NẤM TRONG CÔNG NGHỆ CHUYỂN HÓA MÔI TRƯỜNG

Chính vì vậy, Chuyên luận “Xây dựng hệ thống học chủng loại phát sinh của họ nấm Linh chi Ganodermataceae Donk” , trên cơ sở hình thái giải phẫu và cấu trúc gene rDNA: thẩm định vị trí c

LÊ XUÂN THÁM, Ph D

Assoc Professor

TRONG CÔNG NGHỆ &

CHUYỂN HÓA MÔI TRƯỜNG

Linh Chi

Ganodermataceae Donk

NHÀ XUẤT BẢN

KHOA HỌC &

KỸ THUẬT

Lê Xuân Thám, Ph.D

Assoc Professor

TRONG CÔNG NGHỆ &

CHUYỂN HÓA MÔI TRƯỜNG

Linh Chi

Ganodermataceae Donk

NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC & KỸ THUẬT

Hà nội – 2010

SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆN NĂNG LƯỢNG NGUYÊN TỬ VIỆT NAM TỈNH ĐỒNG NAI

Chuyên luận III trong Đề tài:

“Phát triển sản xuất nấm trên cơ sở điều tra tài nguyên xây dựng Bảo tàng Nấm Vườn Quốc gia Cát tiên”

Cùng GSTS JM Moncalvo tại tuyến Cây tung, Nam Cát tiên, 4/2008

MỞ ĐẦU

Từ lâu, nấm Linh chi (Ganoderma) được biết tới như một loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và chữa trị nhiều loại bệnh Trong những năm gần đây các nghiên cứu y và dược học cũng cho thấy rằng các chế phẩm từ nấm Ganoderma còn kìm hãm sự tổng hợp ADN mới của tế bào ung thư và hạn chế quá trình di căn,… Các loài Ganoderma khác nhau cũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt tính khác nhau , tác dụng tốt trên hệ tim mạch, bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch,…

Cách đây tròn 60 năm (1948), Donk M.A - nhà nấm học Hà Lan nổi tiếng đã xác lập

họ Linh chi Ganodermataceae Donk trên cở sở tính đặc thù của bào tử đảm – là yếu tố sinh sản hữu tính của nấm Đảm (Basidiomycetes) mà ngày nay hầu hết các nhà nấm học đều công nhận Tuy nhiên trong những năm qua tình trạng phân loại - hệ thống học của họ Ganodermataceae Donk như cố Giáo sư Zhao Ji-Ding (1916-1995) nêu rõ là đang rơi vào những khó khăn và hỗn độn trong toàn bộ các loài nấm nhiều lỗ (Đa khổng khuẩn - Polyporoid) Trên thực tế việc định loại các loài Linh chi rất dễ nhầm lẫn bởi những biến hóa đa dạng hình thái thể quả và cấu trúc hệ sợi

Trên thế giới cũng như nước ta, trong những năm gần đây, đã và đang trong tiến trình tích hợp phân tích nhiều dẫn liệu cấu trúc gen ribosom cho nghiên cứu đa dạng sinh học Gen được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu phân loại nấm nói chung và phân loại các loài Linh chi Ganoderma nói riêng là các gen ribosom ( rADN) nhân và ty thể bao gồm các vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) và vùng phân ly D2 của gen mã hoá cho rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-D2) Đây là một phương pháp phân tích hệ gen tương đối đơn giản và nhanh chóng Do vậy nhằm mục đích định loại chính xác hơn và đánh giá quan hệ phát sinh chủng loại của họ Ganodermataceae, chúng tôi kết hợp phương pháp phân loại dựa vào dẫn liệu hình thái kinh điển và phân tích cấu trúc DNA nhằm làm sáng tỏ hệ thống phân loại phức tạp của họ này

Chính vì vậy, Chuyên luận “Xây dựng hệ thống học chủng loại phát sinh của họ nấm Linh chi Ganodermataceae Donk” , trên cơ sở hình thái giải phẫu và cấu trúc gene (rDNA): thẩm định vị trí của nhóm Hoàng chi Tomophagus (tách ra từ chi Ganoderma) với 1 đại diện mới phát hiện ở Vườn Quốc gia Cát Tiên, phân tích quan hệ của loài Linh chi đỏ tím Humphreya endertii ở Thác trời Cát tiên (= Ganoderma endertii) - phát hiện bổ sung mới ở Việt Nam, Linh chi đỏ ống to Haddowia longipes (= Amauroderma longipes) vùng Nam Cát tiên – Mã đà và với các taxon gần gũi thuộc chi Ganoderma, Amauroderma,… của họ nấm Linh chi Ganodermataceae được tiến hành Qua đó xác định củng cố mức bậc taxon của chúng Đồng thời nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng công nghệ hóa chủ động trên các nguồn cơ chất phụ phế liệu nhằm bảo tồn nguồn gen, cung cấp dược liệu quý và góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường

Các cộng tác viên tham gia ít nhiều đã đóng góp cho chuyên luận này: Lý Xuân Quang, Hoàng Tấn Lộc, Lê Viết Ngọc, Trần Hữu Độ, Phạm Ngọc Dương, Nguyễn Thị Thường Anh, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Huấn, Bùi Thị Minh Hải, Huỳnh Tấn Mẫn, Nguyễn

Lê Quốc Hùng, TS Lê Thị Thanh Huyền, GS.TS Jean-Marc Moncalvo, TS Dentinger M Bryn và TS Dirk Stubbe từ các cơ quan phối hợp: Trung tâm Hạt nhân Tp Hồ Chí Minh,

