Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô hiện đang trở thành xu hướng của ngành nông nghiệp. Các giống cây trồng từ nuôi cấy mô có nhiều ưu điểm vượt trội: Năng suất cao, khả năng kháng bệnh tốt, sinh trưởng phát triển nhanh
Trang 1I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Khoai lang (Ipomoea batatas L) là một loài cây lương thực với các rễ củ lớn,
chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, củ khoai lang là nguồn cung cấp rau ăn củ quan trọng Nó đóng vai trò cả rau và lương thực Khoai lang được trồng và phân bố rất nhiều nơi trên thế giới như Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ Latinh
Việt Nam là một nước nông nghiệp, nói đến nông thôn Việt Nam không thể không nói đến cây khoai lang Ở Việt Nam, khoai lang là cây lương thực truyền thống đứng thứ
ba sau lúa, ngô và đứng thứ hai về giá trị kinh tế sau khoai tây Khoai lang là cây trồng có tiềm năng năng suất sinh học cao với thời gian sinh trưởng ngắn, có khả năng thích ứng rộng, được trồng ở khắp mọi nơi trên cả nước từ Đồng bằng đến miền núi và Duyên hải miền trung… Khoai lang còn có thể trồng được ở nhiều vùng sinh thái và chân đất khác nhau
Trong số các cây lương thực, cây có củ giữ một vai trò quan trọng trong sản xuất lương thực ở những nước nghèo, chậm và đang phát triển (Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc, 2004) [1] Đặc biệt, trong những năm mất mùa, hạn hán hay ở những vùng sản xuất khó khăn, khoai lang là cây chủ lực giải quyết lương thực và thức ăn gia súc Tại một số vùng sinh thái có điều kiện đặc biệt, vùng sản xuất lúa khó khăn, vùng đất bạc màu, đất cát ven biển… cây khoai lang được xếp ngang hàng thậm chí còn cao hơn cả lúa và có thể nói cây khoai lang là cây chủ lực Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc năm 2010 trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm lương thực, 13% làm thức ăn gia súc, 6% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau như luộc
để ăn sáng, làm mứt, làm bánh kẹo, nước giải khát, rượu, làm thuốc, dùng thay thế cho bột mì để làm bánh bích quy, phần loại bỏ đi rất ít chiếm 3% (Cúc Phương, 2005) [2] Phần thân, lá, ngọn được sử dụng làm rau xanh cho con người đồng thời là nguồn thức
ăn tốt cho gia súc (FAO, Horton, 1988) [3]
Khoai lang trồng bằng dây, rất ít sâu bệnh nên chi phí đầu tư trên một đơn vị diện tích là rất thấp Mặt khác, khoai lang có tiềm năng cho năng suất cao, thân lá khoai lang phát triển nhanh, mạnh nên có khả năng lấn át cỏ dại rất tốt Ngày nay, khi nền công nghiệp chế biến ra đời và không ngừng phát triển, con người đã nghiên cứu và tìm thấy ở khoai lang những đặc tính hữu hiệu cũng như khả năng thu lợi nhuận cao từ nó thì việc trồng khoai lang không còn đơn giản như trước Để có được một cánh đồng khoai lang
Trang 2hữu hiệu và mang lại hiệu quả kinh tế cao cần phải áp dụng liên hoàn các biện pháp kỹ thuật trồng trọt, trong đó công tác giống là hết sức quan trọng
Những năm qua, do việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng nên diện tích khoai lang ở nhiều vùng bị thu hẹp lại Tuy nhiên, ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng, không chủ động tưới, cây khoai lang vẫn chiếm một diện tích khá lớn Vùng Bắc Trung Bộ gồm sáu tỉnh: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Đây là một trong bảy vùng kinh tế của đất nước có địa hình, khí hậu, đất đai phong phú gồm các tiểu vùng sinh thái khác nhau thích hợp cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi Dân số Bắc Trung Bộ có khoảng hơn 10 triệu người chiếm 13% dân số của cả nước, trong đó khoảng
5 triệu người trong độ tuổi lao động Tuy nhiên, đến nay Bắc Trung Bộ vẫn là vùng kinh
tế còn gặp nhiều khó khăn Vùng Bắc Trung Bộ dẫn đầu tám vùng trên cả nước về diện tích và sản lượng khoai lang Giống khoai lang phổ biến hiện nay ở Bắc Trung Bộ là Chiêm Dâu, Hoàng Long, Sộp… năng suất thấp khoảng 60 – 70 tạ/ha, nhiều giống khác
