PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM PYRETHROID TRONG RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

NGUYỄN THỊ THƠM PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM PYRETHROID TRONG RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014... NGUYỄN THỊ THƠM PHÂN TÍ

NGUYỄN THỊ THƠM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM PYRETHROID TRONG RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

NGUYỄN THỊ THƠM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM PYRETHROID

TRONG RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội - 2014

và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám đốc Trung tâm Phân tích và Chuyển giao Công nghệ Môi trường và các anh chị, các bạn cộng tác tại phòng Phân tích Môi trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hóa, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hóa Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hóa k23, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hóa phân tích k23 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, tháng 01 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Thơm

1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật 4

1.1.4 Tình hình tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong rau 5

1.1.5 Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật 7

1.2 Giới thiệu về hóa chất thực vật nhóm pyrethroid 8

1.2.1 Giới thiệu chung 8

1.2.2 Cấu tạo và tính chất một số pyrethroid 9

1.3 Các phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV 14

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu 19

2.2.2 Phương pháp sắc ký khí 20

2.2.3 Định lượng các hoạt chất pyrethroid bằng GC- ECD 25

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 26

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ 26

2.3.2 Hóa chất 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu đối với việc phân tích các hoạt chất thuốc BVTV nhóm pyrethroid 28

3.1.1 Lựa chọn cột tách 28

3.1.2 Nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm 28

3.1.3 Khảo sát chương trình nhiệt độ cột tách 29

3.1.4 Khảo sát tốc độ khí mang 34

3.1.5 Khảo sát thể tích bơm mẫu 36

3.1.6 Tổng kết các điều kiện chạy sắc ký 39

3.2.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn 47

3.2.4 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 51

3.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 52

3.3.1 Khảo sát dung môi chiết và thể tích dung môi chiết 53

3.3.2 Lựa chọn điều kiện làm sạch 55

3.3.3 Quy trình phân tích dư lượng pyrethroid trong rau 59

3.4 Ứng dụng qui trình phân tích các mẫu rau 61

KẾT LUẬN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 70

gia .13

Bảng 2.1: Một số detector thông dụng dùng cho sắc ký khí 22

Bảng 3.1: Thời gian lưu của các hợp chất theo các chương trình nhiệt độ 30

Bảng 3.2: Vị trí các chất trên sắc ký đồ 32

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của tốc độ khí mang đến quá trình tách chất 34

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình phân tích 37

Bảng 3.5: Điều kiện chạy tối ưu cho phân tích đồng thời 4 hợp chất nhóm pyrethroid 40

Bảng 3.6: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất 41

Bảng 3.7: Phương trình đường chuẩn của các hoạt chất 46

Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất 47

Bảng 3.9: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phương trình đường chuẩn λ-cyhalothrin với giá trị 0 48

Bảng 3.10: Chuẩn F-tính của các chất BVTV 49

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b’ trong phương trình hồi quy 50

Bảng 3.12: Các giá trị để so sánh chuẩn t 2 phía 50

Bảng 3.13: Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau 52

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát thể tích dung môi diclomethane (DCM) đối với các hoạt chất pyrethroid 54

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát loại dung môi rửa giải đối với hoạt chất pyrethroid 56

Bảng 3.16: Khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với các hoạt chất pyrethroid 57

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với hoạt chất pyrethroid 58

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát thể tích dung môi rửa giải đối với các hoạt chất pyrethroid 59

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các mẫu rau 62

Bảng 3.20: Kết quả phân tích các mẫu rau thêm chuẩn 63

Hình 3.1: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 1 30

Hình 3.2: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 2 31

Hình 3.3: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 3 31

Hình 3.4: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 4 32

Hình 3.5 Sắc đồ của các hoạt chất nhóm pyrethroid khi tốc độ khí mang giảm dần36 Hình 3.7: Sắc đồ các hoạt chất pyrethroid chuẩn nồng độ λ-cyhalothrin 0,5mg/l, cypermethrin 1,0mg/l, deltamethrin 1,0mg/l và permethrin 1,0mg/l theo điều kiện sắc ký tối ưu .40

Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của λ-cyhalothrin và đường chuẩn của λ -cyhalothrin 42

Hình 3.9: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của permethrin 43

và đường chuẩn của permethrin 43

Hình 3.10: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ cypermethrin 44

và đường chuẩn của cypermethrin 44

Hình 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ deltamethrin 45

và đường chuẩn của deltamethrin 45

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết pyrethroid vào thể tích dung môi chiết DCM 55

Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các pyrethroid khi rửa giải bằng toluen, hexan, aceton, DCM 56

Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi khi kết hợp hai loại dung môi khác nhau 57

Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết pyrethroid vào 58

tỉ lệ dung môi rửa giải 58 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi pyrethroid vào thể tích

MỞ ĐẦU

Trong thời gian gần đây, hiện tượng ô nhiễm môi trường gây ra do các hoá chất nông nghiệp đang trở thành một vấn đề được đề cập đến khá nhiều Các loại thuốc trừ dịch hại, thuốc bảo vệ thực vật đang là một trong những nguyên nhân làm giảm

số lượng nhiều sinh vật có ích, làm giảm đa dạng sinh học, ảnh hưởng có hại tới sức khoẻ con người Hàng năm, ở nước ta có khoảng hơn 300 người chết vì nhiễm độc thuốc trừ sâu, con số người bị nhiễm độc mãn tính khá cao khoảng trên 2 triệu người, tỉ lệ người bị các bệnh rối loạn thần kinh thực vật, xảy thai, đẻ non… do bị nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật cũng không nhỏ Thuốc bảo vệ thực vật xâm nhập vào cơ thể con người chủ yếu qua con đường ăn uống thông qua các sản phẩm nông sản như rau, củ, quả, ngũ cốc… Người bị nhiễm độc chủ yếu là do ăn các sản phẩm nông sản mà dư lượng thuốc bảo vệ thực vật còn tồn lưu trong các sản phẩm đó quá mức cho phép

Tuy nhiên, trên thực tế vì nhiều lý do khác nhau mà tình tra ̣ng la ̣m du ̣ng thuốc BVTV trong sản xuất rau gây ô nhiễm dư lượng thuốc BVTV đang diễn ra khá phổ biến Cùng với sự phát triển của nền kinh tế và mức sống của nhân dân, yêu cầu về các sản phẩm nông sản sạch và an toàn nói chung, về rau an toàn nói riêng và vệ sinh môi trường của toàn xã hội ngày càng cao Do đó, việc ứng dụng và phát triển các phương pháp phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật nhằm đánh giá thực trạng dư lượng thuốc trong các sản phẩm rau ở nước ta là rất cần thiết

Để đóng góp thêm phương pháp phân tích cho đối tượng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện tách cũng như xác định các hợp chất thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid trong rau là λ-cyhalothrin, permethrin, cypermethrin, deltamethrin bằng phương pháp sắc ký khí (GC) sử dụng detector bắt điện tử (ECD)

