNase trong nọc của ba loài rắn ở

vùng Trung Á và Liên Xô là Vipera, Leleetina, Naja oxiana và Echiscorinatus có thể khác biệt nhau tới 10 lần, trong đó RNase của Naja oxiana có hoạt tính cao nhất

Các tác giả Vasilenko và Babkina đã tách chiết, làm sạch và nhận được chế phẩm RNase có pHopt = 7,6 - 7,8, được hoạt hóa bởi ion Mg2+ và không thủy phân ADN

Độ bền nhiệt của enzyme này không cao, mất 50% hoạt tính khi đun cách thủy 5’ ở

50oC và mất hoàn toàn hoạt tính khi xử lý như vậy ở nhiệt độ 70oC Sản phẩm của phản ứng thủy phân do enzyme này xúc tác là hỗn hợp các oligonucleotide từ dimer đến hexamer, chủ yếu là dimer và trimer [59, 60] Chế phẩm RNase tinh khiết tách

từ nọc rắn hổ mang Maja naja vùng Guntur Ấn Độ lại có những biểu hiện khác: dải

nhiệt độ hoạt động tốt là 37 - 60oC với tối ưu nhiệt độ là 37oC, RNase này rất bền với urea, hoạt tính cực đại ở nồng độ urea là 2,5M; các ion kim loại cũng ảnh hưởng phức tạp tới hoạt tính Ribonucleolytic của enzyme: ion Mg2+ giúp tăng cường hoạt động; K+ và Ca+ ở nồng độ thấp 0,2mM và 0,4mM thì ức chế enzyme nhưng ở nồng

độ cao > 2,5mM lại có tác dụng hoạt hóa Các ion kim loại nặng phần lớn là những chất ức chế [42]

Các nghiên cứu ở Việt Nam mới đây cho thấy nguồn enzyme từ nọc rắn hổ mang Việt Nam có nhiều điểm khác biệt so với các RNase đã được nghiên cứu trên thế giới: pHopt = 2,62  0,6; RNase rất bền với nhiệt và Mg2+ không phải là chất hoạt hóa RNase… [2, 3, 7] Những kết quả trên cho thấy ở các loài rắn khác nhau thì tính đặc trưng của RNase cũng khác nhau và có thể tồn tại nhiều dạng phân tử RNase nọc rắn với bản chất protein khác nhau

6 NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA RNASE TRONG Y HỌC

RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong y học Ngoài chức năng tiêu hóa và tham gia vào các hoạt động sao mã, phiên mã, sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun…

Nồng độ và hoạt tính của RNase trong dịch bào và các dịch cơ thể có liên quan tới trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng là kết quả phản ứng của cơ thể chống lại bệnh tật Đôi khi chính RNase lại là tác nhân gây bệnh vì chúng gây độc cơ thể

Những ứng dụng trực tiếp của RNase trong điều trị bệnh virus cho người và vật nuôi đã được tiến hành ở Liên Xô vào những năm 70 của thế kỷ trước Trong liệu pháp người ta có thể dùng những chất hoạt hóa, chất ức chế hay thậm chí cả những RNase và dạng hợp thể của RNase để trị bệnh

Ví dụ: chất ức chế không chọn lọc enzyme photphodiesterase là teophilin hay chất ức chế chọn lọc rolipram có tác dụng giải phóng các neurotoxin ECP, EDN

từ các bạch cầu axit giúp giảm hiệu ứng ngộ độc thần kinh Chất ức chế RNase của người làm giảm hiệu ứng gây dị ứng của các tác nhân gây dị ứng có hoạt tính RNase ở một số loài thực vật Chế phẩm orange hoạt hóa RNase L có thể bảo vệ tế bào khỏi nhiễm trùng virus

Những năm gần đây, ngoài việc tìm được một số RNase nguồn gốc tự nhiên

có nhiều đặc tính quý báu (như onconase, BS-RNase) các nhà khoa học còn tập

trung sản xuất ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư nhờ việc vận dụng thành công các kỹ thuật và phương pháp công nghệ sinh học hiện đại ở mức độ phân tử Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một hay một vài gốc amino acid cần cho sự tương tác RI-RNase hoặc tạo thêm liên kết disunfide trong tế bào

Các biến thể của RNase cũng được tạo ra bằng cách gắn đặc hiệu vào RNase những phân tử protein liên kết chặt chẽ với những tế bào nhất định cho phép tạo ra những toxin chọn lọc hiệu quả

Kết luận: Những dẫn liệu trên đây cho chúng ta thấy khả năng ứng dụng và triển vọng của RNase đối với Y học Trong tương lai, nhiều dạng RNase vẫn sẽ được nghiên cứu để tạo ra các loại thuốc tác động hiệu quả lên các khối u, các thuốc chữa dị ứng, các test chuẩn đoán cũng như các hệ thống truyền tín hiệu định hướng

và chọn lọc Nhiều bệnh hiểm nghèo sẽ được phòng chống và chữa trị hiệu quả

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Vật liệu

- Vật liệu để tách RNase: Nọc rắn hổ mang (Naja naja, Cantor, 1970) dạng

đông khô mua từ làng nghề nuôi rắn xã Vĩnh Sơn, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh Phúc