Sở Khoa học & Công nghệ Lâm đồng, Đại học Nha trang, Đại học Dalat, Vườn Quốc gia Cát tiên, Đại học Toronto, Canada, Đại học Gent, Vương quốc Bỉ Đặc biệt sự giúp đỡ tận tình và hiệu quả của Công ty Sinh học Công Thành, Long khánh, Đồng nai và trực tiếp cá nhân ông Bùi Quang Trung Chủ tịch Hội đồng quản trị đã góp phần cho nhiều kết quả tốt Công trình này là một trong những dấu ấn tri ân cho một thời cộng tác của chúng tôi

Trong sách này chúng tôi tạm thời dẫn ra khỏang 50 lòai đã được nghiên cứu, nuôi trồng ít nhiều để thể hiện phần nào đa dạng sinh vật – tài nguyên nấm Linh chi ở Việt nam Theo ước tính của chúng tôi, nước ta có khỏang >60 lòai nấm Linh chi, vì chỉ riêng vùng Cao nguyên Lâm đồng và Đồng nai (chưa tính hết Tây nguyên) đã có >50 lòai; vùng Thừa Thiên Huế (chưa tính hết miền Trung bộ) đã có >30 lòai; vùng Bắc bộ (nhất là vùng Tây bắc, Việt bắc và Đông bắc) cũng không ít hơn 30 lòai Nếu tính các vùng sinh thái – địa lý khác nữa và cứ dự kiến độ trùng lặp khỏang 50-60%, thì con số 60 lòai là hòan tòan tin cậy trong tầm tay, nếu được khảo cứu đầy đủ từ nay đến năm 2010 (xin lưu ý là tòan Trung quốc cũng chỉ có liệt kê khỏang 100 lòai, với độ trùng lặp được ước tính là 35%, nghĩa là cũng chỉ có 60-70 lòai thực – chỉ tương đương với Việt nam mà thôi!) Thật ấn tượng khi so với thế giới: ~200 lòai, với >400 tên gọi, mà theo Moncalvo & Ryvarden (1997) bị nhầm lẫn, trùng lắp rất nhiều, thực tế các bộ mẫu vật chỉ bao hàm trong khỏang 150-200 lòai là tối đa Như thế Việt nam chiếm khỏang 1/3 với không ít lòai mới, đặc hữu! Nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt nam sẽ là một công trình rất khó khăn, song tuyệt thú và có giá trị khoa học, kinh tế to lớn

Những sơ sót, khiếm khuyết trong quá trình khảo cứu nấm Linh chi ở Việt nam của các nhà nghiên cứu đương nhiên là khó tránh khỏi, kể cả trong quá trình biên soạn tập chuyên khảo này Kính mong nhận được sự chỉ dẫn, hợp tác chân thành và trợ giúp xa gần.

Trở lại Dalat, 8/2008 Nhớ về Hà nội – dâng tặng 1000 năm Thăng long 10/10/2010

kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử, chủ yếu là hóa sinh và công nghệ gen vào mục đích nghiên cứu đa dạng sinh học, nghiên cứu mối quan hệ tiến hoá giữa các loài, hình thành

chủng loại phát sinh,… Mặc dù mới ra đời nhưng các hướng này đã sớm trở thành hệ thống phương pháp nghiên cứu hiệu quả, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp cổ điển, bổ sung xác định các dẫn liệu khoa học có tính bản chất và tính quy luật hơn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Nghĩa là chúng ta có thể tiến gần hơn đến các hệ thống tự nhiên

I 1 HỆ THỐNG HỌC NẤM ĐẢM BASIDIOMYCETES TRÊN CƠ SỞ TỔNG HỢP CÁC DẪN LIỆU VỚI GIẢI TRÌNH TỰ ADN

Có lẽ Giải Nobel Sinh – Y học vào năm 1980 trao cho Woese về thành tựu ứng dụng phương pháp giải trình tự ADN trong nghiên cứu chủng lọai tiến hóa làm sáng tỏ nguồn gốc và sự phân hóa các nhóm vi sinh vật (theo Woese, Kandler và Wheelis, 1992) đã mở đầu cho kỷ nguyên hệ thống học phân tử Có thể nói cách đây 25 năm phương pháp giải trình tự acid nucleic đã mở đầu cho kỷ nguyên hệ thống học phân tử – hệ thống học chủng loại phát sinh, đặc biệt cho nấm Đảm (Basidiomycetes)

Công trình tiên phong công bố trên Nature của Walker và Doolittle (1982) về giải trình

tự đoạn 5S của gene ribosome (rARN) ở 8 loài thuộc hai nhóm Dị đảm (heterobasidiomycetes) và Đồng đảm (homobasidiomycetes), đã phác họa được quá trình tiến hóa phân ly của chúng trong giới nấm (Hình 1.1) Những thành tựu này được thừa nhận là thuyết phục và phù hợp với các dẫn liệu phân tích hình thái giải phẫu tinh vi mô tế bào, đặc biệt là thể hiện rõ có bước nhảy tách ly trong phân hóa kiểu lỗ và vách ngăn trong sợi nấm

Ngay sau đó, Templeton ở Đại học Washington, Missouri (USA) đã phân tích trên Nature (1983) tính cách mạng của công trình này, sau khi được Walker và Doolittle kiểm chứng thêm với hơn 20 loài nữa Họ chứng minh được bản chất tổ tiên chung của chúng

Hình 1.1 Quan hệ chủng lọai phát sinh của các nhóm nấm Đảm

(trên cơ sở các dẫn liệu 5S rADN, Walker và Doolittle, 1983)

Trong 25 năm qua hệ thống học chủng loại phát sinh phân tử trên cơ sở các dẫn liệu ADN đã trở thành trụ cột của nấm học hiện đại Thực vậy, hãy điểm qua tổng quan cơ sở lý luận trong các công trình của Bruns et al (1991) ở Đại học Berkeley, California (USA), Hibbett et al (1992) ở Đại học Harvard (USA) vào thập niên 90 về tiến trình này