Mục tiêu thực hiện đề tài luận văn là:

1 Xây dựng phương pháp xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật pyrethroid trong rau, bao gồm:

+ Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu và phân tích

+ Thẩm định phương pháp đã xây dựng

2 Áp dụng phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật pyrethroid để khảo sát một số mẫu rau trên địa bàn Hà Nội

1.1.2 Phân loại [10]

Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu 4 nhóm chính:

- Nhóm clo hữu cơ (organnochlorine) là các dẫn xuất clo của một số hợp chất hữu cơ như diphenyletan, cyclodien, benzen, hexan Nhóm này bao gồm những hợp chất hữu cơ rất bền vững trong môi trường tự nhiên và thời gian bán phân hủy dài (ví dụ DDT có thời gian bán phân hủy 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích lũy vào cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn) Đại diện nhóm này là aldrin, dieldrin, DDT, heptachlo, lindan, methoxychlor

- Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất hữu

cơ của acid photphoric Nhóm này có thời gian bán phân hủy ngắn hơn so với nhóm clo hữu cơ và được sử dụng rộng rãi Nhóm này tác động vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ, gây choáng váng và chết Nhóm này bao gồm một số hợp chất như parathion, malathion, diclovos, chlopyrifos…

- Nhóm carbamat là các dẫn suất hữu cơ của các acid cacbamic, gồm những hóa chất ít bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với nguời và động vật Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Chlinestraza của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc giống như nhóm lân hữu cơ Đại diện cho nhóm này như: carbofuran, carbonyl, carbosulfan, isoprocarb…

- Nhóm pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các este khác nhau có cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúc Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, deltamethrin, λ-cyhalothrin…

Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân…)

1.1.3 Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật [10]

Hầu hết hóa chất bảo vệ thực vật đều độc với con người và động vật máu nóng ở các mức độ khác nhau Theo đặc tính hóa chất bảo vệ thực vật được chia làm hai loại: chất độc cấp tính và chất độc mãn tính

- Chất độc cấp tính: Mức độ gây độc phụ thuộc vào lượng thuốc xâm nhập vào cơ thể Ở dưới liều gây chết, chúng không đủ khả năng gây tử vong, dần dần bị phân giải và bài tiết ra ngoài Loại này bao gồm các hợp chất pyrethroid, những hợp chất phốt pho hữu cơ, carbamat, thuốc có nguồn gốc sinh vật

- Chất độc mãn tính: Có khả năng tích lũy lâu dài trong cơ thể vì chúng rất bền, khi bị phân giải và bài tiết ra ngoài Thuốc loại này gồm nhiều hợp chất chứa clo hữu cơ, chứa thạch tín (Asen), chì, thủy ngân, đây là những loại rất nguy hiểm cho sức khỏe

Hóa chất bảo vệ thực vật có thể thâm nhập vào cơ thể con người và động vật qua nhiều con đường khác nhau, thông thường qua 03 đường chính: hô hấp, tiêu hóa

và tiếp xúc trực tiếp Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật, con người có thể bị nhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hưởng của thuốc

Nhiễm độc cấp tính: là nhiễm độc tức thời khi một lượng đủ lớn hóa chất bảo

vệ thực vật thâm nhập vào cơ thể Những triệu chứng nhiễm độc tăng tỉ lệ với việc tiếp xúc và trong một số trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau đầu, lợm giọng, buồn nôn, hoa mắt

chóng mặt, khô họng, mất ngủ, tăng tiết nước bọt, yếu cơ, chảy nước mắt, sảy thai, nếu nặng có thể gây tử vong

Nhiễm độc mãn tính: là nhiễm độc gây ra do tích lũy dần trong cơ thể Thông thường, không có triệu chứng nào xuất hiện ngay trong mỗi lần nhiễm Sau một thời gian dài, một lượng chất độc lớn tích tụ trong cơ thể sẽ gây ra các triệu chứng lâm sàng Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc mãn tính: kích thích các tế bào ung thư phát triển, gây đẻ quái thai, suy giảm trí nhớ và khả năng tập trung, suy nhược nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tổn hại cho gan, thận và não

1.1.4 Tình hình tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong rau

Theo kết quả kiểm tra của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn năm

2009, trong 25 mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc, có tới 44% mẫu rau có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, trong đó 4% có hoạt chất độc vượt giới hạn cho phép Kiểm tra 35 mẫu rau tại các tỉnh phía Nam, Cục bảo vệ thực vật phát hiện tới 54% mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, trong đó 8,6% mẫu được phát hiện có hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật đủ khả năng gây độc cho người sử dụng [5]

Theo thông tin từ Cục trưởng Cục Bảo vệ thực vật (BVTV) Nguyễn Xuân Hồng, trong tháng 10/2012, Cục BVTV đã chỉ đạo các đơn vị tiến hành lấy 50 mẫu rau sống (xà lách, rau diếp, rau húng và rau mùi) tại TP Hồ Chí Minh và Hà Nội để kiểm nghiệm các chỉ tiêu về dư lượng thuốc BVTV và kim loại nặng trong 11 hoạt chất sử dụng phổ biến có nguy cơ nhiễm chì và asen Kết quả có 29/50 mẫu (58%) phát hiện có dư lượng thuốc BVTV; 20 mẫu (chiếm 40%) phát hiện có kim loại nặng Đối với rau tươi, hiện có khoảng 6-7% lượng rau xanh trên thị trường có dư lượng thuốc BVTV vượt ngưỡng cho phép, 40% mẫu rau, giá đỗ có thành phần vi sinh vật vượt ngưỡng cho phép Còn theo khảo sát của Cục Quản lý chất lượng nông, lâm, thủy sản, trong hơn 500 mẫu rau quả mà Cục kiểm tra thì có trên 6% nhiễm thuốc BVTV bị cấm sử dụng [3]

Trong khoản thời gian từ tháng 12/2011 đến 11/2012, Trung tâm Kỹ thuâ ̣t

Đo lường Thử nghiê ̣m Quảng Bình đã tiến hành điều tra , khảo sát tình hình sản

xuất, tiêu thu ̣ và lấy 360 mẫu rau các loại tại 08 chợ đầu mối và 09 vùng trồng rau

trên địa bàn tỉnh Quảng Bình đã phát hiện: 169 mẫu còn tồn dư thuốc BVTV Vùng trồng rau phát hiện 27/58 mẫu (chiếm 47%), các chợ phát hiện 142/302 mẫu (chiếm