Các dung dịch đệm:

- Các dung dịch đệm sử dụng cho sắc kí: các đệm citrate 10 mM với pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 và 6,0, không chứa muối NaCl và chứa muối NaCl với các nồng độ 0,15 M và 1,0 M; các dung dịch đệm phosphate 10 mM với pH 6,5; 7,0 và 7,5, không chứa muối NaCl và chứa muối NaCl với các nồng độ 0,10; 0,15 M và 1,0 M Các dung dịch đệm citrate và đệm phosphate 10 mM không chứa muối NaCl được gọi là các dung dịch đệm ban đầu (dung dịch A), các dung dịch đệm chứa muối NaCl ở nồng độ 1,0 M được gọi là dung dịch B

- Dung dịch đệm glycine (Gly) 10 mM, pH 2,5, một seri hỗn hợp đệm 4 thành phần Glycine-Citrate-Phosphate-Tris tổng nồng độ 40 mM, mỗi chất với nồng

độ 10 mM

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính RNase [1]

- Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bước sóng 260 nm Khi ARN bị thủy phân bởi RNase, mật độ quang (OD260) của dung dịch tăng lên Dựa vào sự thay đổi giá trị OD260 ta đo được hoạt tính enzyme của RNase

Hoạt tính RNase được đo trên máy quang phổ UV - visable Spectrophotometer UV-1601 của hãng Shimadzu và được tính theo công thức sau:

A = OD30”(+E) - OD0”(-E).k - OD(E) (1) Trong đó:

+ A là hoạt tính của RNase;

+ OD0”(-E) là hấp phụ của hỗn hợp phản ứng chứa cơ chất [(1000 - x) l dung dịch cơ chất] khi chưa cho x l dịch enzyme vào;

+ OD30”(+E) là hấp phụ của hỗn hợp phản ứng sau 30 giây phản ứng tính từ thời điểm bắt đầu phản ứng;

+ k là hệ số hiệu chỉnh: Tại thời điểm 0”, giá trị OD260 đã đo được chỉ là độ hấp phụ của (1000 - x) l dung dịch cơ chất, mà không phải là giá trị OD260 của hỗn hợp phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng, bởi vì khi cho thêm x l dung dịch enzyme vào để bắt đầu phản ứng thì hỗn hợp phản ứng bị pha loãng ra một chút Cho nên để tính được giá trị OD260 thực của hỗn hợp phản ứng tính tại thời điểm bắt đầu phản ứng, thì phải tính đến sự pha loãng này Đây chính là nguyên nhân vì sao phải sử dụng hệ số điều chính k Hệ số k được xác định như sau:

Đo OD260 của (1000 - x) l dung dịch cơ chất, kí hiệu là OD0”S Sau đó thêm vào x l dung dịch đệm pha cơ chất, khuấy đều và đo OD260, giá trị OD đo được kí hiệu là OD0”S+buf, khi đó:

k = OD0”S+buf/OD0”S (2)

- Một đơn vị (U) hoạt tính RNase là lượng enzyme xúc tác thủy phân ARN trong điều kiện tiêu chuẩn (nồng độ cơ chất bão hòa, nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, dung dịch đệm thích hợp…) làm tăng mật độ quang của hỗn hợp phản ứng (1 ml) lên 1 đơn vị

OD260 sau 30 giây phản ứng (thời gian phản ứng tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào hỗn hợp phản ứng chứa cơ chất) [1]

2.2.2 Các phương pháp sắc kí phân tách RNase nọc rắn hổ mang

2.2.2.1 Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột SP Sepharose 4 Fast Flow

- Cơ sở: Phương pháp sắc kí trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng tương tác tĩnh điện ion - ion giữa protein-enzyme tan trong dung dịch đệm loãng với nhựa trao đổi ion (chất mang), cụ thể là sự phân tách các protein trong một hỗn hợp protein dựa trên sự khác biệt trong điện tích bề mặt của các phân tử của chúng ở một giá trị pH nhất định Phương pháp này không chỉ là một khâu quan trọng trong quá trình tách chiết mà còn giúp đánh giá được một vài tính chất hóa lý của enzyme quan tâm [62, 63]

Sắc kí trao đổi ion được tiến hành trên cột (kích thước 0,9  20 cm, tức là thể tích cột gel khoảng 14 cm3) với chất mang là SP sepharose 4 Fast Flow Quá trình sắc kí trao đổi ion được tiến hành ở các giá trị pH khác nhau trong vùng pH = 4,0  7,5 Trong mỗi thí nghiệm đã sử dụng khoảng 70 mg nọc rắn đông khô để cho lên cột

+ Đầu tiên cột được cân bằng với dung dịch đệm ban đầu (đệm citrate hay đệm phosphate, xem phần trên)

+ Chuẩn bị mẫu nọc rắn: trước khi chạy sắc kí 1h cân khoảng 70 mg nọc rắn

hổ mang đông khô và hòa tan trong ~ 1,5 ml dung dịch đệm ban đầu, sau đó li tâm trong 10 phút với tốc độ 12 000 vòng/phút ở 4oC, loại cặn, thu lấy phần dịch li tâm chứa enzyme để cho lên cột