Bruns, White và Taylor (1991) ở Đại học Berkeley, California (USA) đã tổng quan về

nền tảng của lĩnh vực hệ thống học chủng loại tiến hóa trên cơ sở giải trình tự ADN Đây là dấu ấn hết sức quan trọng vì sau 10 năm hàng loạt thành tựu gần như một cuộc cách mạng trong toàn bộ các nhóm sinh vật với những kết quả rất thuyết phục và thậm chí bất ngờ

Hình 1.2 Quan hệ chủng loại phát sinh của các nhóm sinh vật (có nấm Đảm)

(trên cơ sở các dẫn liệu 18S rADN: Bruns, White và Taylor, 1991)

Bức tranh chung về tiến hoá của Giới Nấm và vị trí của chúng trong các quần hệ sinh vật trên cơ sở giải trình tự tiểu đơn vị 18S rARN nhỏ trong nhân được đưa ra trong Hình

1.2, đồng thời cung cấp một cái nhìn tổng quát giúp chúng ta nắm bắt được sự phù hợp giữa hiệu quả của các phương pháp phân tích và các mức độ phân loại thích hợp

Toàn bộ các nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của kiểm tra bằng thống kê của giả thuyết phát sinh hình thái Sự tương quan với giả thiết phát sinh hình thái trước hết dựa trên hình thái học, sinh thái học, sinh lý học và dẫn liệu phân tử khác có thể cung cấp thêm

để xác minh sự phát sinh chủng loại ở mức phân tử Qua đây cũng cho chúng ta thấy tiềm năng của kỹ thuật phân tích ADN trong nghiên cứu quan hệ chủng loại phát sinh của các bậc taxon sinh giới (Hình 1.3)

Hình 1.3 Tiềm năng kỹ thuật phân tích ADN trong nghiên cứu quan hệ chủng lọai phát

sinh của các bậc taxon sinh giới (Bruns, White và Taylor ,1991)

Tổng quan của nhĩm các nhà khoa học ở Đại học Harvard (USA) Hibbett D.S et al., 1992, 1994, 1995 sau hơn 10 năm kể từ thành cơng của Walker và Doolittle (1982), với hàng loạt thành tựu mới đã cho chúng ta những phân tích khái quát và sâu sắc về hệ thống chủng loại phát sinh nấm trên cơ sở các phương pháp phân tích ADN

Cũng chính nhĩm Hibbett et al (1997) đã phát triển tiếp các thành tựu này lần đầu tiên xây dựng những nhĩm cơ bản chủng loại phát sinh các nấm nhiều lỗ (Polyporoid fungi), trên cơ sở khảo cứu 62 lồi, sử dụng phân tích tối thiểu tiểu đơn vị nhỏ của gene ribosome

ty thể (mt-rADN) để đánh giá quan hệ phát sinh chủng loại của nấm lỗ Polyporaceae và

phương hướng tiến hố của nấm lỗ trong những taxon khác

Trong đĩ lần đầu tiên thấy được tương quan hệ thống học của nấm Linh chi chuẩn

Ganoderma lucidum (sinh trưởng hàng niên) trong các taxon liên hệ (Hình 1.4), theo đĩ đã thấy sự phân hĩa đa tạp của các chủng địa lý

Giáo sư Vilgalys ở Đại học Duke, North Carolina (USA) là chuyên gia hàng đầu về xây dựng và hoàn thiện phương pháp phân tích ADN trong nấm học đã nêu ra các nguyên lý chặt chẽ và những kỹ thuật chuẩn về phân tích gene ribosome Trong nghiên cứu này đã đưa ra giới thiệu bộ sưu tập một danh sách các của trình tự mồi được dùng

cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự của rADN trong nhân cho tất cả các vùng

của một đơn vị lặp lại của rADN từ hầu hết các nhóm chủ yếu của nấm (đặc biệt là

nhóm nấm thực Eumycota) cũng như các Eukaryota khác Tất cả những mồi này đã được xác định và đã được thử nghiệm dựa trên giải trình tự tiểu đơn vị lớn và nhỏ của ADN từ nấm, các thực vật và các Eukaryota khác Đồng thời, hầu hết những cặp mồi này của các vùng mã hoá nhân rADN (Hình 6) cho phép khuếch đại bất cứ vùng nào mong muốn

Hình 6 Sơ đồ tiêu biểu chỉ rõ các vùng rARN và các mồi đặc hiệu cho từng vùng

(Vilgalys, 2001)

Hình 7 Các mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự của

tiểu đơn vị nhỏ của rADN (17-18S) (Vilgalys, 2001)

Hình 8 Các mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự của

tiểu đơn vị lớn của ARN 25-28S (Vilgalys, 2001)

Internal transcribed spacer (ITS) region primers

Hình 9 Các mồi xuôi và ngược dùng cho phản ứng khuếch đại và giải trình tự vùng

khoảng cách nội phiên mã ITS (Vilgalys, 2001)

Các đoạn rADN thường được chọn đọc trình tự nucleotide là: rADN 5S, rADN 5,8S, rADN 18S, rADN 26S, và ITS Trong đó, vùng ITS có lẽ là vùng ADN được giải trình tự rộng rãi nhất trong giới nấm Nó là vùng tiêu biểu được sử dụng nhiều nhất đối với hệ thống hệ thống học phân tử ở mức độ loài, và thậm chí là trong các loài (ví dụ để xác định các loài địa lý) Bởi vì mức độ biến đổi của vùng ITS cao hơn các vùng gen khác của rADN

Gần đây, để đánh giá tiến trình phát triển của hệ thống học phân tử của nấm, các nhà khoa học Australia đứng đầu là Glen M (2006) đã nghiên cứu chuẩn hóa các kỹ thuật phân tích ADN cơ bản áp dụng cho thẩm định phân loại và chủng loại phát sinh Từ sau công trình nghiên cứu của Brun, White và Taylor, nghiên cứu này đã chỉ ra một loạt các kỹ thuật phân tích ADN là một công cụ rất hữu hiệu trong phân tích giới Nấm Các kỹ thuật này không chỉ giúp thẩm định phân loại nấm mà còn được ứng dụng rộng rãi trong đời sống con người, có thể xác định nhanh chóng và chính xác mầm bệnh

nấm Chúng còn được sử dụng để kiểm tra chất lượng lương thực để phát hiện nấm nhiễm bệnh và xác minh các loài nấm có giá trị cao Bao gồm các phương pháp sau:

* Phương pháp lai Southern blotting:

Phương pháp Southern blotting hoặc dot blotting đòi hỏi phải gắn ghép hệ gen ADN lên một màng, gây biến tính liên kết ADN, sau đó lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Phương pháp này cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó trong một hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò (ADN mẫu dò) đã được đánh dấu (P32) với đoạn ADN có chứa trình tự bổ sung với mẫu đó Đây là một phương pháp chuẩn xác được áp dụng rất thành công trong việc đánh giá tính đa hình của các đoạn giới hạn Do yêu cầu về số lượng tương đối lớn của ADN, phương pháp này không dùng ở quy mô lớn thay thế bằng phương pháp PCR (Glen M., 2006)

Hình 10 Sơ đồ quy trình kỹ thuật Southern Blot (Glen 2006)

* Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR đã được phát triển từ những năm 1980 và đã chuyển sang một bước ngoặc mới cùng với sự phát hiện enzyme ADN polymerase chịu nhiệt được tách từ một

vi khuẩn chịu nhiệt để cho enzyme có thể chịu đựng nhiệt độ yêu cầu cho chu kỳ phản ứng PCR Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗi polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR) Từ khi

ra đời kỹ thuật PCR, người ta đã áp dụng thành công kỹ thuật PCR trong việc đánh giá tính đa hình ADN của sinh vật Đáng chú ý là các phương pháp RAPD, AFLP và Micro satelite Các phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR làm nền nhưng khác ở chỗ là sử dụng các mồi được thiết kế khác nhau

Hình 11 Sơ đồ chu trình PCR (Glen 2006)

Hình 12 Sơ đồ quá trình nhân bản một đoạn ADN xác định bằng PCR

(Glen 2006)

* Giải trình tự ADN (DNA sequencing)

Cuối những năm 70 của thế kỷ trước, các nhà khoa học đã hoàn thiện phương pháp phân tích nhanh trình tự ADN và đã phổ biến rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử trên thế giới Theo phương pháp này, trình tự của hàng trăm bazơ có thể được xác định trên một đoạn gene riêng biệt Sau đó các thông số về trình tự được so sánh và xem xét bằng máy vi tính Phương pháp này đã và đang được sử dụng rộng rãi

để xác định loài và mối quan hệ phát sinh chủng loại của hầu hết các nhóm vi sinh vật và nấm Sau đây là một kết quả giải trình tự ADN ở đoạn tiêu biểu từ 350- 370 nucleotide (Glen M., 2006)

Hình 13 Phổ sơ cấp đọc trình tự cấu trúc ADN (Glen M, 2006)

Cho đến nay đã có hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong nghiên cứu chủng loại phát sinh ở các nhóm VSV, nó bao gồm các kỹ thuật như phân tích trình tự axit amin, thành phần bazơ nitơ của ADN, lai axit nucleic, phân tích đoạn ADN dựa

trên sự đa hình về độ dài các đoạn giới hạn (RFLP), RAPD (đa hình các đoạn ADN

nhân bản ngẫu nhiên, ALFP (sự đa hình chiều dài của các phân đoạn ADN được nhân bản), microsatelite (vi vệ tinh) Sau đây chúng tôi xin điểm qua một số phương pháp đã và đang được áp dụng trong phân loại nấm

* Phương pháp xác định tỷ lệ GC: tỷ lệ (G+C)/(A+T+G+C) có xu hướng không đổi

đối với các loài nhất định và khác nhau giữa các loài Do vậy thành phần (G+C) phản ánh mối quan hệ phát sinh loài Tuy nhiên thành phần (G+C) chỉ giúp phân biệt được hai loài khác nhau mà không xác định được hai chủng có cùng loài hay không vì nếu tỷ lệ (G+C) giống nhau nhưng trình tự khác nhau thì chúng thuộc hai loài khác nhau (Kurtzman C P và Blanz P A, 1998)

* Kỹ thuật RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic ADN – đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên)

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN - đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên) là những đoạn ADN được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng trình tự mồi tổng hợp ngẫu nhiên ngắn (thường gồm 10bp) Các oligonucleotide này được sử dụng như cả mồi xuôi và mồi ngược Những phân đoạn được khuếch đại thường có kích thước từ vài trăm đến vài ngàn cặp bazơ nitơ (bp) Khi phân tích bằng điện di, sự đa

hình của các trình tự ADN giữa các cá thể (Hình 14) sẽ được biểu hiện bằng các băng

điện di tương ứng với kích thước và tốc độ di chuyển trên điện trường khác nhau Sự đa hình được xem là do hoặc sự khác nhau về vị trí gắn mồi là chính, nhưng cũng có thể do các đoạn dài, ngắn khác nhau nằm giữa các vị trí gắn mồi (Spooner D et al., 2005)

Ưu điểm chính của chỉ thị RAPD-PCR là kỹ thuật phân tích tương đối đơn giản và nhanh chóng, chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ cho mỗi phản ứng PCR, trình tự các mồi là ngẫu nhiên ngắn, nên thường có sự đa dạng hệ gen cao Tuy vậy, chỉ thị RAPD-PCR cũng có một số nhược điểm như độ lặp lại thấp Đôi khi tính lặp lại thấp này làm việc trao đổi hoặc so sánh kết quả giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau gặp khó khăn Cũng như các kỹ thuật phân tích nhiều locut khác, chỉ thị RAPD không có đặc trưng locut (Spooner D et al., 2005; Schierwater B và Ender A., 1993)

mẫu dò (probe) và quan sát Nguyên lý của kỹ thuật được tóm tắt như trên hình 15(IPGRI and Cornell University, 2003)