47%); có 57 mẫu rau phát hiện có dư lượng thuốc BVTV thuộc danh mục cấm, gồm: Gama-BHC: phát hiện 1/360 mẫu; Heptachlor epoxide: phát hiện 5/360 mẫu; Endosulfan I: phát hiện 1/360 mẫu; Metyl parathion: phát hiện 50/360 mẫu, 21/360

mẫu phát hiê ̣n Diclovos, 28/360 mẫu phát hiê ̣n Prothiofos, Phát hiện 02 mẩu rau có hàm lượng Metyl parathion vượt 1,5 - 1,6 lần giới hạn cho phép Tại hội nghị về

công tác vệ sinh an toàn thực phẩm trong ngành nông nghiệp vừa diễn ra hôm 25/8/2009 Cục Bảo vệ thực vật (BVTV – Bộ NN&PTNT) công bố kết quả kiểm tra

25 mẫu rau tại các tỉnh phía Bắc, có tới 44% mẫu rau có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, trong đó 4% có hoạt chất độc hại vượt quá giới hạn cho phép [12]

Thông tin từ hội thảo “Quản lý an toàn thực phẩm đối với sản xuất và kinh doanh rau quả ở quy mô nhỏ” do Viện Chính sách và Chiến lược phát triển nông

nghiệp nông thôn tổ chức ngày 19/12/2012 : trong cuộc khảo sát tại 8 tỉnh cho thấy,

có đến 51,24% mẫu rau phát hiện tồn dư lượng thuốc bảo vệ thực vật và kim loại nặng, 47% mẫu rau tồn dư vượt ngưỡng NO3, đây là một trong những nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc tại nước ta thời gian qua [14]

Trên thế giới, tại Ấn độ, cuộc điều tra được Bộ Nông nghiệp Ấn độ tiến hành trong một năm từ tháng 11 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008 trên toàn đất nước Ấn

Độ Kết quả là 18% rau và 12% hoa quả nội địa và nhập khẩu của Ấn Độ đều có dư lượng thuốc trừ sâu, kể cả những loại thuốc trừ sâu bị cấm, trong đó 4% lượng rau

và 2% lượng hoa quả có dư lượng thuốc trừ sâu cao hơn mức cho phép Khoảng 18% (664 mẫu) trong tổng số 3.648 mẫu rau như mướp, cà chua, bắp cải và súp lơ đều có dư lượng thuốc trừ sâu Các loại rau như bắp cải, súp lơ và cà chua có dư lượng thuốc trừ sâu lớn nhất Các loại thuốc trừ sâu tìm thấy trong các loại chủ yếu

là chlorpyrifos, monocrotophos, profenophos và cypermethrin [4]

1.1.5 Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật

Theo thống kê của Tổ chức Lao động Quốc tế ILO, trên thế giới, hàng năm

có trên 40.000 người chết vì ngộ độc rau trên tổng số 2 triệu nguời ngộ độc Tại Việt Nam, con số người bị ngộ độc cũng không nhỏ Từ năm 1993 – 1998, hàng chục ngàn người bị nhiễm độc do ăn phải rau ăn quả còn dư lượng thuốc trừ sâu Nặng nhất ở Đồng bằng song Cửu Long, năm 1995 có 13.000 người nhiễm độc, trong đó 354 người chết [9]

Thống kê của Cục An toàn và vệ sinh thực phẩm thuộc Bộ Y tế, từ năm 2000

- 2007 đã có tới 205 vụ ngộ độc, với 3.637 người mắc, 23 người chết do thực phẩm gây ngộ độc là rau, củ, quả Tính riêng năm 2007 cũng có 37 vụ ngộ độc, 555 người mắc và 7 người tử vong Mặc dù đây là số liệu tổng hợp từ báo cáo chưa đầy đủ của các tỉnh gửi về nhưng cũng cảnh báo thực trạng rất đáng lo ngại [15]

Thống kê của Bộ Y tế, trong năm 2012 đã xảy ra 112 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 3.000 người mắc phải, trong đó nhiều trường hợp đã tử vong, riêng 6 tháng đầu năm 2013 cả nước đã xảy ra 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 1.856 người mắc, 1.649 người nhập viện và 18 trường hợp tử vong Cũng theo khảo sát của cơ quan này trong số 200.000 người/năm bị ung thư thì có 35% trong số đó liên quan đến thực phẩm ô nhiễm chất độc [1]

Năm 1990, một thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho thấy có khoảng 25 triệu lao động trong ngành nông nghiệp bị nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật mỗi năm Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có những con số ước tính trên phạm vi toàn cầu, nhưng hiện có 1,3 tỷ lao động trong ngành nông nghiệp và có thể hàng triệu ca nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật vẫn đang xảy ra hàng năm [2]

Năm 2000, Bộ y tế Braxin ước tính trong một năm nước này có 300.000 ca nhiễm độc và 5.000 ca tử vong do hóa chất bảo vệ thực vật Trong một nghiên cứu

ở Indonexia, 21% trong số các ca liên quan đến hóa chất bảo vệ thực vật có những dấu hiệu hay triệu chứng về tâm thần, hô hấp và tiêu hóa Trong một cuộc khảo sát của Liên hợp quốc, 88% nông dân Campuchia sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đã từng có triệu trứng nhiễm độc [2]

1.2 Giới thiệu về hóa chất thực vật nhóm pyrethroid

1.2.1 Giới thiệu chung

Pyrethroid là dẫn xuất của este cacboxylat (còn gọi là este pyrethrum hoặc

este của pyrethrin, có nguồn gốc tự nhiên từ cây hoa cúc Chrysanthemum cinerariaefolium và C.roseum chứa nhiều hoạt chất pyrethrin độc đối với côn trùng

Các hoạt chất pyrethrin có thể đƣợc chiết xuất từ hoa, lá khô và rễ cây bằng một dung môi, chúng có tác dụng gây chết tức thời đối với côn trùng Trong dịch chiết của pyrethrin có sáu este của hai axit cacboxylic với ba xyclopentenolon với tỷ lệ khác nhau Công thức cấu tạo hoá học rất phức tạp nhƣng khi phân giải bị tách nhỏ thành những hợp chất có cấu tạo đơn giản, có thể chứa các nguyên tố Nitơ, Brôm

O O

prothrin và pyrethrin I) Pyrethrin có phổ trừ sâu rộng, hiệu lực diệt cao, độc tính

thấp với động vật máu nóng, nhƣng dễ bị phân hủy quang hóa nên chỉ dùng để diệt

và loại côn trùng trong nhà Chính nhờ tình chất quý báu đó của pyrethrin, đã thúc đẩy quá trình nghiên cứu tổng hợp các đồng đẳng của nó với hiệu lực diệt cao hơn

và độ bền quang hóa tốt hơn nhằm đƣa vào sử dụng rộng rãi thay thế cho những hợp chất diệt côn trùng nhóm clo hữu cơ, phốt pho hữu cơ và carbamat [7]