Sắc kí ở các giá trị pH từ 4,0 đến 6,0 được tiến hành trong đệm citrate, còn sắc kí ở các giá trị pH từ 6,5 đến 7,5 – trong đệm phosphate Khi sắc kí ở các giá trị

pH từ 4,0 đến 6,5 quá trình sắc kí được tiến hành như sau: sau khi cho mẫu lên cột, rửa cột bằng 36 ml dung dịch, mối phân đoạn thu 3 ml (gồm 15 ml dung dịch ban đầu – dung dịch A, và 21 ml dung dịch ban đầu chứa 0,15 M NaCl có giá trị pH tương ứng), sau đó chạy gradient nồng độ NaCl 0,15  0,80 M với thể tích chung của gradient bằng 150 ml, mối phân đoạn thu 2 ml Sau khi kết thúc chạy gradient NaCl, rửa tiếp cột bằng 60 ml dung dịch B, mỗi phân đoạn thu 3 ml sắc kí ở giá trị

pH = 7,0, toàn bộ quá trình sắc kí được tiến hành tương tự, chỉ khác ở điểm là thay

đệm ban đầu chứa 0,15 M NaCl dùng để rửa cột bằng đệm ban đầu chứa 0,10 M NaCl và thay gradient 0,15  0,80 M bằng gradient 0,15  0,7 M NaCl, còn khi sắc

kí ở giá trị pH = 7,5 thì chỉ dùng dung dịch đệm ban đầu (dung dịch A) để rửa cột

và thay gradient 0,15  0,80 M bằng gradient 0,0  0,60 M NaCl

Toàn bộ quá trình sắc kí được tiến hành tự động trên thiết bị FPLC theo chương trình phần mềm sau:

Main

0.00 Base Volume

0.00 Block Dieukienbandau (Dieukienbandau)

0.00 Base SameAsMain 0.00 Alarm_Pressure Enabled, 3 {MPa}, 0.00 {MPa}

0.00 Alarm_UV Disabled, 3000 {mAU}, 0 {mAU}

0.00 Flow 1.00 {ml/min}

0.00 Buffer ValveA A1 0.00 Column Position Position2 0.00 End_Block

0.00 Block Loadmau (Loadmau) 0.00 Base SameAsMain 0.00 InjectionValve Load 0.00 Sample Flow 1 {ml/min}

0.00 FractionationStop 2.00 End_Block Block Ruacot (Ruacot) 0.00 Base SameAsMain 0.00 Sample Flow 0.00 {ml/min}

0.00 InjectionValve Inject 0.00 Fractionation 18mm, 3.000 {ml}, First Tube, Volume 36.00 End_Block

0.00 Block chaygradient (Chaygradient) 0.00 Base SameAsMain 0.00 Gradient 65,0{%B}, 150{Base}

0.00 Fractionation 18mm, 200 {ml}, Next Tube, Volume 150.00 End_Block

0.00 Block Haugradient (Haugradien)

0.00 Base SameAsMain 0.00 Gradient 100.00 {%B} 45{Base}

0.00 Fractionation 18mm, 3.000 {ml}, Next Tube, Volume 60.00 End_Block

0.00 Block Taisinhcot (Taisinhcot) 0.00 Base SameAsMain 0.00 Gradient 0.00 {%B} 45{Base}

0.00 FractionationStop 600.00 End_Block

2.2.2.2 Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên cột Superdex 75

Cơ sở: Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử (hay còn gọi là sắc kí lọc gel) dựa trên sự khác biệt trong hình dạng và kích thước phân tử của các protein khác nhau trong một hỗn hợp protein Khi cho một hỗn hợp protein có kích thước phân

tử khác nhau đi qua cột lọc gel, thì những protein có kích thước phân tử lớn hơn lỗ của các hạt gel sẽ không đi vào bên trong các hạt gel, và ra khỏi cột trong cái gọi là thể tích tự do của cột; còn những protein có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước

lỗ của các hạt gel, và chúng sẽ đi vào bên trong các hạt gel, tức là chúng được phân

bố giữa 2 pha – bên trong và bên ngoài các hạt gel với các hệ số phân bố tương ứng Các protein này sẽ đi ra khỏi cột lọc gel theo thứ tự ngược với kích thước phân tử của chúng, tức là các protein nào có kích thước phân tử lớn thì ra khỏi cột trước và những protein nào có kích thước phân tử nhỏ hơn sẽ ra sau, các chất muối (thường

có mặt trong các chế phẩm protein) ra khỏi cột sau cùng (chính vì vậy mà cột lọc gel thường được sử dụng để loại muối khỏi các dung dịch protein) [62, 63]

Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử cũng được tiến hành tự động trên thiết

bị sắc kí FPLC Trong phạm vi luận văn này chúng tôi chỉ tiến hành sắc kí sàng lọc phân tử chế phẩm nọc rắn hổ mang đông khô ở 2 giá trị pH khác nhau là 5,5 (trong đệm citrate 10 mM) và 7,5 (trong đệm phosphate 10 mM) Trong mỗi thí nghiệm đã

sử dụng khoảng 20 mg nọc rắn đông khô để cho lên cột

+ Đầu tiên cột được cân bằng với dung dịch đệm ban đầu (đệm citrate hay đệm phosphate, xem phần trên)

