tìm hiểu về hệ enzyme protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kế chủ yếu trong phân tử protein và peptide.. a Dựa vào nguồn thu enzyme có thể chia thành : - Protease động vật :

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁN CÔNG TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC



SEMINAR:

HỆ ENZYME PROTEASE

GVHD: NGUYỄN THỊ THU SANG

SVTH: LÊ THỊ NGỌC BÍCH

VÕ VĂN GIÀU PHAN CHÍ HIẾU TRẦN THỊ KIM YẾN

LỚP: 08SH1N

NIÊN KHÓA: 2005-2006

MỤC LỤC:

Trang

Mục lục 2

Lời mở đầu 3

Phần I: Sơ lược về enzyme protease 4

1.Giới thiệu chung về enzyme protease 5

2.Phân loại protease 5

Phần II: Các loại enzyme protease 7

A.Protease thực vật 8

I.Bromelin 8

II.Papain 12

III.Ficin 22

B.Protease động vật 28

I.Đặc điểm chung của nguồn enzyme protease từ động vật 28

1.Tính chất và phân loại 28

2.Nguồn cung cấp enzyme động vật 29

II.Một số tính chất protease từ nguồn động vật 31

1.Protease acid 31

1.1 Pepsin 31

1.2 Renin 38

2.Protease kiềm 40

2.1 Pancreatin 40

2.2 Trypsin 41

2.3 Chymotripsin 47

C.Protease vi sinh vật 51

I.Nguồn thu nhận enzyme protease 51

II.Một số loại enzyme vi sinh vật 53

1.Subtilisin 53

2.Colagenase 56

Tài liệu tham khảo 58

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của động vật, thực vật và vi sinh vật, mà nó còn đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.

Ngày nay, có rất nhiều nhóm enzyme và hydrolase là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân Trong đó quan trọng nhất là protease Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kế chủ yếu trong phân tử protein và peptide

Seminar này sẽ trình bày về các protease có ở động vật, thực vật và vi sinh vật Qua đó chúng ta sẽ biết được các tính chất và đặc điểm của các loại protease này

Trong quá trình làm seminar sẽ không tránh khỏi sai sót Rất mong cô và các bạn đóng góp ý kiến cho nhóm Xin chân thành cảm ơn.

Nhóm thực hiện.

PHẦN I

SƠ LƯỢC VỀ ENZYME THUỶ PHÂN

PROTEASE

1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE

- Chúng ta biết rằng protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong đời sống củacác sinh vật trên trái đất, nó là thành phần cấu tạo nên tế bào tham gia vào các cơ chếxúc tác sinh năng lượng ( enzyme), bảo vệ cơ thể ( kháng thể), cơ chế vận chuyển O2

v.v… Hàng ngày lượng protein được tao ra, hấp thu vào, chuyển hoá là rất lớn Nhưngkhông có bất kỳ một cơ quan hay 1 thành phần nào của cơ thể có thể tồn tại độc lậpmà không chịu sự kiểm soát của các cơ quan khác trong cơ thể Điều này nếu xảy rasẽ rất nguy hiểm Protein cũng vậy , nó không thể được tạo ra hoài mà không có cơchế phân huỷ, trong cơ thể có các cấu trúc có thể đảm nhận các chức năng phân huỷprotêin và các hợp chất của nó Cấu trúc này gọi la protease

- Protease là những enzyme có chức năng phân huỷ protein ( proteolytic) , nóthường có các tên gọi khác như proteinase, peptinase hay C – N hydrolase Enzymenày phân cắt liên kết peptide giữa các L-acid amin

2 PHÂN LOẠI PROTEASE [1,2]

Hiện nay có rất nhiều cách để phân loại protease

a) Dựa vào nguồn thu enzyme có thể chia thành :

- Protease động vật : pepsin, Tripsin, chymotripsin, ……

- Protease thực vật : papain, bromelin, ficin……

- Protease vi sinh vật: subtilisin, Protease kiềm , acid……

b) Dựa vào sự phân bố có thể chia làm 2 nhóm:

- protease nội bào: các enzyme hoạt động chủ yếu trong tế bào, trong

lyzosome, ví dụ capthesin…

- protease ngoại bào : các enzyme này hoạt dộng ở các mô, các cơ quan đặc

hiệu ngoài tế bào, ví dụ enzyme của đường tiêu hoá như pepsin, chymotripsin…

c) Tính đặc hiệu cơ chất có thể chia thành:

- endopeptidase: enzyme thuỷ phân các liên kết ở giữa mạch.Chủ yếu phân giải các

liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọnglượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton…).Nhóm các protease tiêu hóa chủyếu ở người và động vật gồm có : pepsin và rennin có trong dịch dạ dày, trypsin và

chymotrypsin của tuyến tụy và niêm mạc ruột non đều thuộc nhóm enzim này Ở thựcvật có: papain, bromelin…

- Exopeptidase: enzyme thuỷ phân các liên kết ở đầu mạch Chủ yếu phân cắt liên

kết peptide ở hai đầu mạch ví dụ : nhóm carboxypeptidase và aminopeptidase phângiải liên kết từ đầu mạch có nhóm carboxyl và amine tự do Ngoài ra còn códipeptidase phân giải dipeptide thành các aminoacid tự do

d) Dựa vào các nhóm chức trong TTHĐ:

- Protease serin: TTHĐ có nhóm OH như: tripsin, subtilopeptidase

- Protease cystein ( thiol) : TTHĐ có nhóm SH như: papain, Bromelin ………

- Protease aspartic : TTHĐ có nhóm COOH như: pepsin, renin.

- Protease kim loại : TTHĐ có các nguyên tố kim loại: cacbonxypeptidase A…

Hình 1: Một số loại Protease

e) Dựa vào độ pH hoạt động có thể chia thành :

Protease acid : pepsin, rennin,… hoạt động ở vùng pH acid

Protease kiềm : trypsin , chymotrypsin, hoạt động ở vùng pH kiềm

Protease trung tính : amylase, papain, hoạt động ở vùng pH trung tính

PHẦN II:

CÁC LOẠI ENZYME PROTEASE

A PROTEASE THỰC VẬT

I.Bromelin

1 Đặc điểm chung của Bromelin [1]

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzim thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceace đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái).

Bromelin có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều Bromelin là enzimthuỷ phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể vi sinh vật Một trong những lợi íchcủa nó được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hoá Vì nó hoạt động ở môi trườngacid trong dạ dày và cả môi trường kiềm trong ruột non Bromelin có thể thay thế đượccho những enzim tiêu hoá khác như pepsin và trypsin Bromelin có tác dụng kháng viêmrất có hiệu quả trong việc chữa trị bệnh thấp khớp, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụngbromelin như là chất giảm đau, kháng viêm và kháng sưng Hiệu quả của bromelin là làmgiảm lượng prostaglandin trong cơ thể gây ra đau viêm và sự thấm các chất dinh dưỡngqua mô bằng cách ngăn cản các tiền chất gây viêm

Bromelin hoạt động tốt ở pH từ 6-8, bromelin có hoạt tính xúc tác tương tự như papainvà ficin Nó có trọng lượng phân tử khỏang 33.000 Da, lớn gấp 1.5 lần so với papain

2 Tính chất của Bromelin [1]

Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải protein Trongdịch chiết bromelin còn có chứa một ít peroxydase, phosphatase acid và chất cản protease

2.1 Cấu tạo hóa học :

Bromelin thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác nhưpapain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2glucosamine, 1 xylose và 1 fructose Sợi hydrate carbon này liên kết hóan vị với sợipolypeptide Trong sợi hydrat carbon này dường như một nửa sợi không liên quan đến cơchế xúc tác của phân tử

Tuỳ theo thành phần aminoacid ở thân và quả và phương pháp thu nhận mà thànhphần amino acid có khác nhau Bromelin có thành phần amino acid thay đổi trong khoảng

321 -> 144 amino acid và bromelin quả là 283 ->161 amino acid

Bromelin thân là một sợi polipeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầucacbonhidrat là glycin, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanin

2.2 Cấu trúc không gian của bromelin

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc một của bromelin và nhận thấy cách sắp xếpamino acid trong phân tử bromelin như sau:

-Gly-Cys-Lys-

Bromelin là một protease trung tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu có cách sắp