Pyrethroid không tác động đến các hệ men sống của cơ thể sinh vật, mà tác động trực tiếp đến hệ thần kinh của công trùng và động vật máu nóng Ở côn trùng, pyrethroid tác động đến hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi ở liều rất thấp Thuốc gây rối loạn sự dẫn truyền xung động của kênh natri dọc sợi trục của tế bào thần

ngăn cản và kìm hãm sự truyền xung động trong tế bào thần kinh Ở động vật máu nóng, pyrethroid tác động đến các trung tâm hô hấp ở tuỷ sống và hệ thần kinh kiểm soát chức năng của tim Triệu chứng ngộ độc của pyrethroid trong côn trùng

và động vật máu nóng rất giống nhau: Trước tiên là kích động, rùng mình, rối loạn tiếp sau là bại liệt và chết [7]

Các chất chủ yếu của nhóm bao gồm: allethrin, pyrethrin, permethrin, cypermethrin, cyfluthrin, cyhalothirn , bifenthirn, deltamethrin, fenpropathrin, ethofenprox…

1.2.2 Cấu tạo và tính chất một số pyrethroid

ca nhiễm độc nặng có thể gây co giật và hôn mê Nó được xếp vào nhóm có thể gây ung thư đối với con người [23]

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của λ-cyhalothrin là 0,02mg/kg trọng lượng cơ thể Đối với chuột liều gây chết trung bình qua đường miệng LD50 với chuột đực 79mg/kg, chuột cái là 56mg/kg và liều chết trung bình qua da là 632mg/kg [23]

1.2.2.2 Cypermethrin

Cypermethrin được tổng hợp thành công vào năm 1974 và được tung ra thị trường lần đầu tiên vào năm 1977 (WHO, 1989) Cypermethrin là chất bán rắn (sệt), không mùi, có màu vàng nâu và ít tan trong nước (khoảng 0,009 mg/L) Tuy nhiên, cypermethrin hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như aceton, cyclohexan, ethanol, hexan ( 103g/L), xylen ( > 450 g/L) Nó ở dạng bột tinh thể không màu, bền ở điều kiện thường Dạng kỹ thuật có màu vàng nâu, nhớt Tên thương mại là AmmoTM

Cyperkill CybushR….[21]

Tên tương ứng là: dimethylcyclopropane-1-carboxylate

là ngứa, bỏng rát, chóng mặt [21]

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của cypermethrin là 0,05mg/kg trọng lượng cơ thể Liều gây chết trung bình qua đường miệng LD50 là

1.2.2.3 Deltamethrin

Deltamethrin được coi là hoạt chất mạnh nhất và độc nhất trong nhóm pyrethroid Nó có dạng tinh thể rắn màu trắng, bền ở điều kiện thường Permethrin không tan trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ: Dioxan: 900g/l; cyclohexanone: 750 g/l; dicloromethane: 700g/l; Acetone: 500g/l; Benzen: 450g/l Bền trong môi trường acid hơn môi trường kiềm, tương đối bền dưới tác động của không khí, nhưng dưới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại bị phân huỷ; không ăn mòn kim loại; thuộc nhóm độc II Tên thương mại các sản phẩm chứa hoạt chất deltamethrin gồm Butoflin, Butoss, Butox, Cislin, Crackdown, Cresus, Decis, Decis-Prime, K-Othrin and K-Otek [22]

Tên tương ứng:

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của deltamethrin là 0,01mg/kg/ngày trọng lượng cơ thể Liều gây chết trung bình LD50 đối với chuột đực qua đường miệng là 128mg/kg, chuột cái là 52mg/kg [22]

1.2.2.4 Permethrin

Các tên tương ứng: 3-Phenoxybenzyl

(1RS)-cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate Permethrin có dạng bột tinh thể màu trắng, bền ở điều kiện bình thường, phân hủy ở nhiệt độ > 1900C Nó hầu như không tan trong nước (5,5.10-3

ppm), tan tốt trong dung môi hữu cơ như hexan, xylene Bền trong môi trường acid, thủy phân trong môi trường kiềm, thuộc nhóm độc III [27] Công thức phân tử: C21H20Cl2O3

M = 391,29g/mol

tnc = 63- 65˚C

ts = 220˚C Permethrin là một hóa chất diệt côn trùng thông dụng, sinh vật ký sinh Hóa chất này thuộc gia đình các hóa chất tổng hợp pyrethroid và có chức năng như là một chất gây độc tố cho thần kinh, làm tăng độ thấm của của Na qua màng tế bào thần kinh, kết quả gây nên sự lặp đi lặp lại và kéo dài xung động thần kinh trong cơ quan cảm giác và làm đình trệ xung động trong sợi thần kinh Hóa chất này không gây hại nhanh động vật có vú và chim, nhưng là hóa chất rất độc đối với mèo và cá Nói chung, permethrin có độ độc thấp với động vật có vú và hầu như không bị hấp thụ bởi da Permethrin diệt hầu như tất cả các loài côn trùng, nó có thể gây hại đối với các loài côn trùng có lợi như ong mật và sinh vật sống dưới nước Triệu chứng gây độc khi tiếp xúc nhiều với permethrin là nôn, đau đầu, yếu cơ, tiết ra nhiều nước bọt, đau tim cấp và co giật Theo cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA), nó có khả năng gây ung thư [27]

Mức độ hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của permethrin là 0- 0,05mg/kg/ngày trọng lượng cơ thể Liều gây chết trung bình LD50 đối với chuột tiếp xúc qua đường miệng là 430- 470 mg/kg [27]

1.2.2.5 Giới hạn cho phép

Dư lượng thuốc BVTV là những chất đặc thù tồn lưu trong lương thực và thực phẩm, trong sản phẩm nông nghiệp và trong thức ăn vật nuôi do sử dụng thuốc

BVTV gây nên Những chất đặc thù này bao gồm hoạt chất và các phụ gia ở dạng hợp chất ban đầu, các sản phẩm chuyển hoá trung gian và sản phẩm phân giải ở dạng tự do hoặc liên kết với các chất trong thực vật có hại tới sức khoẻ con người

và động vật máu nóng (gọi chung là chất độc)

Dư lượng này được tính bằng mg (miligam) hoặc g (microgam) trong 1kg nông sản Từng loại thuốc đối với từng loại nông sản đều được qui định mức dư lượng tối đa cho phép mà không gây hại đến cơ thể người và vật nuôi khi ăn nông sản đó (maximum residue limited, viết tắt là MRL) Mức dư lượng tối đa cho phép

có thể qui định khác nhau ở mỗi nước, tuỳ theo đặc điểm sinh lý, sinh thái và đặc điểm dinh dưỡng của người dân nước đó

Bảng 1.1: Mức độ tối đa cho phép sử dụng thuốc trừ sâu pyrethroid ở một số

quốc gia

Quốc gia Đối tượng

cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin

λ-mg/kg Việt Nam

(Quyết định

46/2007/QĐ-

BYT) [8]