+ Chuẩn bị mẫu nọc rắn: trước khi chạy sắc kí 1h cân khoảng 20 mg nọc rắn

hổ mang đông khô và hòa tan trong ~ 1,5 ml dung dịch đệm ban đầu, sau đó li tâm trong 10 phút với tốc độ 12 000 vòng/phút ở 4oC, loại cặn, thu lấy phần dịch li tâm chứa enzyme để cho lên cột

Quá trình sắc kí sàng lọc phân tử trên cột superdex 75 (kích thước 0,9  60

cm, tức là thể tích cột gel khoảng 38 cm3) được tiến hành như sau: sau khi cho mẫu lên cột, sử dụng dung dịch đệm ban đầu tương ứng (citrate hay phosphate) để đẩy protein ra khỏi cột, không thu 15 ml dịch đầu tiên chảy ra khỏi cột (thể tích này gần bằng thể tích tự do của cột lọc gel - ~18 cm3), từ ml thứ 15 trở đi bắt đầu thu các phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn là 1 ml (thu khoảng 65 – 70 phân đoạn) Quá trình sắc kí lọc gel (sàng lọc phân tử) được tiến hành tự động trên máy sắc kí FPLC theo chương trình phần mềm sau:

Main

0.00 Base Volume

0.00 Block Dieukienbandau (Dieukienbandau)

0.00 Base SameAsMain 0.00 Alarm_Pressure Enabled, 3 {MPa}, 0.00 {MPa}

0.00 Alarm_UV Disabled, 3000 {mAU}, 0 {mAU}

0.00 Buffer ValveA A1 0.00 Flow 1.00 {ml/min}

0.00 End_Block

0.00 Block Loadmau (Loadmau) 0.00 Base SameAs Main 0.00 Sample Flow 1.00 {ml/min}

0.00 InjectionValve Load 2.00 End_Block

0.00 Block chaycotlocgel (Chaycotlocgel) 0.00 Base SameAs Main 0.00 InjectionValve Inject 0.00 Fractionation 18mm, 100 {ml}, Tube Number [B9], Volume 75.00 End_Block

0.00 Block Taisinhcot (Taisinhcot) 0.00 Base SameAsMain 0.00 InjectionValve Inject 0.00 FractionationStop 300.00 End_Block

Hàm lượng protein được ghi tự động liên tục trên máy sắc kí Tuy nhiên, sau khi quá trình sắc kí kết thúc đã tiến hành đo hoạt tính RNase và hàm lượng protein trong tất cả các phân đoạn thu được

2.2.2.3 Phương pháp phân tích kết quả phân tách protein

Như đã để cập tới ở trên, hàm lượng protein được xác định liên tục và được ghi lại tự động trên máy sắc kí, do vậy sắc kí đồ phân tách protein là một đường cong liên tục được ghi lại trên máy sắc kí Hơn nữa, trên thiết bị FPLC còn có phần mềm xử lí các kết quả phân tách protein nhận được sau sắc kí: chỉ cần đặt con trỏ vào vùng sắc kí đồ và kích phải là hiện lên menu, sau đó kích tiếp vào hàng “peak intergrate”là máy sẽ tự động vẽ baseline ở vùng chân của các đỉnh protein ở dạng một đường gạch đứt quãng, đồng thời trên sắc kí đồ xuất hiện sự phân chia ranh giới giữa các đỉnh protein, trên mỗi đỉnh protein đều có ghi số chỉ thể tích ra khỏi cột của đỉnh protein tương ứng, đặc biệt là trên màn hình ở phia dưới sắc kí đồ còn

xuất hiện một bảng lớn tổng kết kết quả phân tách protein của thí nghiệm đã cho, chứa các thông số chính sau bao gồm 4 cột sau:

- Số thứ tự của các đỉnh protein mà máy tính được

- Thể tích ra khỏi cột của mỗi đỉnh protein (ml)

- Chiều cao của đỉnh protein tương ứng (đơn vị là mAU)

- Diện tích của đỉnh protein tương ứng (đơn vị là mAU*ml)

và các hàng:

- Tổng số đỉnh protein phát hiện được

- Tổng diện tích [giữa đường cong protein và basline] (mAU*ml)

- Tổng diện tích của các đỉnh được đánh giá (mAU*ml)

- Tỉ số diện tích các đỉnh/tổng diện tích (= 1)

- Tổng chiều rộng của các đỉnh (ml)

Trong tất cả các thí nghiệm phân tách protein trên thiết bị FPLC số đỉnh protein mà máy tính được đều nhiều hơn số đỉnh protein có thể phân tách ra được trên thực tế, cho nên khi tính số đỉnh protein trong mỗi thí nghiệm chúng tôi phải loại bỏ các đỉnh đó vì các nguyên nhân sau đây:

- Chỉ một xung động nhỏ, ví dụ như tự nhiên áp suất bị tụt xuống bằng 0 (điều này đôi khi xảy ra trong quá trình sắc kí) cũng được ghi lại ở dạng một vạch thẳng (có độ cao khác nhau tùy thuộc từng thời điểm) trên sắc kí đồ và vạch này được máy nhận biết như là một đỉnh protein; những đỉnh giả này đương nhiên bị loại bỏ

- Có những đỉnh rất nhỏ được máy thống kê mà thường không nhận thấy được trên sắc kí đồ, thì chúng tôi cũng loại bỏ (thường loại bỏ những đỉnh có chiều cao không quá 1 mAU)

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu một số tính chất của RNase nọc rắn hổ mang

2.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên hoạt tính enzyme

pH dung dịch đệm ảnh hưởng rất mạnh lên phản ứng enzyme nói chung và phản ứng thủy phân nói riêng, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme cũng như độ bền của phân tử protein - enzyme Để nghiên cứu mối phụ thuộc hoạt

tính của enzyme vào pH (và cả tìm pHopt của các chế phẩm RNase nọc rắn hổ mang tương ứng với các đỉnh RNase đã nhận được), chúng tôi tiến hành đo hoạt tính của enzyme theo phương pháp đã mô tả ở trên trong hỗn hợp đệm Gly - Citrate - Phosphate –Tris 40 mM tại các giá trị pH trong vùng pH = 1  9, với các giá trị pH khác nhau cách nhau từ 0,25 - 0,5 đơn vị pH

Chuẩn bị các dung dịch cơ chất với nồng độ thích hợp trong các dung dịch đệm tương ứng (các dung dịch cơ chất có OD0 260(-E) = 2,0 - 2,1)

- Tiến hành đo hoạt tính enzyme ở các giá trị pH khác nhau như đã trình bày

ở trên

- Tính A hay P như đã trình bày theo công thức (1) ở trang 19

- Từ các kết quả nhận được xây dựng đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính của enzyme vào pH (đồ thị A – pH hay P – pH);

- Từ đồ thị trên xác định được giá trị pHopt của enzyme

2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu động học bão hòa enzyme bởi cơ chất (động học P – S)

Để nghiên cứu động học bão hòa RNase bởi cơ chất, chúng tôi tiến hành đo hoạt tính của enzyme trong hỗn hợp đệm Gly - Citrate - Phosphate –Tris 40 mM (mỗi thành phần có nồng độ 10 mM) có giá trị pH tương ứng với pHopt của các đỉnh RNase, với nồng độ cơ chất trong khoảng từ 0,25 đến 2,5 đơn vị OD260 Phương pháp tiến hành như sau:

- Chuẩn bị seri hỗn hợp đệm Gly - Citrate - Phosphate –Tris 40 mM có các giá trị pH tương ứng với pHopt của các đỉnh RNase nhận được sau sắc kí trao đổi ion;

- Chuẩn bị các dung dịch cơ chất (ARN) để sử dụng làm dung dịch mẹ (từ đây pha ra được các dung dịch cơ chất có các nồng độ cơ chất khác nhau) trong các hỗn hợp đệm Gly - Citrate - Phosphate –Tris 40 mM có giá trị pH tương ứng với pH tối ưu của các đỉnh RNase đã chuẩn bị ở bước trên;

- Pha các seri dung dịch cơ chất với các nồng độ cơ chất khác nhau từ các dung dịch cơ chất-dung dịch mẹ tương ứng đối với mỗi đỉnh RNase;

- Đo hoạt tính của các đỉnh RNase với mỗi seri dung dịch cơ chất có pH

tương ứng với pH tối ưu của đỉnh RNase đó;

- Xây dựng đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính của các đỉnh RNase vào

nồng độ của cơ chất ở giá trị pH tương ứng với pH tối ưu của đỉnh RNase đó

(đường cong bão hòa enzyme bởi cơ chất);

- Từ các đồ thị (đường cong P – [S] hay A – [S]) nhận được, xác định giá trị

của hằng số Michaelis-Menten (hoặc giá trị S0,5 trong trường hợp enzyme không

tuân theo động học Michaelis-Menten thông thường) của các đỉnh RNase

Để cho thuận tiện, trong các thí nghiệm về nghiên cứu mối phụ thuộc hoạt

tính của RNase vào pH và nghiên cứu động học bão hòa enzyme bởi cơ chất, cả

nồng độ cơ chất (ARN) sản phẩm của phản ứng đều được biểu diễn bằng đơn vị

(đv) OD260 Từ đơn vị OD này dễ dàng tính được nồng độ cơ chất (ARN) trong hỗn

hợp phản ứng theo công thức sau [63]:

[ARN] = 40.OD260 (g/ml) ((3)

Một đơn vị RNase (1 U) là lượng enzyme RNase xúc tác phản ứng thủy phân

chế phẩm ARN từ nấm men trong các điều kiện tối ưu, làm tăng OD của hỗn hợp

phản ứng lên 1 đơn vị OD260 Điều kiện phản ứng: nồng độ cơ chất bão hòa, nhiệt

độ phòng, phản ứng thực hiện trong đệm Glycine 10 mM, pH 2,5 với thể tích chung

của hỗn hợp phản ứng là 1 ml và thời gian tiến hành phản ứng là 30 s [1]