có diện tích nhỏ, chủ yếu để giải quyết thức ăn chăn nuôi theo hình thức tự cung tự cấp Năng suất khoai lang thấp có nhiều nguyên nhân, nhưng chủ yếu là do chưa có giống tốt phù hợp cho từng vùng sinh thái và cơ cấu mùa vụ của từng địa phương, các biện pháp thâm canh chưa được chú trọng đúng mức Trong sản xuất còn ít phát triển các giống mới cho từng vùng trồng thích hợp, chưa đẩy năng suất trung bình lên được bao nhiêu như những cây có củ khác
Trong vài năm gần đây, nhu cầu tiêu dùng khoai lang chất lượng cao tăng ở các nước khu vực Châu Á Nắm bắt thị trường, một số nông dân ở các tỉnh Lâm Đồng, Tiền Giang, Đắc Nông, Vĩnh Long… đã sản xuất khoai lang Nhật ruột đỏ bán tươi ngay tại ruộng, giá 5000 – 7000 đồng/kg, năng suất bình quân 25 tấn/ha đem lại thu nhập cao cho nông dân [4] Ở Nghệ An cũng đã sản xuất giống khoai lang này nhưng diện tích trồng chưa lớn, chủ yếu đang mua củ từ các nơi khác về bán do gặp khó khăn trong bảo quản
và chế biến sản phẩm Thực tế sản xuất cho thấy, sau vài vụ trồng bằng dây giống của vụ trước và trồng nhiều vụ trên một chân đất nên năng suất đã giảm rõ rệt Để cải thiện chất lượng giống nông dân phải mua giống gốc để trồng, rất thụ động và tốn kém [5] Nếu cải tiến giống khoai lang theo phương pháp truyền thống bằng cách gơ củ giống cũng phải mất đến hai năm mới khôi phục gần như hoàn toàn đặc tính của giống gốc
Vì vậy, để cây khoai lang thực sự có vị trí xứng đáng trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta thì định hướng đẩy mạnh công tác chọn tạo, bình tuyển các giống khoai lang
Trang 3ngắn ngày có năng suất cao, phẩm chất củ ngon để sử dụng làm lương thực, thực phẩm
và các giống có sinh khối cao để phục vụ chăn nuôi, mở rộng diện tích trồng tập trung tại các vùng sản xuất nông nghiệp gắn với chế biến, đẩy mạnh công nghệ chế biến các sản phẩm từ khoai lang đang được các nhà nghiên cứu quan tâm và là yêu cầu cấp thiết của sản xuất
Xuất phát từ thực tiễn sản xuất nhằm cải tiến sự thoái hóa giống nhanh chóng ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây khoai lang, đồng thời đưa ra những nghiên cứu ban
đầu phục vụ cho các công tác giống sau này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống khoai lang tím (Ipomoea batatas L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro”.
II MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
2.1 Mục tiêu của đề tài
Hoàn thiện quy trình nhân giống khoai lang tím Nhật nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô invitro, góp phần khắc phục tình trạng thoái hóa giống, cung cấp một lượng giống sạch bệnh cho sản xuất, làm cơ sở cho các nghiên cứu liên quan về cây khoai lang
2.2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
2.2.1 Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một quy trình nhân giống cây khoai lang Nhật bằng phương pháp in vitro Đánh giá được tác động của một số chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống khoai lang
- Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất giống khoai lang Nhật
2.2.2 Ý nghĩa thực tiễn
Sản xuất được cây con sinh trưởng, phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất Thuận lợi cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật trong giai đoạn sản xuất khoai lang thương phẩm, từ đó kích thích sản xuất cây khoai lang Nhật phát triển
Trang 4III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1 Xác định ảnh hưởng của hóa chất khử trùng HgCl2, H2O2 và thời gian khử trùng thích hợp đến mẫu nuôi cấy
3.2 Xác định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng GA3 và nước dừa đến khả năng tái sinh chồi cây khoai lang
3.3 Xác định ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng Kinetine, IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây khoai lang
3.4 Xác định ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α - NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây khoai lang
3.5 Xác định ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây con sau nuôi cấy mô ex invitro