- Cà chua, đậu đỗ

- Cải xoăn, rau họ bắp cải, bông cải xanh

EU - Cà chua

- Đậu đỗ

- Bắp cải

- 0,5 0,2

0,3

- 0,2

1.3 Các phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật flumethrin, deltamethrin, cypermethrin và cyhalothrin trong sữa và máu của bò sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bước sóng 266nm Mẫu được chiết với tỷ

lệ hỗn hợp acetonitril và hexan Sau đó làm sạch bằng cột slilicagel với dung môi hexan và dietyl ether Dịch chiết được đem đi đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,001mg/kg Hiệu suất thu hồi trung bình của 4 hoạt chất pyrethroid từ 78 đến 91% [20]

n-Tác giả Loper và cộng sự đã xác định thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethrin

và pyrethroid trong nước mẫu nước đầu vào và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector Diode array (LC-DAD) Pha động gồm: nuớc và acetonitril, chế độ chạy gradient Tốc độ dòng 0,5ml/phút Các mẫu được chiết đơn giản, không độc và nhanh, chỉ sử dụng natri clorua và acetonitril Dịch chiết được lọc và phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng Hiệu suất thu hồi mẫu nuớc đầu vào trong khoảng từ

77 đến 103% với độ lệch chuẩn tương đối đạt 3-12% Hiệu suất thu hồi mẫu nước tiểu đạt 80 – 117% với độ lệch chuẩn tương đối từ 2-27% Tất cả các hoạt chất thu đuợc ở bước sóng 235nm Giới hạn phát hiện của phương pháp trong 5mL mẫu nước tiểu là 0,005µg/mL đối với tetramethrin, allethrin, resmethrin, permethrin; 0,004µg/mL đối với pyrethrum I; 0,04µg/mL đối với pyrethrum II; 0,002µg/mL đối với fenvalerate [26]

Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) được phát triển để tách và định lượng các đồng phân của cypermethrin, resmethrin và permethrin Quá trình tách được thực hiện trên cột Phenomenex Luna C18 (4,6 x 150mm x 5µm) Các hoạt chất pyrethroid được phát hiện bằng detector UV-DAD ở bước sóng 220nm Pha động tối ưu là hỗn hợp của acetonitril: methanol: nước theo tỷ lệ thể tích 1 : 3 :1 tương ứng Hệ số tương quan (R2) lần lượt là 0,9991; 0,9951; 0,9964 và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) là 1,95; 2,89; 1,87 tương ứng với hoạt chất cypermethrin,

resmethrin, permethrin Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp nằm trong khoảng 17-23,4µg/L và 56-78µg/L [17]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chất hữu cơ Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định đồng thời các hoạt chất pyrethroid Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy kém khi sử dụng detector UV, DAD Đối với các nền mẫu phức tạp, các chất phân tích dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định chất cần phân tích

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí

Tác giả Phan Nguyễn Tâm Minh đã xác định được đồng thời dư lượng thuốc trừ sâu họ Pyrethroid và Lân hữu cơ trong nước bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp với chiết pha rắn Các hoạt chất được xác định đồng thời trong mẫu: lambda-cyhalothrin, permethrin, deltamethrin, fenvalerate, cyfluthrin, tetramethrin, cypermethrin, allethrin, cyphenothrin, diazinon, chlorpyrifos, dimethoate, phenthoate, phenitrothion Tác giả xây dựng được điều kiện tối ưu trên thiết bị sắc

ký khí kết hợp detector bắt điện tử và điều kiện tối ưu để chiết 14 hoạt chất trên bằng chiết pha rắn C18: hoạt hóa cột bằng 5ml hexan, 5ml methanol, 20ml nước, rửa giải các hoạt chất bằng hỗn hợp etyl acetate và hexan (75: 25, v/v) [6]

Phương pháp sắc ký khí khối phổ được tác giả Nguyễn Thị Bích Thu và cộng

sự dùng để phân tích dư lượng một số hóa chất bảo vệ thường dùng trong mẫu dược liệu và một số nông sản Tác giả đã ứng dụng thành công phương pháp phân tích trên các nhóm thuốc clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid đồng thời đề xuất được quy trình phân tích 3 nhóm thuốc bảo vệ thực vật trên đối tượng là mẫu dược liệu Dung môi chiết được nghiên cứu là hỗn hợp aceton: n-hexan (1:1, v/v) và dung môi rửa giải là hỗn hợp diclomethan: hexan (1:4, v/v) Đề tài sử dụng cột silicagel kết hợp với than hoạt tính để làm sạch chất phân tích đã thu được hiệu suất thu hồi cao khoảng từ 80-110% [13]

Dư lượng các thuốc trừ sâu họ clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid trong các loại nông sản gồm bột ngũ cốc, trái đào và rau diếp được xác định bằng phương pháp sắc ký khí với detector bắt điện tử (GC-ECD) và sắc ký khí khối khổ (GC-MS)

theo qui trình sau: mẫu được chiết với dung môi acetone: nước (8:2) sau đó được lọc lấy dịch chiết Dịch chiết được pha loãng theo tỉ lệ 5g mẫu/200ml nước rồi cho qua cột GCB (400mg ENVI- Carb), rửa với ethyl acetate: methanol (8:2) Tiếp tục cho qua cột SAX/PSA (250mg + 250mg), rửa giải bằng ethyl acetate: methanol (8:2) Sau đó cho bay hơi dịch chiết còn 5ml và lấy dịch này tiêm vào máy sắc ký Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp từ 0,0005- 0,004mg/kg và giới hạn định lượng LOQ từ 0,005- 0,01mg/kg [19]

Tác giả Kuang Hua và cộng sự đã xác định đuợc 16 dư lượng thuốc pyrethroid trong mẫu chè bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Thuốc trừ sâu nhóm Pyrethroid đựợc chiết bằng acetone và chiết lỏng lỏng bằng hexan Dịch chiết được cô khô và làm sạch qua cột florisil, dung dịch rửa giải là ete dầu hỏa- dietyl ete Phân tích thuốc bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Hiệu suất thu hồi của 16 thuốc nhóm pyrethroid trong khoảng từ 71,3 đến 106,3% và hệ số biến thiên nhỏ hơn 17% Giới hạn phát hiện từ 0,001µg/g đến 0,05µg/g Phương pháp ứng dụng thành công để xác định dư lượng pyrethroid trong 25 mẫu chè Dư lượng của cyfluthrin, λ-cyhalothrin, cypermethrin, dicofol, fenpropathrin, femvalerate, fluvalinate and tetramethrin trong các mẫu ở khoảng 1,18 – 3071,29µg/g [25]