2.2.4 Các phương pháp xác định hàm lượng protein

- Trong tất cả các thí nghiệm về sắc kí hàm lượng protein được ghi tự động

liên tục ở bước sóng 280 nm bởi thiết bị tự ghi của máy sắc kí FPLC trong suốt quá

trình sắc kí Tuy nhiên, hàm lượng protein trong các phân đoạn nhận được sau sắc

kí đều được xác định bằng phương pháp quang phổ theo hấp phụ của các dung dịch

protein tương ứng ở các bước sóng 280 và 260 nm Sau đó được tính theo công

thức:

[Pr] = 1,45.OD280 – 0,74.OD260 (mg/ml) (4)

hoặc được thính theo biểu đồ (hay nomogram) tương ứng [62, 63]

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNRNase là nhóm enzyme được nghiên cứu rất nhiều, nhưng RNase từ nọc rắn nói chung còn ít được nghiên cứu Cho đến nay chỉ có RNase từ nọc rắn hổ mang của Ấn Độ là nhận được ở dạng có độ sạch cao Còn RNase từ nọc rắn của các loài

hổ mang khác mới chỉ được làm sạch một phần RNase từ nọc rắn hổ mang ở nước

ta vẫn chưa được nghiên cứu, ứng dụng vì vậy những đặc tính của enzyme này như

pHopt, độ bền nhiệt, khả năng hấp thụ trên các loại gel như gel Ca-P, khả năng tương tác với chất mang trao đổi ion, khối lượng phân tử đều chưa được biết đến

Trong giới hạn khoá luận này, chúng tôi mới bước đầu nghiên cứu một số tính chất hoá lý và xúc tác cơ bản của enzyme và sử dụng một số phương pháp kỹ thuật thông thường được áp dụng để tinh chế và làm sạch protein nói chung và enzyme nói riêng nhằm tách RNase ra khỏi các protein khác của nọc rắn hổ mang với mục đích tìm quy trình sơ bộ để làm sạch enzyme này Sau đó nghiên cứu một số tính chất hoá lý và xúc tác của RNase từ nọc rắn hổ mang ở Việt Nam

3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÁCH RNASE NỌC RẮN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ

3.1.1 Kết quả phân tách RNase nọc rắn bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion Như chúng ta biết rằng các protein khác nhau có điện tích tổng số khác nhau

và sự khác biệt trong điện tích bề mặt là cơ sở để phân tách các protein khác nhau bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion Mặt khác, điện tích tổng số bề mặt của protein lại phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường Do đó một trong các vấn đề đặt ra khi sử dụng phương pháp sắc kí trao đổi ion để phân tách một enzyme ra khỏi hỗn hợp protein phức tạp là tìm giá trị pH mà tại đó sự phân tách đạt hiệu quả tốt nhất Chính vì vậy mà một trong những nhiệm vụ quan trọng của luận văn là tối ưu hoá điều kiện phân tách enzyme RNase của nọc rắn hổ mang theo giá trị pH và tối

ưu hoá điều kiện phản hấp thụ enzyme khỏi cột trao đổi ion để cho các đỉnh enzyme tách ra khỏi nhau và tách ra khỏi các đỉnh protein khác nhau càng xa càng tốt

Để đạt được mục đích nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhựa trao đổi ion SP Sepharose 4 Fast Flow (Sulfopropyl-Sepharose 4 Fast Flow), một

chất mang làm việc trong vùng pH rộng (từ pH = 2,0 đến pH = 13) và có nhiều tính chất cơ lí tốt cho thực hiện quá trình sắc kí trao đổi ion (như độ bền cơ học cao, không bị co ngót ở nồng độ muối cao…)

Quá trình sắc kí đã được tiến hành trong vùng pH = 4,0  7,5 (cụ thể là ở các giá trị pH bằng 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5)

kí đồ này (B) Trục hoành là thể tích, ml; trục tung là giá trị OD280; đường cong liền là protein, đường chéo là gradient nồng độ NaCl; đường cong đứt là baseline, hàm lượng protein được ghi liên tục trên máy sắc kí Theo kết quả tính toán trên máy sắc kí FPLC (xem bảng 1 phần Phụ lục), ở giá trị pH = 4,0 protein nọc rắn hổ mang phân tách ra được thành 16 đỉnh lớn bé khác nhau Tuy nhiên chúng tôi cho rằng trong 16 đỉnh protein này chỉ có 9 đỉnh là được tính, số còn lại không được tính đến do các nguyên nhân đã nêu trong phần phươngpháp nghiên cứu Các thông số chính của những đỉnh protein này (gồm thể tích ra

Tri SP NRHM 14 10 09001:1_UV T ri SP NRHM 14 10 09001:1_Conc Tri SP NRHM 14 10 09001:1_UV@01,BASE M

khỏi cột – V, ml; chiều cao của đỉnh – h, mAU, diện tích của đỉnh, S = hv, mAU*ml, v là thể tích của đỉnh; và tỉ trọng của đỉnh - %) được dẫn ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Một số thông số chính của các đỉnh protein nọc rắn phân

tách được trên cột SP ở pH 4,0

S, mAU*ml

Kết quả xác định hoạt tính RNase trong các phân đoạn sắc kí được tóm tắt trong bảng 3.2 (xem trang sau)