OHOHCH2

OHOH

CH2OH

NHCONH3

NHCONH3

CH2-CH

CNHình 2: Cấu tạo sợi

Hydratcacbon của Bromelin

Bảng 1: Những tính chất vật lí của Bromelin thân

*: tính bằng phương pháp sa lắng- khuếch tán

**: Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong

***: Tính bằng phương pháp Archibald

2.4 Hoạt tính phân giải của Bromelin

Bromelin có 3 họat tính khác nhau : peptidase , amidase và esterase Bromelin thân cónhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp

Bảng 2:Khả năng phân giải casein của Bromelin:

Cơ chất Bromelin thânHoạt tính phân giải casein(UI/mg)Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân và quả chín

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelin

Giống như các chất xúc tác sinh học khác bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:nồng độ cơ chấ, pH, nhiệt độ, ion kim loại, 1 số nhóm chức, phương pháp ly trích …… Cácyếu tố như thiệt độ , pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelinkhông ổn định và phụ thuộc vào các yêu tố khác như bản chất cơ chất , nồng độ cơ chất ,nồng độ enzym thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hoá…

Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những lọai cơ chất khác nhau, bromelin có hoạttính khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelin mạnh hơnpapain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì họat tính của bromelin tương tự như papain Đối với

cơ chất tổng hợp BAA thì khả năng thủy giải của bromelin yếu hơn papain

Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởinhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởngđến hoạt tính của enzim, nồng độ enzim, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzim

Aûnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạttính xúc tác của enzim pH tối thích của bromelin không ổn định mà tùy thuộc vào nhiệtđộ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzim, bản chất củadung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt tính

Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfate hoặcmolypdenum carbonate thì enzim có hoạt tính cao nhất ở pH 4.8 và ổn định ở pH 4.6-5.4.Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có họat tính cao nhất ở pH 6.0 và 8.0 , ổn định

ở pH 3.5-5.6 với nhiệt độ 63oC Enzim Bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60-70% họat tính.Bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thiểu của enzim là 5-8 tùy thuộc vào cơchất

Aûnh hưởng bởi các ion kim lọai: các ion kim lọai có ảnh hưởng lớnđến hoạt tính enzim do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzim Muốithủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến họat tính của enzim bromelin và mức độ kìm hãmthay đổi theo nồng độ của muối

Ngòai ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm

SH của trung tâm phản ứng của enzim

II PAPAIN

Hinh 3: Hình thể chuỗi peptide của papain

1 Đặc điểm chung [1]

Papain thuộc nhóm enzim thủy phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiềunhất vè tính chất và cơ chế họat động Papain là một sulfhydryl protease, đầu tiên đượctách ra bởi Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khô

Papain mang mã số 3.4.4.10, có họat tính xúc tác tương tự như bromelin(trong dứa) vàficin(trong cây sung)

Chế phẩm enzim thương mại là hỗn hợp gồm hai enzim khác nhau được gọi là papainpeptiase 1 và papain peptidase 2( chymopapain)

Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất Nhựa là hỗn hợp enzim chứacác protease sau: papain, chymopapain A, chymopapain B, protenase III, protease IV,thyolprotease Trong đó papain là protease có hàm lượng cao nhất đến 95%, và là enzimcó ý nghĩa quan trọng nhất Các tính chất vật lý của papain gần giống với chymopapainnhưng papain có hoạt tính mạnh hơn

2 Tính chất [1,2,5,6]

2.1 Tính chất vật lý:

Bảng 4: Tính chất vật lí của papain

Hằng số phân tán D20 (10-7sec.cm2) 10,27 ±0,13

Độ triền quang {∀ }D -66,70

Thể tích riêng phần V (ml/g) 0,724

Botä màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy không tan trong

hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine Bền

nhiệt

2.2.Tính chất hóa học:

a) Cấu tạo hóa học: papain là một endoprotease có chứa 16.1% nitơ và 1.2% lưu

huỳnh Papain là một protease thyol, theo nghiên cứu của R L Hill và E.L Smith,Papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amyno acid, trọng lượng phân tử là 20.900dalton

Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 amynoacid trong đó không chứa methyonine Phân tử lượng là 23.350 dalton Phân tử là mộtmạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạothành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95,153-200, không có chức năng sinh học,chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm SH ở vị trí 25