IV VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1 Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng và các đoạn thân mang chồi nách lấy từ dây khoai lang mập, khỏe, không bị sâu bệnh
4.2 Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là giống khoai lang tím (Ipomoea batatas L.) được Viện
Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam nhập nội từ Nhật Bản năm 2004 Đây là giống khoai lang đang được người dân ưa chuộng về giá trị thương phẩm và giá trị kinh tế
4.3 Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:
Trang 5• Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu
- Chọn mẫu: Cây giống được trồng trên cát vô trùng Chọn những cây có thân khỏe mạnh, không sâu bệnh, có nhiều chồi bên Cắt thành những đoạn thân dài 2 – 3cm (gồm cả chồi nách)
- Xử lý mẫu: Rửa sạch mẫu cấy bằng xà phòng dưới vòi nước chảy 3 lần tong 10 –
15 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng Lắc cồn 70o trong 1 phút Sau đó khử trùng bằng hóa chất khử trùng
- Hóa chất khử trùng: oxy già H2O2, thủy ngân clorua HgCl2
- Các công thức thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu
- Thời gian:
- Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh
- Các thí nghiệm tiến hành:
Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng của chất khử trùng oxy già và thời gian đến tỷ
lệ sống của mẫu cấy
CT1.1: Không xử lý
Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu
Mẫu: đỉnh sinh trưởng, các chồi
nách
Thí nghiệm: TN1, TN 2
Giai đoạn tái sinh chồi Mẫu: lát cắt mẫu sạch bệnh Thí nghiệm: TN3, TN 4
Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi
Mẫu: chồi invitro Thí nghiệm: TN5, TN6
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
(giai đoạn ra rễ) Mẫu: chồi invitro Thí nghiệm: TN7, TN8
Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Mẫu: cây con invitro
Thí nghiệm: TN9
Cây khoai lang tím Nhật
Trang 6CT1.2: 10% H2O2 + 10 phút CT1.3: 10% H2O2 + 20 phút CT1.4: 10% H2O2 + 30 phút CT1.5: 10% H2O2 + 40 phút
Thí nghiệm 2: Xác định ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 và thời gian đến tỷ
lệ sống của mẫu cấy
CT2.1: Không xử lý
CT2.2: 0,1% HgCl2 + 5 phút
CT2.3: 0,1% HgCl2 + 10 phút CT2.4: 0,1% HgCl2 + 15 phút CT2.5: 0,1% HgCl2 + 20 phút
- Các chỉ tiêu theo dõi:
∑ mẫu nhiễm
+ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100
∑ mẫu nuôi cấy ∑ mẫu chết
+ Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100
∑ mẫu nuôi cấy
∑ mẫu sống sạch bệnh
+ Tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh (%) = x 100
∑ mẫu nuôi cấy
• Giai đoạn tái sinh chồi
- Mẫu: các mẫu sạch bệnh từ TN1, TN2
- Môi trường: Các mẫu sạch bệnh được cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi là môi trường MS bổ sung Saccarose 3%, Agar 0,8%, pH = 5,7 Các chất điều tiết sinh trưởng là GA3 (Gibberellic acid) và nước dừa
- Thời gian:
- Các công thức thí nghiệm tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu, mỗi công thức lặp lại 3 lần
Trang 7- Các thí nghiệm tiến hành:
Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi
CT3.1: MT nền + 0 mg/l GA3
CT3.2: MT nền + 0,5 mg/l GA3 CT3.3: MT nền + 1,0 mg/l GA3 CT3.4: MT nền + 1,5 mg/l GA3 CT3.5: MT nền + 2,0 mg/l GA3
Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của nước dừa đến sự sinh trưởng và hệ số
nhân chồi khoai lang
CT4.1: MT nền + 0 % ND
CT4.2: MT nền + 50 % ND
CT4.3: MT nền + 100 % ND CT4.4: MT nền + 150 % ND CT4.5: MT nền + 200 % ND
- Các chỉ tiêu theo dõi:
∑ số mẫu bật chồi
+ Tỷ lệ bật chồi (%) = x 100
∑ số mẫu đưa vào
∑ số lượng chồi bật
+ Hệ số nhân chồi = x 100
∑ số mẫu bật chồi
• Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi
- Mẫu: các chồi sinh trưởng bình thường, có đủ thân và lá, không bị dị dạng
- Môi trường: MS, bổ sung Saccarose 3%, Agar 0,8%, pH = 5,7 và nồng độ GA3 tối ưu khảo sát ở thí nghiệm 3 và bổ sung Kinetine, IAA (Indol acetic acid)
- Các công thức thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, được tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 1 chồi