Phương pháp sắc ký với detector bắt điện tử và sắc ký khí khối phổ được ứng dụng xác định đồng thời 12 hợp chất pyrethroid (tefluthrin, bifenthrin, fenpropathrin, cyhalothrin, permethrin, cyfluthrin, cypermethrin, α-cypermethrin, flucythrinate, fenvalerate, fluvalinate và deltamethrin) trong mẫu cà chua xay, rượu đào tiên, nước cam, đậu đóng gói Mẫu được chiết với acetone, hỗn hợp ethyl acetate – cyclohexane (50 + 50, v/v) Dịch chiết đem cô và tiến hành bước làm sạch trên cột florisil với hỗn hợp dung môi rửa giải là etyl acetate và hexan Thu toàn bộ dịch rửa giải có chứa chất phân tích đem cô khô và định mức bằng 1ml hexan, đem

đo trên thiết bị sắc ký khí với detector bắt điện tử và detector khối phổ Hiệu suất thu hồi đạt 70,2- 96,0% Hệ số biến thiên nằm trong khoảng 4,0 đến 13,9% cho tất

cả các hợp chất Giới hạn phát hiện < 0,01mg/kg khi phân tích trên detector ECD [28]

Tác giả Alicja Niewiadowska và cộng sự đã xác định được đồng thời dư lượng 7 hoạt chất thuốc nhóm pyrethroid (bifenthrin, cyfluthrin, λ-cyhalothrin, cypermethrin, deltamethrin, fenvalerate và permethrin) trong mẫu thịt động vật Phương pháp này dựa trên việc chiết dư lượng pyrethroid bằng hỗn hợp acetone- ether dầu hỏa, làm sạch mẫu trên cột florisil sử dụng dung môi rửa giải là hexan- dietyl ete và cuối cùng xác định bằng hệ thống GC- ECD Hiệu suất thu hồi của phương pháp cho tất cả các thuốc nhóm pyrethroid (trừ deltamethrin) đều > 80%,

độ lặp lại < 6%, độ tái lặp < 16%, LOQ là 10µg/kg, độ không đảm bảo đo < 21% [18]

Tác giả Hans- Peter Their và Jochen Kirchhoff đã xác định dư luợng thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid trong một số mẫu rau quả, đất, nước bằng phương pháp sắc ký khí Mẫu thực vật sau khi được nghiền nhỏ đem đồng nhất với hỗn hợp hexan và acetone Dịch chiết thu được đem cô trên thiết bị cô quay chân không và làm sạch trên cột Florisil sử dụng dung môi rửa giải hỗn hợp hexan- dietyl ete Với mẫu thực vật chứa dầu cần chiết với hỗn hợp acetonitril – hexan Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật pyrethroid được chiết ra khỏi nước dùng hexan và chiết ra khỏi đất dùng dung dịch NH4Cl và acetone sau đó làm sạch trên cột florisil như đối với mẫu thực vật Hoạt chất pyrethroid được xác định bằng sắc ký khí kết hợp với detector bắt điện tử (GC-ECD) [24]

Phương pháp sắc ký khí đã được ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật như clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat Phương pháp

có ưu điểm là có thể phân tích hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau với độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh Với những ưu điểm trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký khí kết hợp với detector bắt điện tử (GC-ECD) để nghiên cứu xác định đồng thời các chất pyrethroid

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Rau là thành phần không thể thiếu trong bữa ăn của người Việt Nam Sản xuất rau ở nước ta trong thời gian qua đã có những bước tiến đáng kể về năng suất

và chất lượng Nhiều vùng sản xuất rau chuyên canh, tập trung đã được hình thành, góp phần vào việc giải quyết nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu Tuy nhiên, diện tích sản xuất rau thực hiện theo tiêu chí rau an toàn ở vẫn còn khá khiêm tốn (chỉ chiếm khoảng 10%) Đa phần các vùng sản xuất rau chuyên canh hiện nay đều quản lý sản xuất theo kinh nghiệm Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) là một biện pháp được tăng cường cho việc thâm canh rau Hiện nay, nhiều người dân đã lạm dụng thuốc BVTV làm cho dư lượng thuốc trong nhiều mẫu rau vượt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá như cải ngọt, cải bẹ xanh, cải bắp, cải thảo, mồng tơi, rau muống, dưa leo…

Ngoài mặt tích cực là tiêu diệt các sinh vật gây hại trên rau, dư lượng thuốc BVTV còn gây hậu quả nghiêm trọng: phá vỡ hệ cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm môi trường sống và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng và cả cho người sản xuất; là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm Do đó, đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là một số rau đại diện cho các rau được trồng phổ biến ở Việt Nam, bao gồm: cải bắp, cải xanh, cải ngọt, rau mồng tơi, rau muống, đậu đỗ, cà chua

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời các hoạt chất pyrethroid trong rau bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp với detector bắt điện

tử (GC- ECD)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách hệ thống các vấn đề

2.1.2.1 Xây dựng phương pháp

 Khảo sát phương pháp bao gồm:

- Điều kiện tách chiết mẫu

- Điều kiện chạy máy

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu

Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn là các loại rau có nền mẫu phức tạp

Do đó, cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector và tăng khả năng phát hiện

Trong bản luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu lựa chọn dung môi

và điều kiện tách chiết, làm sạch mẫu phân tích

 Tách chiết:

Tách chiết là bước quan trọng trong quá trình phân tích, trong bước này cần phải lựa chọn dung môi để chuyển chất cần xác định từ mẫu phân tích ra dung môi chiết Có nhiều loại dung môi khác nhau được lựa chọn để chiết mẫu Dung môi được lựa chọn cần phải hòa tan tốt các chất cần chiết nhằm đạt được hiệu suất thu hồi cao nhất

 Làm sạch:

Yêu cầu của bước chiết mẫu trong phương pháp phân tích đa dư lượng các

thuốc BVTV phải tách chiết được nhiều loại thuốc BVTV cùng một lúc Tuy nhiên, trong quá trình chiết suất có rất nhiều tạp chất đi kèm theo vào dịch chiết, bước làm

sạch được thực hiện với mục đích loại bỏ các tạp chất đi kèm mà vẫn giữ được chất cần phân tích Có hai phương pháp làm sạch thường được sử dụng:

- Chiết lỏng - lỏng: Quá trình chiết lỏng - lỏng cũng được xem như một bước làm sạch để loại bỏ cơ chất thực vật dựa trên khả năng phân bố khác nhau của thuốc BVTV và các nội chất thực vật trong hai dung môi không hòa tan vào nhau Trong luận văn này, chúng tôi đã sử dụng diclomethan để làm sạch dịch chiết

- Sắc ký cột: cột hấp phụ có thể là cột silicagel, florisil, oxit nhôm trung tính Một số phương pháp, người ta làm sạch mẫu nhờ các chất nhồi cột SPE-C18, SPE-Florisil Trong khuôn khổ luận văn và dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành làm sạch mẫu qua cột florisil với các dung môi rửa giải được khảo sát trong các thí nghiệm bên dưới