Thành phần chính của protein chưa hoạt hoá là hỗn hợp protein disulfurcystein Khihoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của enzyme và

alanine thiocyanat

−

β do sự tương tác giữa cyanur và cystein Sau đó

alanine thiocyanat

−

β khép vòng tạo thành α −i min otiazolidi n Khi có oxy không khí ,

cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại nghĩa là cystein kết hợp với nhómsulfurhydride của papain hoạt hoá tạo thành sản phẩm không hoạt hóa Quá trình hoạthoá không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó

Hình 4: Quá trình họat hĩa papain

b) Cấu trúc không gian: Phân tử papin có dạng cầu với kích thước : 36 x 48x

36Ao, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động

nằm taị bề mặt của khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái

khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn alpha chiếm 20% toàn bộ các

amino acid có trong phân tử

Phân tử papain có hai nhân kị nuớc, mỗi nhân nằm ở một phần của papain Điểm

đáng chú ý là cả 2 nhân đều bắt đầu bởi một chuỗi xoắn alpha Ơû phía trái có 3 đoạn

xoắn alpha, gồm các đoạn 24-43, 69-78, 50-58 vùng trung tâm ( nhân ki nước) gồm

các nhóm val 31, Ileucin 34, eucine 583, Valine 75 và Ile 80 còn ở phía phải có đoạn

xoắn 116-126 và một đoạn xoắn ngắn 138-143, trung tâm kị nước gồm có các nhóm

Leu 121, Ile 125, Val 130, Phe 141

Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử được tạo thành bởi các

nhóm guadynine cuả gốc arginine và nhóm cacboxyl của Asp hoặc Glu hay nhóm

amide của Asp hoặc Glu

NH3

CH2–CH

COO NH3

N

C S

CH2

CH NH

COO

Ví dụ liên kết hydrozen được hình thành giữa Arg 8 và Asp 6.

c)

Cấu trúc tâm hoạt động của papain:

Hình 5: Cấu tạo tâm hoạt động của papain

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175bởi liên kết hydrogen

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là Asp- Glu- Gly- Ser-Cys- Gly-Ser-Cys

Lys-Theo nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide vùng trung tâm hoạt động củapapain gần giống như ficin và trypsin, mặc dù chúng từ những nguồn gốc khác nhau

d) Hoạt tính enzim và cơ chế tác dụng

Hình 6: Cơ chế tác dụng của papain [4]

Hình 7: Cơ chế xúc tác của các cystein proteinase

Papain thuỷ phân protein thành các polypeptide và các amino acid, nó đóng vai tròvừa như endopeptidase vừa như exopeptidase:

Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide:

Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng thủy phân hầu hết cácliên kết peptide trừ các kiên kết với proline và với các glutamic acid có nhómcacboxyl tự do

Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn tùy thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là

cơ chất có bị biến tính hay không Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủyphân sâu hơn Giống các protease serin khác như chymotrypsin hay trypsin, papain cókhả năng xúc tác phản ứng thuỷ phân các dẫn xuất acyl

Phản ứng đựơc tiến hành như sau:

(1) RCOX + pap-SH pap–S–C–R + HX

O

(2) pap–S–C–R + H2O pap–SH + R–COOH

O

Phản ứng này được chứng minh theo nhiều cách khác nhau bởi Lowe và Williams

1965, Krisk và Igelstrom 1966, Brubacher và Bender 1966

Tính ái nhân của phân tử sulfur và nhóm SH mạnh hơn oxygen và được tăng lênnhiều nhờ hệ thống histidine-asparagine mặc dù ảnh hưởng của nó không rộng như hệthống histidine- asparagine trong cơ chế enzym chymotrypsin Nhờ đó mà nó thúc đẩy

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-) +(HOH) (-NH-CH-COOH) + (HN-CH-CO-)

phản ứng thuỷ phân xảy ra dễ dàng hơn do carbon của cơ chất có khuynh hướng phảnứng với những nguyên tử có tính ái nhân:

Hình8 : sự xắp xếp tương ứng của enzyme và chuỗi gồm 7 gốc amino acid của cơ chất