- Các chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi, chiều dài chồi, số lá/chồi, chất lượng chồi
- Các thí nghiệm tiến hành:
Trang 8Thí nghiệm 5: Xác định ảnh hưởng của Kinetine đến sự sinh trưởng và hệ số nhân
chồi khoai lang
CT5.1: MT nền + 0 mg/l Kinetine CT5.2: MT nền + 2 mg/l Kinetine CT5.3: MT nền + 4 mg/l Kinetine CT5.4: MT nền + 6 mg/l Kinetine CT5.5: MT nền + 8 mg/l Kinetine
Thí nghiệm 6: Xác định ảnh hưởng của IAA đến sự sinh trưởng và hệ số nhân
chồi khoai lang
CT6.1: MT nền + 0,0 mg/l IAA CT6.2: MT nền + 0,5 mg/l IAA CT6.3: MT nền + 1,0 mg/l IAA CT6.4: MT nền + 1,5 mg/l IAA CT6.5: MT nền + 2,0 mg/l IAA
- Các chỉ tiêu theo dõi:
∑ số chồi bật
+ Hệ số nhân chồi (%) = x 100
∑ số chồi cấy
+ Chiều dài chồi (cm)
+ Số lá/chồi (lá/chồi)
+ Chất lượng chồi: Chồi tốt: chồi mập, lá xanh thẫm
Chồi khá: chồi bình thường, lá xanh
Chồi trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh
Chồi kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt, hoặc chồi bị dị dạng
• Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (giai đoạn ra rễ)
Thí nghiệm 7: Xác định ảnh hưởng của nồng độ α - NAA (α-Naphlene acetic acid) đến hiệu quả ra rễ của cây khoai lang invitro
Trang 9- Mẫu nuôi cấy: Chồi cây khoai lang khỏe mạnh có từ 3 - 5 lá thu được từ quá trình nhân nhanh
- Môi trường nền (MT nền): MS (Murashige&Skoog, 1962) bổ sung 3% saccarose, 0,8% agar, pH = 5,7 Chất điều tiết sinh trưởng sử dụng là α - NAA và than hoạt tính
- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 3 cây
- Các công thức thí nghiệm:
CT7.1: MT nền + 0,0 mg α - NAA/l CT7.2: MT nền + 0,3 mg α - NAA/l CT7.3: MT nền + 0,5 mg α - NAA/l CT7.4: MT nền + 0,7 mg α - NAA/l CT7.5: MT nền + 1,0 mg α - NAA/l
Thí nghiệm 8: Xác định ảnh hưởng của than hoạt tính đến hiệu quả ra rễ của cây
khoai lang invtro
- Môi trường: MS + Saccarose 3% + Agar 0,8% + pH = 5,7 và bổ sung than hoạt tính
CT8.1: MT nền + 0,0 g/l than hoạt tính CT8.2: MT nền + 0,5 g/l than hoạt tính CT8.3: MT nền + 1,0 g/l than hoạt tính CT8.4: MT nền + 1,5 g/l than hoạt tính CT8.5: MT nền + 2,0 g/l than hoạt tính
- Các chỉ tiêu theo dõi:
∑ số chồi bật rễ (chồi)
+ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100
∑ số chồi cấy (chồi)
∑ số rễ ra
+ Số rễ trung bình/cây (rễ) =
∑ số cây tạo thành
+ Chiều dài rễ/cây (cm): tính từ cổ rễ đến chóp rễ
+ Số lá trung bình/cây (lá)
Trang 10+ Chiều cao cây (cm)
• Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Thí nghiệm 9: Xác định ảnh hưởng của loại giá thể đến sức sống của cây ex invitro trong điều kiện huấn luyện thích nghi
- Vật liệu: cây khoai lang con sau nuôi cấy mô
- Phương pháp ra cây: trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, người ta thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài Thời gian này có thể kéo dài khoảng 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây Cây con trong bình cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bám vào vì chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công Tiếp đó ngâm cây vào nước để tránh hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giá thể
- Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: trong thời gian cây ở trong giá thể, ngày tiến hành tưới phun 2 lần bằng nước sạch (giữ ẩm độ giá thể khoảng 75 - 85%), nguồn khoáng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng Knop phun lên lá
- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 60 mẫu/CT
- Các công thức của thí nghiệm:
CT 9.1: Cát
CT 9.2: Trấu hun
CT 9.3: 1 cát + 1 trấu hun
- Các chỉ tiêu theo dõi: theo dõi 10 ngày/lần
∑ số cây sống (cây)
+ Tỷ lệ cây sống (%) = x 100
∑ số cây ra ngôi (cây)
+ Biến động chiều cao cây = Chiều cao về sau – Chiều cao ban đầu
+ Biến động số lá/cây = Số lá về sau – Số lá ban đầu
4.4 Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý, đánh giá bằng các phần mềm sinh học (IRRISTAT, SPSS, Excel)
V ĐỊA ĐIỂM TRIỂN KHAI VÀ TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN
5.1 Địa điểm triển khai