Các kết quả trong bảng 3.2 cùng với kết quả xác định protein trong từng phân đoạn được trình bày ở dạng sắc kí đồ trên hình 3.2 Kết quả trong bảng 3.2 và sắc kí

đồ trên hình 3.2 cho thấy ở giá trị pH = 4,0 RNase nọc rắn hổ mang phân tách ra được thành ít nhất 5 đỉnh enzyme khác nhau, trong đó có 3 đỉnh 2, 3 và 4 tương đối đối xứng, còn 2 đỉnh 1 và 5 không đối xứng (đều có vai bên trái được kéo dài ra) Hai đỉnh enzyme không đối xứng này cũng là những đỉnh enzyme lớn nhất Ngoài

ra, giữa 2 đỉnh 2 & 3 có thể còn có 1 đỉnh enzyme nhỏ nữa

Bảng 3.2 Kết quả xác định hoạt tính RNase trong các phân đoạn sắc kí

180 Pr

A/phđ

Pr, mAU

Gradient NaCl

Hình 3.2 Sắc kí đồ phân tách RNase nọc rắn hổ mang trên cột SP

Sepharose 4 Fast Flow ở giá trị pH = 4,0 (A là hoạt tính RNase/phân

đoạn, U; Pr là protein, mAU/ml) Tổng hợp kết quả phân tách RNase nọc rắn hổ mang được tóm tắt trong bảng 3.3

Từ sắc kí đồ trên hình 3.2 ta

thấy hầu như cả 5 đỉnh RNase này đều

trùng với các đỉnh protein trong các

vùng tương ứng, trừ đỉnh enzyme thứ

hai: đây là đỉnh RNase nhỏ nhất nằm

sát chân đỉnh phía bên phải của đỉnh

protein lớn thứ hai Hơn nữa, đỉnh RNase

Bảng 3.3 Kết quả phân tách RNase nọc rắn hổ mang ở pH 4,0

Kết quả phân tách protein nọc rắn hổ mang ở giá trị pH = 4,5 được trình bày

ở dạng sắc ký đồ trên hình 3.3

A

B

Hình 3.3 Sắc kí đồ phân tách protein nọc rắn hổ mang trên cột SP Sepharose 4 Fast Flow ở giá trị pH = 4,5 (ghi chú như trên hình 3.1)

Tri SP NRHM 08 10 09001:1_UV Tri SP NRHM 08 10 09001:1_Conc Tri SP NRHM 08 10 09001:1_UV@01,BASEM

22.23

Theo kết quả tính toán trên máy sắc kí FPLC (xem bảng 2 phần phụ lục) ở giá trị pH = 4,5 protein nọc rắn hổ mang phân tách ra được thành 19 đỉnh lớn bé khác nhau Tuy nhiên, cũng giống như trường hợp sắc kí ở pH 4,0 chúng tôi chỉ tính

13 trong số 19 đỉnh này (các thông số chính của những đỉnh protein này được dẫn trong bảng 3.4), số còn lại không được tính đến do các nguyên nhân đã nêu trong phần phương pháp nghiên cứu

Bảng 3.4 Một số thông số chính của các đỉnh protein nọc rắn phân

Nếu tính theo chiều cao của đỉnh thì đỉnh protein 3 cao tương đương với đỉnh 3 và 8 Ngoài ra đỉnh protein 2 nằm rất gần đỉnh 3 và trên sắc kí đồ chỉ thấy ở dạng vai trái của đỉnh protein 3 (hình 3.3 A), mới chỉ tách được phần đầu đỉnh ra khỏi đỉnh protein 3 (xem phóng đại của phần sắc kí tương ứng trên hình 3.3.B) Trên sắc kí được vẽ theo nồng độ protein của từng phân đoạn thì đỉnh protein 2 này hoàn tòan không thấy (xem hình 3.4 ở dưới)

Kết quả xác định hoạt đính RNase trong các đoạn phân đoạn sắc kí được tóm tắt ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả xác định hoạt tính RNase trong các phân đoạn sắc kí

nọc rắn hổ mang ở giá trị pH = 4,5 (ghi chú như ở bảng 3.2)

0,2 Pr A/phđ

khác nhau, trong đó có 2 đỉnh lớn và 3 đỉnh nhỏ, đỉnh 1 và 2 là tương đối đối xứng, các đỉnh còn lại là không đối xứng, đỉnh 5 còn có vai trái khá rõ ràng (vai này thực

ra là một đỉnh enzyme nữa chưa được phân tách ra khỏi đỉnh enzyme chính) Tổng hợp kết quả phân tách RNase nọc rắn hổ mang được tóm tắt trong bảng 3.6