Các gốc amino acid được nhận biết nằm ở trên và dưới điểm thủy phân được kí hiệubằng chữ Pi và Pi' còn Si và Si’…(i=1,2,3,4) là các vùng tương ứng trên phân tử enzim,

do đó các peptide kiểu như X-Phe-Y-Z ( X,Y,Z là các gốc amino acid) thì sẽ được cắttại vị trí giữa Y và Z

Các peptide có kiểu như X-Phe-Y (ví dụ như: Ala-Ala-Phe-Ala) có cácphenylalanine nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng thì không được thuỷ phân bởipapain Không những thế, các peptide này còn có tác dụng như chất kìm hãm cạnhtranh của papain

Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiol esterase và transferase

Để thu được hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cystein và EDTA,trong đó cystein đóng vai trò hoạt hóa papain còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạophức với ion kim loại năng có trong nhựa đu đủ

Cơ chế hoạt hóa:

toàn hoạt tính Trong trường hợp này chúng tác dụng lên nhóm sulfhydryl của enzimthay vì lên nhóm imidazol của histidine như trường hợp của trypsin và chymotripsin.Các tác nhân aldehyde như phenyl hydrazin, hydroxylamine,…cũng ức chế papain.Cacboxyl-L-glutamic acid ức chế không cạnh ở pH=3.9-4.5

Nhiều chất ức chế papain chứa phenilamine ở vị trí nhóm thế thứ hai kể từ đầumạch Clà chất ức chế cạnh tranh mạnh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạtđộng

Điều đáng chú ý là papain rất bền với các tác nhân gây biến tính như dung môihữu cơ hay được dùng trong hóa học protein( độ quay cực mạnh của papain hầu nhưkhông biến đổi trong ethanol 70% hay ure 6-8M/l)

g) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:

Nhiệt độ:Papain là enzim chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khôpapain không bị biến tính trong 3h ở 100oC Còn ở dạng dung dịch papain mất hoạt tínhsau 30 phút ở 82.5oCvà nếu tăng nhiệt độ cao hơn 100oC thì nó sẽ bị mất hoàn toànhoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch Điều này là do khi ởdạng dung dịch ta tăng lên đến nhiệt độ hơn 100oC thì cấu trúc tâm hoạt động củaenzim bị phá hủy hoàn toàn

Đáng chú ý là khi được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệtđộ thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, bởi lẽ trong mủ nhựa còn chứa các protein kháccó tác dụng bảo vệ nó

Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng.Trong dung dịch dẫnsuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng trong khi enzimmất hoạt tính của nó mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hóa

Khi thủy phân các protein khác nhau thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứngthích hợp cho papain cũng khác nhau Đối với cơ chất casein, topt là 37oC Papain dạngổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạttính vẫn duy trì được 90%

pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ biếntính trong môi trường acid có pH<4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH>12

Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ kháchau Chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5, với albumin ở 4.5-7.1và với galetin 5.2-6 và 6.4 Điểm đẳng điện pI là 9.

Papain dạng ổn định tức là đạng mà cấu trúc không gian của enzim được ổn định, cóthể chịu được các pH =1.5 và pH=8.5 trong 90 phút

Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% vàcũng không thay đổi độ nhớt trong methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxidechứa 20% dung môi hữu cơ và ure 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấuhình của papain Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain

Chất hoạt hóa: Papain thường được hoạt hóa bởi các chất khử như: cystein,glutation, acid tioglycolic, natri tiosulfat, bohydrat natri…Chất hoạt hóa phổ biến nhất làcyanua Nói chung papain bị kiềm hãm mạnh mẽ bởi các thuốc thử của tiol nhưng lại đượchoạt hó đặc biệt bởi 2-mercaptoetanol

Chất kiềm hãm: Papain bị kiềm hãm bởi các chất oxi hóa như: oxi, ozon,hydroperoxyt, iod acetate, iod axetamit, thủy ngân clobenzoat, cystein và các hợp chấtdisulfua khác Đặc biệt papain rất dẽ bị mất hoạt tính khi có mặt hydro peroxyt

Điều đáng chú ý là papain rất bền đối với các tác nhân biến tính như dung môi hữu cơ vốnhay được dùng trong hóa học protein

III FICIN

1 Đặc điểm chung [1]