Phương pháp này có thể được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ di truyền, nghiên cứu chủng loại phát sinh, lập bản đồ gen… Tuy vậy, nhược điểm thường gặp của phương pháp này là cần một mẫu phân tích lớn hơn, chi phí phân tích cao và thời gian phân tích dài hơn

H×nh 15 Nguyªn lý cđa kü thuËt RFLP

(IPGRI and Cornell University, 2003)

* Kỹ thuật AFLP

Đa hình độ dài các đoạn khuếch đại AFLP cũng là một phương pháp kết hợp giữa nguyên lý RFLP và PCR Kỹ thuật này cho phép hiện được tính đa dạng về chiều dài các đoạn ADN được nhân bản chọn lọc Nguyên tắc của phương pháp dựa trên việc chọn lọc khuyếc đại bằng PCR những phân đoạn ADN đã được xử lý bằng enzym cắt giới hạn Phương pháp được tiến hành dựa trên 4 bước cơ bản được tóm tắc ởõ Hình 16 như sau:

1 ADN hệ gen hoặc ADNđược xử lý bằng hai ezym cắt giới hạn

2 Gắn oligonucleotide adpter vào hai đầu của ADN đã bị cắt

3 Sử dụng các mồi được lựa chọn khuếch đại ADN đã xử lý đặc hiệu

4 Xác định đa hình bằng phương pháp đồng vị phóng xạ, thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc bằng phương pháp nhuộm bạc

Phương pháp này có thể được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền, lập bản đồ di truyền, Mặc dù có tính đặc hiệu cao nhưng AFLP cũng thường đòi hỏi nhiều thời gian tích dài, nhiều công đoạn và chi phí phân tích cao

Hình 16 Nguyên lý của kỹ thuật AFLP

(IPGRI and Cornell University, 2003)

* Kỹ thuật SSR

Chỉ thị các đoạn trình tự lặp lại đơn giản SSR hay còn gọi là vi vệ tinh (Microsatellites) là một đoạn ADN có sự lặp lại của một trình tự nucleotide đơn giản nào đó Phương pháp này cho phép phát hiện được tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotide đơn giản SSR cũng dựa trên nguyên tắc của PCR và phương pháp điện di trên gel Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số đơn vị lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau khi điện

di trên gel

Phương pháp SSR có thể được sử dụng trong nhiều nghiên cứu di truyền của các quần thể, từ mức độ cá thể đến mức độ loài Tuy nhiên, chỉ thị SSR cũng gặp khó khăn trong nghiên cứu đa hình trên các đối tượng mới vì phải xác định được trình tự ở hai vùng biên đoạn ADN cần phân tích (Spooner D et al., 2005)

Kỹ thuật ISSR

Chỉ thị ISSR tương ứng với đoạn trình tự ADN khoảng 100 - 3000 bp nằm ở giữa hai vùng SSR gần nhau Nguyên tắc của kỹ thuật này là khuếch đại PCR sử dụng mồi dựa trên trình tự của SSR với một số nucleotide được lựa chọn để có thể liên kết được với trình tự ngay sát vùng không lặp lại (khoảng 16 – 18 bp) Các phân đoạn ADN được tạo thành sẽ được phân tách trên gel điện di và được ghi lại bằng sự có mặt hay vắng mặt của các phân đoạn ADN với các kích thước nhất định

ISSR thường được sử dụng trong phân loại học, xác lập quan hệ và bản đồ di truyền Giống với RAPD-PCR, chỉ thị ISSR có nhược điểm là khó phân biệt các phân đoạn khác nhau có kích thước giống nhau và đôi khi độ lặp lại không cao Ưu điểm của phương pháp này cũng là chỉ cần một lượng mẫu nhỏ (Spooner D et al., 2005)

* Kỹ thuật Microarray (microscofic arrays)

Là một kỹ thuật mới rất hiện đại, cho phép cùng một lúc xác định được sự hiện diện và biểu hiện của các gen ở những mô, tế bào đặc trưng

Nguyên lý: gen sẽ được gắn vào lam kính hiển vi (đĩa microarray) ở dạng sợi đơn Mỗi đĩa gắn hàng ngàn gen đến hàng chục ngàn gen Tách ARN thông tin ở các mô tế bào đặc thù được đánh dấu bằng chất nhuộm màu có khả năng phát quang Tiến hành phản ứng lai hỗn hợp ARN thông tin với gen trên đĩa micro array Sau phản ứng lai, rửa sạch các mARN không lai rồi quan sát qua sự phát màu ở điểm lai dưới kình hiển vi Dựa vào kết quả phản ứng lai ta biết được mARN của gen nào đã được xuất hiện trong các điều kiện thí nghiệm Kết quả sẽ phát hiện sược gen nào hoạt động, gen nào không hoạt động (ở các mô tế bào khác nhau cũng như dưới tác động của môi trường khác nhau)

Khả năng ứng dụng: microarray là một công cụ cực kỳ hữu hiệu phục vụ lĩnh vực genom học chức năng (functional genomics), nghiên cứu và xác định chức năng của gen trong genom cho biết tính trạng quan tâm do những gen nào kiểm soát, chức năng của các gen đó ra sao? Tuy nhiên phương pháp này rất tốn đắc tiền Tuy nhiên phổ biến nhất hiện nay là kỹ thuật phân tích trình tự gen rADN đang được sử dụng rộng rãi nhất (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

Hình 1.4 Q uan hệ chủng loại phát sinh của Linh chi chuẩn Ganoderma lucidum trong

các nấm nhiều lỗ (Polypores) theo dẫn liệu ADN

(Hibbett và Donoghue, 1994)