Từ sắc kí đồ trên hình 3.4 ta

nhận thấy 5 đỉnh RNase hầu như đều

trùng với các đỉnh protein trong các

vùng tương ứng, trừ đỉnh enzyme thứ

hai Đỉnh enzyme này nằm sát chân

bên phải của đỉnh protein lớn thứ hai

Các đỉnh RNase thứ 4 và 5 nằm trong

vùng các đỉnh protein nhỏ, nên có độ

làm sạch cao hơn các đỉnh còn lại

Bảng 3.6 Kết quả phân tách RNase nọc

4 Fast Flow ở giá trị pH = 5,0 (ghi chú như trên hình 3.1)

T ri SP NR HM 0 6 10 09 00 1:1_ UV T ri SP NR HM 0 6 10 09 00 1:1_ C onc Tri SP NR HM 06 1 0 0 90 01 :1_ UV@0 1,BASE M

Theo kết quả tính toán trên máy sắc kí FPLC ở giá trị pH = 5,0 protein nọc rắn hổ mang phân tách ra được thành 20 đỉnh lớn bé khác nhau (xem bảng 3 phụ lục) Tuy nhiên chúng tôi chỉ tính có 12 đỉnh protein, còn 8 đỉnh khác bị loại bỏ

Bảng 3.7 Một số thông số chính của các đỉnh protein nọc rắn phân

Sắc kí đồ trên hình 3.5 cho thấy: về tổng thể có 2 đỉnh protein lớn (đỉnh 5 &

10 với thể tích ra khỏi cột tương ứng là 71,75 và 127,71 ml), và 2 đỉnh trung bình (đỉnh 4, và 9 với thể tích ra khỏi cột tương ứng là 16,69; 119,93 ml), các đỉnh protein còn lại là những đỉnh nhỏ và rất nhỏ

Nếu tính theo chiều cao của đỉnh protein thì đỉnh 4 còn cao hơn đỉnh 10 Ba đỉnh 1, 2 và 3 chỉ thấy rõ khi phóng đại phần tương ứng của sắc kí đồ (hình 3.5)

Các cặp đỉnh 7 & 8 và 9 & 10 nằm gần nhau, chỉ tách được phần đầu đỉnh ra khỏi nhau và nhìn giống như là các đỉnh kép

Kết quả xác định hoạt tính RNase trong các phần đoạn sắc kí được tóm tắt trong bảng 3.8, các kết quả trong bảng này được trình bày ở dạng sắc kí đồ trên hình 3.6 (xem trang sau)

Các kết quả trong bảng 3.8 và sắc kí đồ trên hình 3.6 cho thấy ở giá trị pH = 5,0 RNase nọc rắn hổ mang phân tách ra được thành ít nhất 7 đỉnh enzyme khác nhau, trong đó có một đỉnh (đỉnh 1) không hấp phụ trên cột trao đổi ion Theo cả hoạt tính enzyme chung và chiều cao của đỉnh, thì đỉnh RNase 7 là đỉnh lớn nhất, tiếp đến là các đỉnh 6, 2 và 3 Các đỉnh RNase 1, 4 và 5 là những đỉnh nhỏ

Bảng 3.8 Kết quả xác định hoạt tính RNase trong các phân đoạn sắc kí nọc rắn hổ mang ở giá trị pH = 5,0 (ghi chú như ở bảng 3.2)

0,2 Pr

A/phđ Protein

Gradient

Hình 3.6 Sắc kí đồ phân tách protein và RNase nọc rắn hổ mang trên

cột SP Sepharose 4 Fast Flow ở giá trị pH = 5,0 (hàm lượng protein

trong mỗi phân đoạn được xác định bằng phương pháp quang phố)

Tổng hợp kết quả phân tách RNase ở pH 5,0 được tóm tắt trong bảng 3.9

Từ sắc ký đồ trên hình 3.6 ta

thấy các đỉnh RNase 1, 2, 4, 6 và 7

đều trùng với các đỉnh protein tương

ứng Đỉnh RNase 3 bao phủ của 2

đỉnh protein 7 & 8, còn đỉnh RNase 5

(đỉnh enzyme nhỏ nhất) lại không

trùng với đỉnh protein nào, mà nằm ở

chân bên phải của đỉnh protein 10

Hơn nữa, 2 đỉnh enzyme lớn nhất

(các đỉnh RNase 6 và 7) đều tương

4 Fast Flow ở giá trị pH = 5,5 (ghi chú như trên hình 3.1)

Theo kết quả tính toán trên máy sắc kí FPLC ở giá trị pH = 5,5 protein nọc rắn hổ mang phân tách ra được thành 20 đỉnh lớn bé khác nhau (xem bảng 4 phụ lục), tuy nhiên chúng tôi chỉ tính 12 trong số 20 đỉnh được tính trên máy sắc kí Các thông số chính của những đỉnh protein này được tóm tắt trong bảng 4.10

Bảng 3.10 Một số thông số chính của các đỉnh protein nọc rắn

phân tách được trên cột SP ở pH 5,5

ml

S, mAU*ml

h,

S, mAU*ml

8, với thể tích ra khỏi cột tương ứng là 83,42 và 110,77 ml Các đỉnh còn lại là những đỉnh nhỏ và rất nhỏ Hai đỉnh protein nhỏ đầu tiên cũng chỉ thấy rõ trên ảnh phóng đại của phần sắc kí đồ tương ứng (xem hình 3.7 B) Kết quả xác định hoạt tính RNase trong các phần đoạn sắc kí được trình bày trên hình 3.8 và bảng 3.11