Ficin là một protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc họ Ficus(sung, vải),

Người ta thấy rằng hoạt tính của enzim ficin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sángsớm do đó nhựa sung thường được thu nhận vào buổi sáng sớm, sấy khô thường đượcdùng trong công nghiệp thực phẩm

2 Tính chất của Ficin [1]

2.1 Cấu tạo hóa học

Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc một có chứa sulfhydry Trìnhtự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin Trình

tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng của ficin như sau:

Pro-Leu-Arg-Gln-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys-Tryp-Tùy theo nguồn thu nhận enzim ficin từ các loại sung khác nhau, tiến trình xác địnhkhác nhau mà thành phần hóa học của enzim ficin sẽ khác nhau

Bảng 5: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin

STT AMINO ACID TÊN TÁC GIẢ NGHIÊN CỨU

Marini bettolo Metrione Gould Englund

Tổng số gốc amonoacid * 206 211 300 243

* số lượng các gốc aminoacid trên 1 mol protein

a. Tính chất vật lí:

Tùy theo nguồn thu nhận enzim mà các tính chất vật lí của chúng không giống nhau.Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn lắm Một số tính chất vật lí của ficin có thểđược trình bày như sau:

Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000

Nhiệt độ hoạt động: 30-80o Nhiệt độ tối hảo cho hoạt tính xúc tác:50-65oC

Hệ số sa lắng:2.5-2.7S

Điểm đẳng điện:9-10

Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước vàglycerine

Tính chất vật lý của ficin ở các nguồn thu nhận khác nhau được trình bày ở bảng sau

Bảng 6: Tính chất vật lí của ficin

Nguồn thu

nhận

Phương pháp tinh sạch

Hệ số

sa lắng (S 0 )

Trọng lượng phân tử

Điểm đẳng điện

Hệ số tinh sạch

A 280 , A 260

Hệ số tắt

Bước sóng hấp thuλ0

và Gulfreund Liener

Whitaker

bettolo

b. Tính chất hóa học

pH hoạt động của ficin rộng:4-9.5(dịch nhựa sung có pH 5), pH tối thích của ficin phụthuộc vào loại cơ chất của enzim: gelatin: pHopt=5, casein: pHopt=9.5, hemoglobin:

pHopt=7

Ở dạng nhựa tươi, ficin dẽ bị oxi hóa bởi không khí làm cho dịch nhựa chuyển sangmàu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị gỉam xuống

c Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ficin

- Các yếu tố hoạt hóa:

- Khi có mặt của kim loại kiềm, hoạt tính thủy gỉai của protein của ficin tăng lên Hoạttính của ficin cũng sẽ tăng lên khi nó kết hợp với một trong số các nhân tố khử như:cyanide, cystein, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoethanol

- cystein hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0,005-0,05M có thể làm tăng hoạt tínhcủa ficin ở dạng tinh thể và HCN 0,075M làm tăng hoạt tính của ficin cao nhất so vớicác tác nhân hóa học khác Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn nữa khi phốihợp giữa HCN với cystein( cao hơn nữa khi sử dụng HCN riêng lẽ)

- Các yếu tố kìm hãm:

Cũng như các loại enzim thủy gỉai khác , nhóm SH tham gia trực tiếp vào các hoạtđộng của enzim ficin Khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalenine, iod acetic acid,chloroacetamide hay iodacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzimsẽ bị bất hoạt

Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật khi liên kết với gốc cysteincủa enzim ficin cũng có thểâ bất hoạt ficin như: những dẫn xuất chloromethyl ceton củaN-tosyl-L-phenylalanine và N-tosyl-L-Lysine, 1,3-dibrommoacetone cũng gây ra sựbất hoạt ficin Trong lòng trắng trứng có một loại protein có khả năng kìm hãm hoạtđộng của ficin Người ta cho rằng khi protein này kết hợp với ficin sẽ tạo ra một chấtcó hoạt tính kìm hãm enzim

- Tính chuyên biệt:

Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin,protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả Ascaris sống đều cóthể bị thủy giải bởi enzim ficin Ficin còn có thể thủy gỉai các liên kết peptide, ester, cácliên kết amide của cơ chất nhân tạo

o Bền vững với pH:Trong một vùng pH khá rộng(4.5-9.5) độ bềnvững của enzim ficin đạt đến mức cực đạinhưng trong một vùng pH hẹp daođộng quanh pH=8 thì nó lại có tính bền vững ở mức độ tối thiểu Nguyên nhânlà do một nhóm SH tối cần thiếtbị oxi hóa Tuy nhiên, sự suy giảm tính bềnvững ờ pH sẽ mất đi khi gia tăng nồng độ cystein từ 0,01-0,25M Ficin có độbền vững cực đại ở pH 7.5 và pHopt trung bìng ở khoảng 6-7.5

o Khi hòa tan các kết tủa enzimvào trong nước hay trong các dungdịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzim Do đó, để tránh hiệntượng này người ta thường hòa tan kết tủa enzim vào trong dung dịch đêmphosphate 0.01M, pH7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzim lên các nhân tố mangnhư blue acid 83, Redacid 17, …để làm tăng tính bền vững của enzim

o Cơ chế xúc tác của enzyme: các loại enzyme protease thu dượctừ đu đủ , sung , vả , dứa có tên gọi là Thiol-proteae, cystein-protease haysulfhydrul-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 600 -> 800 ở pH tựnhiên Tâm hoạt động của các enzyme này gồm có 2 amino acid là cystein vàhistidine

Cơ chế thuỷ giải protein xảy ra qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn “acyl hoá”

Giai đoạn 2: giai đoạn “deacyl hoá “có sự tham gia của phân tử nước

e.Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein của ficin

- Nhiệt độ: hoạt động thủy gỉai protein của enzim ficin chịu ảnh hưởng rất nhiềubởi nhiệt độ Trong khoảng nhiệt độ khọng làm biến tính enzim, tốc độ phản ứng củaenzim tỉ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ và nhiệt độ

Mỗi enzim có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác của nó, tại đó tốcđộ phản ứng của enzim đạt đến tối đa Điểm nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tối thích cho hoạtđộng của enzim

- Độ pH: pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của enzim.Mỗi enzim có một trị số pH thích hợp cho hoạt động của enzim gọi là pH tối thích, tạiùđó tốc độ phản ứng của enzim đạt đến mức cực đại

Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzim do:

 Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzim

 Tác động vào trạng thái ion hóa của cơ chất

 Tác dụng vào độ bền của phân tử enzim

 Tác dụng vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tửenzim…

B PROTEASE ĐỘNG VẬT

Enzym là nhóm protein lớn nhất và quan trọng nhất Enzim là những chất xúc táchữu cơ có tính đặc hiệu cao nhờ cấu trúc không gian ba chiều của các đại phân tử sinh học

Enzim từ nguồn động vật được loài người hiểu biết và sử dụng trong chế biến sữatừ lâu

I ĐẶC ĐIỂM CHUNG NGUỒN ENZYM PROTEASE TỪ ĐỘNG VẬT: [1]

1.Tính chất và phân loại:

- Hydrolase là nhóm enzim xúc tác sự thủy phân

Ví dụ: amylase, lipase, protease… trong đó quan trọng nhất là protease.

- Protease là nhóm enzim xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếutrong phân tử protein và peptide Cơ chế thủy phân như sau :

Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và cóthể chuyển thành dạng hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắtđứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó , khi đó sẽ làm thay đổi cấutrúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác , enzim chuyển sang trạng tháihoạt động

Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chấtdưới tác dụng của các protease

Bảng 7: Một vài enzim quan trọng trong công nghiệp và nguồn thu nhận chúng

Enzym động vật Nguồn thu nhận Enzym nội/

ngoại bào

nghiệp ứng dụng

2.Nguồn cung cấp enzym động vật:

Các enzym thu từ động vật : rennet , pepsin , catalase gan bò , lipase , trypsin vàlysozyme động vật

 Đặc điểm một số enzym trong quá trình tiêu hoá của động vật:

- Rennin : vai trò của rennin là chuyển hoá sữa trong dạ dày bởi sự thay đổi sữa từ

dạng dung dịch sang dạng khối (gel) Hoạt động enzym tăng cao trong khoảng giữathai bò tháng thứ 9 và 3-4 ngày tuổi của bê đang bú