Hình 1.5 Quan hệ chủng loại phát sinh của Linh chi đa niên Ganoderma australe với

các nấm đồng đảm theo dẫn liệu cấu trúc ADN (Hibbett et al., 1997)

Tiếp đó Hibbett et al (1997) trong Kỷ yếu Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ

lại xác định vị trí chủng loại phát sinh của nấm Cổ Linh chi đa niên Ganoderma australe

trong 81 loài nấm đồng đảm liên hệ trên cơ sở các dẫn liệu giải trình tự ADN gene trong

nhân (nu rADN) và gene ty thể (mt rADN) (Hình 1.5)

I.2 HỆ THỐNG HỌC NẤM LINH CHI GANODERMATACEAE DONK TRÊN CƠ SỞ TỔNG HỢP CÁC DẪN LIỆU VỚI GIẢI TRÌNH TỰ ADN

Khởi đầu ứng dụng phương pháp phân tích ADN trong nghiên cứu các taxon nấm Linh chi có thể coi như bắt đầu cách đây 15 năm, tính từ đầu thập niên 90, với hai luận án Tiến

sĩ ở Đại học Quốc gia Đài Bắc, Đài loan

Hseu (1991) trong luận án của mình lần đầu tiên áp dụng phân tích ADN và bào tử cho

8 loài Ganoderma và 1 loài Amauroderma Đồng thời các dẫn liệu phổ isozyme cũng được

khảo cứu Sau đó nhóm này xác định quan hệ chủng loại phát sinh của Linh chi chuẩn G

lucidum complex (Hseu et al., 1995)

Năm 1996, Hseu và cộng sự đã sử dụng trình tự ITS để phân biệt, nhận dạng các mẫu G

lucidum và so sánh với sự phân loại bằng RAPD Một số mẫu có trình tự ITS giống hệt nhau, nhưng lại được phân biệt bằng phổ băng nhân bản đặc trưng tạo ra bởi RAPD Chỉ thị RAPD có thể phân loại hệ thống học ở mức độ phân loại thấp hơn mà không thể phân tích bằng dữ liệu giải trình tự ITS Mặc dù đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử

dụng phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma

Hình 1.6 Phân tích đa hình ADN bằng RAPD cho 5 loài Ganoderma

(Hseu et al., 1995)

Tuy nhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thay đổi ở một số taxon gần nhau Do vậy, nếu chỉ sử dụng kết quả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao

trong phân loại Ganoderma Chỉ thị RAPD-PCR là kỹ thuật phân tích tương đối đơn giản

và nhanh chóng, có thể sử dụng để phân biệt những taxon không thể phân biệt bằng ITS (Trịnh Tam Kiệt et al., 2005)

Tiếp đó Yeh et al (1995, 1996) ở Đài Loan - cũng trình luận án Tiến sĩ năm 1991, đã

xác định mối quan hệ giữa các loài Linh chi hàng niên Ganoderma neo-japonicum với Linh chi đa niên G australe, cũng phân tích kết hợp hình thái bào tử và dẫn liệu trình tự

ADN (Hình 1.7)

Hình 1.7 So sánh loài đa niên (G australe) với loài hàng niên (G neo-japonicum)

(Yeh et al., 1996)

Có thể nhận thấy các công trình của Moncalvo Jean-Marc et al vào giữa thập niên 90

đã xác lập những cơ sở quyết định cho phân tích ADN trong nghiên cứu chủng lọai phát sinh các nhóm Linh chi Cho đến nay đây vẫn là những thành tựu kinh điển nhất về phân

tích ADN các lòai thuộc chi Ganoderma Karst., góp phần kiểm định các quan điểm phân

lọai cổ điển và hệ thống học truyền thống trong họ Linh chi Ganodermataceae Donk Ngay

từ 1994 Moncalvo et al tại Đại hội Nấm học Quốc tế ở Vancouver, Canada đã xác định

vùng rADN được tập trung nghiên cứu - phân tích giải trình tự là ITS1, ITS2 và vùng phân

ly D2

Hình 1 8 Sơ đồ gene ribosom (rADN) chỉ rõ vị trí các vùng bia cho phản ứng khuếch

đại PCR và sequencing (Moncalvo et al., 1995)

Đó là khoảng cách được nội phiên mã 1 (ITS1) và 2 (ITS2) và vùng phân hoá D2 của

gene cho tiểu đơn vị lớn (large ribosomal subunit- LSU-D2)

Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hóa phân tử rADN các nhà khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi So sánh sự khác biệt giữa các vùng này người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi Kết quả phân tích cấu trúc ADN của gen ribosom (các vùng ITS1, ITS2 và vùng phân

hoá D2 của tiểu đơn vị lớn của ribosom LSU-D2) của gần 30 loài Ganoderma và mới chỉ một loài Amauroderma cho thấy các loài Ganoderma khác nằm rải rác gần loài linh chi chuẩn G lucidum Đáng lưu ý là G colossum (chủng Hoàng chi Ganoderma colossum lấy

từ Bắc Mỹ) tách biệt với các loài Ganoderma khác và đồng thời chỉ ra rằng các nhóm loài

Ganoderma có nguồn gốc thuần nhất (monophyletic), nếu không tính đến G colossum (được tách biệt hoặc loại trừ khỏi chi này) Lưu ý rằng G colossum chứa nhiều dẫn xuất

triterpenoid – các colossolactones có hoạt tính dược lý cao

Hình 1.9 Quan hệ chủng loại phát sinh của G microsporum và G colossum với các

loài Linh chi

(dẫn liệu rADN, Moncalvo et al., 1995)

Hình 1.10 Các Colossolactones có khung Triterpenoid tương đồng với các lòai

Ganoderma tách từ nấm Hòang chi Việt nam (chủng Huế)

(Kleinwachter et al., 2001)

Hình 1.11 Phát hiện thêm 4 Colossolactones trong Ganoderma colossum

(chủng Sài Gịn) (El Dine et al., 2008)

