tìm hiểu Hệ NZYME BROMELIN

Bromelin được chiết tách từ các thành phần khác nhau trên cây dứa và bromelin từ những nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau.

Enzyme Bromelin

I Đặc điểm nguồn nguyên liệu và bromelin [1]

1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu

Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusa được sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận

enzyme và ngoài ra còn được sử dụng trong một số lĩnh vực khác như dược, mỹ phẩm Phần thân và lá sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón

Trong quả dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng 80 – 86%, phần còn lại là carbonhydrate chiếm 10 – 18% (trong đó 60 – 67% saccharose, glucose và fructose chiếm 30 – 40%), protein 2 – 3%, acid hữu cơ 0.1 – 1.6% (trong đó citric acid chiếm 87% và 13% còn lại là maleic acid ), tro 0.3%, sắc tố 0.03 – 0.6% và các hợp chất phenolic (tạo màu), các hợp chất tạo mùi, các vitamin như: vitamin A, B1

và C và enzyme bromelin là một enzyme thủy phân protein Ngoài ra ở lá non trên ngọn thân cây dứa có chứa rất nhiều vitamin C

2 Đặc điểm của enzyme bromelin

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái)

Trước đây, cây dứa được sử dụng như một loại cây làm thuốc Năm 1957, Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelin và người ta bắt đầu chiết tách nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin quả và bromelin thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế Ở mỗi bộ phận khác nhau trên thân cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau

Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa Nó khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH 6 – 8 Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da, lớn gấp 1.5 lần so với papain

Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ 3 tháng trước khi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín Khi trái chín hoạt tính bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn

Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có thể thu được

3.6 kg bromelin từ 378l nước rút ra từ thân cây dứa).

II Tính chất của enzyme bromelin [1]

Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sunfhydryl thủy giải protein Trong dịch chiết bromelin còn chứa một ít peroxydase, phosphatase acid và chất cản protease Khi chiết tách và tinh sạch phân đọan có chứa nhóm sunfhydryl của bromelin thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả invitro, nhưng lại bị bất hoạt sinh lý invitro ở một số điều kiện mà bromelin có hiệu quả Như vậy, rõ ràng rằng phần lớn các hoạt động sinh lý của bromelin không chỉ phụ thuộc vào phân đọan có hoạt tính thủy phân protein mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác trong bromelin

Hiện tại người ta ghi nhận được trong bromelin thân dứa có tám thành phần

cơ bản có hoạt tính thủy phân protein Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5 Phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số Người ta ước tính rằng khoảng 50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate pH tối thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4 – 4.5 và của F9 thì gần với pH trung tính Dịch chiết bromelin toàn phần có hoạt động trong khoảng pH 4.5 – 9.8 Bromelin được chiết tách từ các thành phần khác nhau trên cây dứa và bromelin từ những nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau Bromelin không ổn định với nhiệt độ do đó các hoạt động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu quá trình chiết tách hay bảo quản không thích hợp

Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật Nồng độ cao nhất của bromelin được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thủy phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có là do tác động của các protease nội sinh và yếu tố α – 2 – macroglobuline của huyết thanh

1 Cấu tạo hoá học

Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide Trong sợi hydrate carbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử Người ta đề nghị cấu trúc sợi hydrate carbon của phân tử bromelin như sau:

OH OH OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

CH OH2

CH OH2

CH OH 2

OH OH

NHCONH3

NHCONH 3

NHCOCH 2

C N CH

CH 2

Fructose

Maltose

Maltose

Maltose

Xylose

Glucofamine

Hình 1 - Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thì tuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác nhau Bromelin có thành phần acid thay đổi trong khoảng 321 –

144 amino acid và bromelin quả là 283 – 161 amino acid

Bromelin thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine và valine và ở đầu carbon hydrate là glycine, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanine

Aminoaciad Thaân Quả xanh Quả chín

Bảng 1 - Thành phần hóa học của quả dứa

2 Cấu trúc không gian của bromelin

Murachi và busan phân tích cấu trúc bậc 1 cua bromelin và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:

Ser - Val - Lys - Asn - Gln - Asn - Pro - Cys - Gly - Ala - Cys - Tryp -

Gly Cys Lys

-Bromelin là một protease trong tâm hoạt động chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S – Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra, trong phân tử có các ion Zn2+ có lẽ vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme

3 Tính chất vật lý

Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi và cộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:

Hằng số khuếch tán D 7.77x10-7 cm2/s

32100 32500 Bảng 2 – Những tính chất vật lý của Bromelin thân

* Tính bằng phương pháp sa lắng

** Tính bằng phương pháp sa lắng và độ nhớt bên trong

*** Tính bằng phương pháp Archibald

4 Hoạt tính của bromelin

a.Hoạt tính phân giải của bromelin

Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase Bromelin thân có nhiều chất tự nhiên và có thể thuỷ phân được cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

Bảng 3 – Hoạt tính phân giải casein của Bromelin

Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo cuả bromelin

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

Bảng 4 - Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide(BBA) của bromelin

Bảng 5 - Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn bromelin quả xanh và bromelin quả chín

So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao hơn gấp 140 lần Sự khác biệt này có lẽ do cơ chế xúc tác khác nhau

b Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin

Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết

Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelin không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hoá

 Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelin có

hoạt tính khác nhau Nếu là cơ chất hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelin mạnh hơn papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelin tương tự như papain Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl – L – Arginine amide), BAEE (Benzoyl – L – Arginine ethyl ester) thì khả năng phân giải của bromelin yếu hơn papain

 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng

bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme

Ở dịch chiết quả (pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ Ở 5oC, Ph 4 -10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ Ở 55oC, pH 6.1 thì enzyme bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính

 Ảnh hưởng của độ pH: pH là hoạt tính quan trọng nhất ảnh hưởng tới hoạt

tính xúc tác của enzyme pH tối thích của bromelin không ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt

Khi thu nhận beo thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfate hoặc molypdeum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4.8 và ổ định ở pH 4.6 – 5.4 Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6.0 và pH 8.0, ổn định ở pH 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63oC Enzyme bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60 - 70% hoạt tính

 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt

tính của enzyme do chúng tường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối

Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm - SH của trung tâm phản ứng của enzyme

 Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản:

Hoạt tính (UI/protein)

Bảng 6 – Aûnh hưởng của trạng thái và điều kiện

III Phương pháp thu nhận và tinh sạch bromelin [1]

1 Phương pháp thu nhận tủa bromelin thơ

Enzyme bromelin có thể được thu nhận trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau:

Xay nhuyễn

Bã Dịch ly tâm Kết tủa Chế phẩm bromelin thơ Sấy khơ

Tinh sạch

Sản Phẩm

enzyme tinh khiết

Quả/thân/chồi dứa

Hình 2 - Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin

a Thu dịch enzyme thô

Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất sơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin

Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thì các hợp chất pectin trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết làm trở ngại cho quá trình lọc Các nhà khoa học đã tìm ra phương pháp đồng hoá nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nội bào mà không làm biến tính chúng

Theo như nghiên cứu này thì khi đồng hoá nguyên liệu ở 15Mpa độ nhớt trong dịch chiết giảm xuống, giá trị của độ brix và pH thay đổi không đáng kể, sản

lượng và hoạt tính của enzyme gia tăng Ở 15Mpa, sản lượng enzyme tăng gấp hai lần (1.27g/500ml dịch chiết từ quả dứa kể cả phần lõi) với hoạt tính cao nhất là 2.06UI/mg so với khi đồng hoá ở điều kiện bình thường và ở 20Mpa thì sản lượng enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500ml dịch chiết Vậy đồng hoá mẫu dưới áp suất cao có thể làm giảm độ nhớt của dịch chiết giúp việc sử dụng phương pháp siêu lọc thuận lợi hơn, đồng thời làm tăng sản lượng và hoạt tính của enzyme bromelin từ quả dứa và các phế phẩm của nó

b Các phương pháp thu tủa bromelin thơ

 Phương pháp kết tủa

Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa này đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch, protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương Sự kết hợp với nước tạo

ra một lớp nước xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể kết tủa được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các hoá chất

ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kép nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống

Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn có các hoá chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme Ammonium sulfate là loại muối trung tính có độ hoà tan rất tốt do đó ở dung dịch bão hoà của muối này thì tất cả protein đều tủa

Hình 3 – Các phân tử enzyme trong dung môi hữu cơ Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh Như vậy nước từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0oC đến 4oC và acetone tinh

khiết ở 20oC ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelin – ethanol cũng phải được giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh Sau khi thu được kết tủa, tủa bromelin phải được rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelin không bị biến tính

Renée Tisseau đã sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão hoà là 0.7 (70% bão hoà) để làm tác nhân kết tủa bromelin Sự kết tủa với các tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt độ thấp) là một quá trình thuận nghịch, tủa dễ dàng hoà tan bằng nước và muối có thể được loại ra khỏi protein bằng cách thẩm tích Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường Để cĩ thể thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mơ cĩ chưá enzyme bằng cách nghiền

mơ để thu dịch chiết cĩ chưá Bromelin rồi sau đĩ dung các tác nhân khác nhau để kết tuả bromelin Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng cuả chế phẩm enzyme đĩ là :

 Nồng độ cuả ammonium sulfate

 pH cuả dung dịch chiết

 Nhiệt độ kết tuả

 Thời gian tiếp xúc cuả tác nhân đệm và dịch tiết

Thơng thường nếu sử dụng phương pháp kết tuả với ammonium sulfate thì cứ 60kg nguyên liệu tươi sẽ thu được khoảng 1kg bromelin thơ

Cách làm

Tuả bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị 1lít dung dịch nước dứa sau li

tâm,cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hồ ammonium sulfate là 70%) Để yên ở nhiệt độ phịng 10-15 phút, sau đĩ ly tâm với tốc

độ 6000 vịng /phút trong 5 phút để thu nhận tuả

Tuả bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96o

(cũng đã được làm lạnh ) vào theo tỷ lệ 4 : 1(4 nước dứa,1 cồn ), trộn đều để ở 0oC trong 3 - 4giờ Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vịng/phút trong 5 phút Rồi tuả bằng acetone và thu nhận tuả

Tuả bằng acetone: Thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào

một dung dịch nước dứa sau ly tâm Để yên trong một giờ ở nhiệt độ 0 - 4oC Ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút trong 5 phút, loại bỏ tuả Thêm hai thể tích acetone lạnh vào để một giờ ở 0 - 4oC, ly tâm thu tuả và rửa tuả bằng acetone lạnh