Phương pháp có hiệu quả tách rất cao và thời gian phân tích nhanh, với detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp có thể đạt 0,1ppb [16]

2.2.2.2 Nguyên tắc hoạt động

Nhờ có khí mang từ bom khí (hoặc máy sinh khí), mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký xảy ra tại đây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đây nồng độ chất được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hay máy vi tính Các tín hiệu được

xử lí tại đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả Kết quả của quá trình phân tích sắc ký khí được biểu diễn bằng sắc đồ Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic Mỗi pic của sắc đồ ứng với một hay một nhóm cấu tử của mẫu phân tích [16]

2.2.2.3 Cấu tạo và mô hình sắc ký khí

a) Cấu tạo:

Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector

* Cột tách: có 2 loại cột tách là cột nhồi và cột mao quản

Ở cột nhồi, cột được nhồi đầy pha tĩnh xốp hay bằng các viên chất mang có phủ trên bề mặt một lớp mỏng pha lỏng tương ứng có khối lượng từ 0,1% - 0,25% khối lượng so với chất mang Khi dòng khí mang len lỏi qua các khe hở trong cột tách, các cấu tử cần phân tích trong dòng khí mang sẽ được lưu giữ ở pha tĩnh với mức độ khác nhau Nhưng với cột nhồi, chiều dài cột không thể kéo dài một cách tùy ý vì độ chênh lệch áp suất giữa đầu và cuối cột tăng tỉ lệ với chiều dài cột Do

đó để khắc phục điều này, người ta đã chế tạo ra cột mao quản

Cột mao quản là loại cột tách với đường kính nhỏ hơn 1mm, thành trong của cột được tẩm pha tĩnh Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đưa mẫu đi qua cột tách rất dài (làm cho năng suất tách cao) mà không gặp trở kháng lớn (về độ chênh lệch áp suất) Các cấu tử sẽ tương tác với pha tĩnh bám trên thành cột và được lưu giữ lại mức độ khác nhau Hiện nay, người ta hay sử dụng 2 loại cột mao quản là cột mao quản phim mỏng và cột mao quản lớp mỏng [16]

* Detector:

Detector là bộ phận có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lượng không điện (nồng độ khối lượng các chất được tách ra khỏi cột sắc ký) thành đại lượng điện Hiện nay, tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà người ta có nhiều loại detector khác nhau Một số detector thông dụng của sắc ký khí được liệt kê trong bảng 2.1 [16]

Bảng 2.1: Một số detector thông dụng dùng cho sắc ký khí

5.10-12 Detector vạn năng cho hầu như tất cả

các chất hữu cơ Bắt điện tử (ECD)

2.10-14

Áp dụng cho các chất có ái lực điện tử cao như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ (loại clo hữu cơ), chất dị tố

Quang hóa ngọn lửa

(FPD)

10-8 đối với parathion

Phát xạ tối ưu cho lưu huỳnh ở 394 nm

và photpho ở 526 nm

b) Sơ đồ thiết bị sắc ký khí:

2.2.2.4 Một số đại lượng dùng trong sắc ký khí

Hình 2.2: Sắc ký đồ của 2 cấu tử 1 và 2

Một số thông số được mô tả trên hình 2:

 tM (thời gian chết): là thời gian cần thiết để khí mang đi qua cột tách của hệ sắc ký khí

 tR (thời gian lưu) = tR’ + tM: là thời gian được tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột đến khi pic đạt giá trị cực đại Trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn

tR của mỗi chất là không đổi Đây là thông tin về mặt định tính của một chất

 tR’ (thời gian lưu hiệu chỉnh): là thời gian lưu không tính đến thời gian chết (thời gian lưu thực của chất)

 Wb (độ rộng của đáy pic)

 k’ (hệ số dung lượng): cho biết khả năng phân bố của cấu tử cần phân tích trong hai pha với sức chứa của cột Nó cũng là tỷ số giữa lượng chất trong pha tĩnh

và lượng chất bị kéo đi bởi khí mang tại thời điểm cân bằng

(2.1)

 α (hệ số tách hay độ chọn lọc): là tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất, cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký khí, hai chất chỉ được tách ra khi giá trị k’ khác nhau, hay α >1

(2.2)

Để tách riêng 2 chất, ta thường chọn α trong khoảng từ 1,05 đến 2 α càng lớn thì 2 chất càng tách nhau tốt, nhưng khi α quá lớn thì thời gian phân tích sẽ kéo dài, gây doãng píc và tốn kém không cần thiết

 N (số đĩa lý thuyết): là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực của cột tách Số đĩa

lý thuyết càng cao, khả năng tách càng tốt N được tính theo công thức sau:

(2.3)

 R (độ phân giải): là đại lượng đặc trưng cho mức độ tách của 2 chất cạnh nhau trên cùng một điều kiện sắc ký R được tính theo công thức sau:

Khi R = 0,75 thì 2 píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

Khi R = 1,0 hai pic có độ lớn tương tự nhau được tách ra khỏi nhau khoảng 95% Khi R = 1,5 thì sự phân giải được coi như là hoàn toàn, khoảng 99,7%

Giữa độ phân giải, hệ số dung lượng của cấu tử ra sau, độ chọn lọc α và số đĩa lý thuyết N của cột có mối liên hệ thông qua phương trình:

(2.5) Như vậy muốn tăng R ta có thể dùng các biện pháp sau:

+ Tăng số đĩa lý thuyết bằng cách dùng cột dài hơn, hay giảm tốc độ pha động

+ Tăng k’2 bằng cách thay đổi thành phần pha động

+ Tăng α bằng cách thay đổi thành phần pha động hoặc chọn cột khác phù hợp hơn với quá trình tách

2.2.3 Định lượng các hoạt chất pyrethroid bằng GC- ECD

2.2.3.1 Chương trình GC- ECD

Chương trình nhiệt độ 80˚C giữ 1 phút, tăng 40˚C/phút lên 180˚C

giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ

2 phút, tăng 3˚C/phút đến 265˚C giữ 2 phút, tăng 4˚C/phút lên 280˚C giữ 15 phút Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250˚C

2.2.3.2 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Theo lý thuyết sắc ký khí, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn thì thời gian lưu của chất là đại lương đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất Còn chiều cao và diện tích pic sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất Trong một khoảng nồng độ xác định và không lớn, chúng có mối quan hệ tuyến tính như sau:

Hi = k1.Ci = f(C) (2.6)

Si = k2.Ci = f(C) (2.7) Trong đó:

Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của cấu tử i

Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi

k1,k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký của pha tĩnh cũng như khí mang

Dựa vào công thức (2.6) hoặc (2.7) có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê với các thông số đặc trưng sau [6]:

+ Giá trị trung bình:

1

1 n i i

- Các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm

- Máy lắc cơ, chuyển động ngang, tần số 200 vòng/phút

- Máy đồng nhất mẫu tốc độ cao

- Máy thổi khí nito

- Màng lọc PTFE 0,45 μm

- Thiết bị cô quay chân không

- Máy sắc ký khí GC-2010 của hãng Shimadzu

- Cột: DB-5MS, pha tĩnh metylpolisiloxan với 5% phenyl, bề dầy lớp phim 0,25um, I.D 0,25mm, chiều dài cột 30m, nhiệt độ tối đa 325 0C

- Cân phân tích

- Khí mang: nitơ

- Các dụng cụ khác như các loại bình định mức, pipet, micropipette…

2.3.2 Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất có độ tinh khiết cấp GC hoặc cao hơn:

- Nước không chứa các chất gây ảnh hưởng tới phương pháp này và phù hợp

+ Deltamethrin (Sigma Alldrich, Mỹ): độ tinh khiết 99,7%

+ Permethrin (Sigma Alldrich, Mỹ): độ tinh khiết 98,3%

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l: Cân chính xác 0,01g chất chuẩn lần lƣợt của từng pyrethroid, hòa tan vào từng bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng n-hexan Chuẩn gốc đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 0 - 5°C

Dung dich chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l: lấy chính xác 0,1ml dung dịch chuẩn gốc của mỗi pyrethroid 1000mg/l cho vào bình định mức 10 và định mức đến vạch bằng n-hexan

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu đối với việc phân tích các hoạt chất thuốc BVTV nhóm pyrethroid

3.1.1 Lựa chọn cột tách

Cột tách (pha tĩnh) là yếu tố quan trọng trong phân tích sắc ký Tùy bản chất của hỗn hợp chất phân tích mà lựa chọn cột tách với pha tĩnh thích hợp Theo các tài liệu tham khảo để phân tích hỗn hợp các hợp chất nhóm pyrethroid người ta sử dụng loại cột mao quản trên thiết bị GC/ECD Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn cột tách mao quản DB-5MS với các thông số như sau:

- Bản chất pha tĩnh: Metylpolisiloxan với 5% phenyl

- Chiều dài cột: 30m

- Đường kính trong: 0,25mm

- Bề dày lớp phim: 0,25µm

- Nhiệt độ tối đa: 3250C

3.1.2 Nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm

Các thông số nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm những thông số cần được lựa chọn thích hợp để máy vận hành ổn định và thu được kết quả tốt

Nhiệt độ cổng bơm mẫu thông thường có thể chọn từ 230-250˚C Do hỗn hợp thuốc trừ sâu phân tích có nhiều chất ở nhiệt độ cao trên 250˚C nên nhiệt độ cổng bơm mẫu được đặt ở 250˚C nhằm đảm bảo điều kiện hóa hơi toàn bộ mẫu

Đầu dò ECD chịu được nhiệt độ cao từ 250˚C- 400˚C và để cho đầu dò hoạt động ổn định thì nhiệt độ áp đặt thường cao hơn nhiệt độ cao nhất của chương trình nhiệt lò cột từ 20˚C-25˚C Do cột DB-5MS có khả năng chịu được nhiệt độ tối đa là 325˚C nên để đảm bảo tuổi thọ cột đồng thời cũng phù hợp với đối tượng các thuốc bảo vệ thực vật chương trình nhiệt lò cột thường ở mức tối đa từ 270˚C-280˚C Vì

vậy, nhiệt độ đầu dò được chọn là 280˚C Ở nhiệt độ này các chất phân tích sẽ hóa hơi hoàn toàn, không đọng lại trên đầu dò làm giảm độ nhạy của đầu dò

Ngoài ra, đối tượng mẫu là hỗn hợp có hàm lượng thuốc BVTV thấp nên kiểu bơm không chia dòng được lựa chọn

3.1.3 Khảo sát chương trình nhiệt độ cột tách

Chuẩn hỗn hợp của: lambda-cyhalothrin 0,5mg/l, cypermethrin1,0mg/l, permethrin 1,0mg/l, deltamethrin 1,0mg/l được bơm vào hệ thống GC với các chương trình nhiệt độ sau:

- Chương trình 1 (CT1): 80˚C giữ 1 phút, tăng 40˚C/phút lên 180˚C giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ 2 phút, tăng 3˚C/phút đến 265˚C giữ 2 phút, tăng 4˚C/phút lên 280˚C giữ 15 phút

Tổng thời gian phân tích là 36,52 phút

- Chương trình 2 (CT2): 80˚C giữ 1 phút, tăng 30˚C/phút lên 180˚C giữ 1 phút, tăng 20˚C/phút đến 245˚C giữ 2 phút, tăng 2˚C/phút đến 265˚C giữ 5 phút, tăng 5˚C/phút lên 280˚C giữ 10 phút

Tổng thời gian phân tích là 38,58 phút

- Chương trình 3 (CT3): 80˚C giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ 2 phút, tăng 4˚C/phút đến 265˚C giữ 25 phút

Tổng thời gian phân tích là 39,60 phút

- Chương trình 4 (CT4): 80˚C giữ 1 phút, tăng 25˚C/phút đến 245˚C giữ 2 phút, tăng 4˚C/phút đến 265˚C giữ 20 phút, tăng 5˚C/phút lên 280˚C giữ 3 phút

Tổng thời gian phân tích là 40,60 phút

Bảng 3.1: Thời gian lưu của các hợp chất theo các chương trình nhiệt độ

Hình 3.4: Sắc đồ các hoạt chất nhóm pyrethroid theo CT 4

Trong 3 chương trình nhiệt độ đã khảo sát, từ sắc đồ và kết quả thu được

nhận thấy chương trình 2 tách các hoạt chất pyrethroid rõ ràng hơn, các pic đồng

phân của λ-cyhalothrin, permethrin, cypermethrin, deltamethrin được tách tốt hơn

và rút ngắn được thời gian phân tích Do đó, chương trình nhiệt độ 2 được lựa chọn

cho các nghiên cứu tiếp theo

 Định danh các chất trên sắc ký đồ

Dung dịch chuẩn chứa lần lượt các thuốc λ-cyahothrin, cypermethrin,

permethrin, deltamethrin ở nồng độ 1,0mg/l được tiêm vào máy sắc ký để xác định

vị trí các chất trên sắc ký đồ

Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Vị trí các chất trên sắc ký đồ Thứ tự

peak Thời gian lưu (phút) Đặc điểm peak Tên hoạt chất

3 19,997 ; 20,292 ; 20,410 ; 20,559 Mũi đa Cypermethrin

Lambda- cyhalothrin Permethrin

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 uV(x10,000) Chromatogram

uV(x10,000) Chromatogram