Tổng hợp khái quát cấu trúc cơ bản của 10 nhóm hoạt chất được Kim et al (2001) trình bày dưới đây:

Hình 17 Cấu trúc khái quát 10 nhóm Triterpenoid ở Ganoderma lucidum

Phù hợp với quan điểm của Murrill (1905) và chứng minh chi Tomophagus là một chi tách biệt từ Ganoderma Mặc dù mới chỉ một loài của Amauroderma được phân tích nhưng

sự phát sinh chủng loại dựa trên phân tích cấu trúc rADN cũng xác minh sự khác biệt giữa

chi Ganoderma và Amauroderma Đồng thời kết quả phân tích tối thiểu chứng minh

Ganoderma, Amauroderma và Tomophagus là các chi tách biệt Hai chủng của loài G

tropicum (Jungh.) Bres là G tropicum RSH 1111 ở Đài Loan và G tropicum JMM

HK93-9 ở Hồng Kông được xác định là cùng nhóm với G fornicatum Moncalvo et al

(1995, 1996) công bố một lọat kết quả về gần 30 loài Linh chi, kết hợp phân tích nhiều đặc điểm hình thái, sinh lý học, cuối cùng làm nổi bật giá trị hầu như quyết định của dẫn liệu cấu trúc ADN

Nhờ đó khẳng định mối quan hệ rất gần cận (sister relationship) giữa chi Amauroderma Murr và Ganoderma Karst

Hình 1.12 Phân tích so sánh rADN : mức độ tương đồng của dẫn liệu ITS1 và ITS2

(Moncalvo et al., 1995a)

Hình 1.13 Phân tích so sánh rADN (ITS, D2-25S) với một số đặc trưng hình thái

(Moncalvo et al., 1995a)

Tuy nhiên có một điều kỳ lạ là khi áp dụng các dẫn liệu phân tích ADN ribosom, các

tác giả gặp phải tình trạng nhiều chủng loại thuộc Linh chi chuẩn Ganoderma lucidum

(W.Curt.: Fr.) Karst (chủ yếu là các chủng từ các vùng địa lý khác nhau) phải xếp trong một dải rộng, nhiều chủng phải xếp gần các loài rất khác biệt vơi loài chuẩn chẳng hạn

như: G pfeiferii, G oerstedii, Đã có nhiều mô tả khảo cứu về nấm linh chi chuẩn

Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr) Karst - một trong những loài toàn thế giới (cosmopolitan), do vậy, có những sai biệt hình thái ngoài và sự phân ly thành nhiều chủng

Hình 1.14 Phân tích so sánh rADN (ITS,D2) với đặc trưng hình thái - sinh lý

Nhờ vậy đến 1997 Moncalvo và Ryvarden đã thống kê kiểm định danh pháp cho toàn bộ

họ Linh chi Ganodermataceae Donk, nêu ra hàng loạt nhận định nhầm lẫn và áp dụng sai danh pháp các loài, hiện còn rất phổ biến trên thế giới

Theo chương trình hợp tác Việt Nam – Hoa Kỳ, với hơn 20 loài thu thập ở Việt nam và gửi sang Đại học Duke, North Carolina từ 1997-1998, Lê Xuân Thám (1998), Lê Xuân Thám và Moncalvo (1999) đã kết hợp phân tích tiến hóa cấu trúc bào tử đảm và cấu trúc rADN, phát hiện mối quan hệ chủng loại phát sinh chặt chẽ giữa các nhóm hệ thống của cả

4 chi: Amauroderma Murr., Ganoderma Karst., Humphreya Stey và Haddowia Stey với các dạng hình tiến hóa trung gian Điều đáng ngạc nhiên là chính Moncalvo mới chỉ tập

trung phân tích 1 loài Amauroderma rude (có lẽ vì thiếu phân loại hình thái kinh điển, )

Hình 1.15 Quan hệ chủng lọai phát sinh họ Linh chi Ganodermataceae Donk trên cơ

sở phân tích cấu trúc ADN và bào tử đảm (Lê Xuân Thám & Moncalvo, 1999)

Hình 1.16 Quan hệ của các loài trong họ Linh chi Ganodermataceae Donk

(theo các dẫn liệu ADN của gen ribosome: Lê Xuân Thám & Moncalvo, 1999)

Đồng thời cũng ghi nhận rằng Ganoderma tropicum và Ganoderma lucidum có vị trí rất

gần nhau (Hình 1.16)

Cũng phân tích theo định hướng tương tự, nhóm Gottlieb et al ở Argentina từ

1998-2000 đã chứng minh mối quan hệ giữa phân hóa cấu trúc bào tử đảm và cấu trúc ADN các

loài Ganoderma ở Nam Mỹ (Hình 1.17, 18)

Hình 1.17 Phân tích so sánh ITS1, ITS2 của các loài Ganoderma Nam Mỹ với 7 loài

khác cho thấy mức độ tách biệt ở các phân chi (subgenus)

(Gottlieb et al., 2000)

Hình 1.18 Phân tích so sánh ITS1, ITS2 với hình thái các loài Ganoderma Nam Mỹ:

tách biệt rõ ở các phân chi (subgenus)

(Gottlieb et al., 2000)

Nhóm nghiên cứu ở Australia đã nghiên cứu về 5 loài Ganoderma ở Australia và tổng

hợp tư liệu phân tích ADN của hàng chục loài Linh chi khác: Smith & Sivasithamparam

(2000) Rõ ràng là G lucidum có nhiều chủng địa lý phân ly tách biệt khá mạnh Trong đó

cũng thấy mối quan hệ rất gần cận của Linh chi nhiệt đới G tropicum (rất phổ biến ở Nam Trung Quốc và Đông Nam Á) với loài chuẩn G lucidum

Hình 1.19 Nghiên cứu ITS 5 loài Ganoderma ở Australia so sánh tổng hợp với các loài

khác đã được phân tích

(Smith & Sivasithamparam, 2000)

Trong luận án Tiến sĩ, Soo-Gyu Hong năm 1999 ở Đại học Seoul, Hàn Quốc cũng phân

tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các nhóm Ganoderma dựa trên phân hóa cấu

trúc ADN ty thể: giải trình tự mt SSU rADN

Hình 1.20 Sơ đồ tiêu biểu cho gen ADN ty thể (mtADN) chỉ rõ vị trí các vùng bia cho phản ứng khuếch đại PCR và sequencing - Đó là vị trí của chín vùng phân ly (V1-V9)

của tiểu đơn vị nhỏ của ribosome (small ribosomal subunit- SSU)

(Hong & Jung, 2004)

Trong đó, tương tự như Moncalvo (1994), đã chỉ ra rằng G colossum có mối quan hệ xa với các loài Ganoderma khác Khoảng cách bậc phân loại giữa G colossum với các nhóm

Ganoderma khác là lớn hơn hai lần so với giữa các nhóm Ganoderma hoặc là giữa các nhóm Ganoderma và Elfvingia Vì vậy, dựa vào các đặc điểm khác biệt về hình thái học

thì nên tách ra thành Tomophagus colossus (Fr.) Murr Tuy nhiên, Hong cũng chưa kết

luận về mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài Ganoderma và vị trí của G

colossum Đến năm 2004, trên tạp chí Mycologia, Hong và Jung đã phân tích phát sinh chủng loại dựa trên kết quả của luận án tiến sĩ năm 1999 Trong nghiên cứu này đã đưa ra

các kết quả về mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài Ganoderma dựa trên gần như

hoàn toàn giải trình tự của các mt - SSU ADN

Tuy nhiên chi Tomophagus được coi là đồng nghĩa với chi Ganoderma bởi vì sự khác

nhau chủ yếu giữa hai chi này bị hạn chế về các đặc điểm hình thái đại thể (Furtado 1965, Ryvarden 1991, Steyaert 1972) Chúng lại gần nhau về thành phần hoạt chất nhóm Triterpene (Kleinwachter et al., 2001; Ofodile et al., 2005; Eldine et al., 2008) Đáng lưu ý

là những phân tích này đều lấy mẫu nguyên liệu (G colossum) từ Việt Nam, chỉ có 1 mẫu

lấy từ Nigeria, châu Phi

Hình 1.21 Quan hệ chủng loại phát sinh của các loài Ganoderma dựa trên dẫn liệu

mtADN đồng thời chỉ rõ vị trí của Ganoderma colossus

(Hong & Jung, 2004)

Kết quả phân tích phát sinh chủng loại các loài Ganoderma được phân chia thành sáu nhóm đơn nguồn gốc (monophyletic) Nhóm I: G colossus, nhóm II: G applanatum, nhóm III: G tsugae, nhóm IV; G lucidum Asia, nhóm V: G meredithiae và nhóm VI: G

resinaceum (Hình 21) Ganoderma colossus (Fr.) C F Baker được xếp thành một dòng

tách biệt với các nhóm khác và đứng gần với các loài cổ linh chi Ganoderma applanatum

Kết quả giải trình tự của vùng V4 và vùng V6 cho thấy các chủng của loài Ganoderma được xếp theo nhóm với nhau và G colossus có trình tự giống với G lucidum, và rõ ràng khác với G applanatum và G lobatum (Hình 1.22 và Hình 1.23), thế nhưng các tác giả lại

không xếp chúng gần nhau, phải chăng nếu dựa vào kết quả giải trình tự của vùng V4 và

V6 thì chưa đủ để xác minh mối quan hệ vị trí của G colossus Tomophagus colossus là loài duy nhất được mô tả trong chi Tomophagus Murrill, phân biệt khá rõ với các loài

Ganoderma khác do có lớp thịt nấm rất dày, trắng mềm nhũn khi tươi và xốp nhẹ khi khô (Moncalvo & Ryvarden 1997, Ngô Anh, 2003, Al Bary et al., 2003, Wu & Zhang, 2003,…)

Hình 1.23 C ấu trúc thứ bậc của vùng V6 - mối quan hệ phát sinh chủng loại của các

lòai Ganoderma (Hong & Jung, 2004)

Bề mặt vàng láng bóng, bào tử lớn có vách dày với tầng cột đội ra lớp vỏ ngoài Việc tạo

lập chi Tomophagus Murrill (1905) là dựa vào thể quả mềm, xốp, thịt nấm có màu sáng và

bở, chất hơi bột và bết như phó mát Vị trí quan hệ chủng loại phát sinh của Ganoderma

colossum (Moncalvo et al., 1995) = G colossus (Hong và Jung, 2004) tách biệt rõ với các

loài Ganoderma khác, tuy nhiên chúng vẫn nằm gần cận Kết quả của hai tác giả này là phù hợp với nhau vì đều lấy mẫu từ chủng ở Bắc Mỹ

Mới đây nhóm phối hợp Australia và Indonesia do Glen (2006) đứng đầu đã thu được

kết quả rất ly thú về quan hệ chủng loại phát sinh các loài Ganoderma và đặc biệt là đã

phân tích tới 3 loài thuộc chi Amauroderma (lưu ý rằng mới chỉ có 3 loài như vậy là quá ít

vì trên thế giới có tới gần 30 loài thuộc chi này, đây còn là khoảng trống rất lớn có ý nghĩa quan trọng đòi hỏi phải nghiên cứu tiếp tục) (Hình 1.24)

Đa dạng sinh học họ nấm Linh chi Ganodermataceae Donk, với gần 200 loài trên thế

giới (nhiều vùng còn chưa được khảo cứu), đặc biệt các loài thuộc chi Ganoderma Karst

đã được Buchanan (2001) tổng kết trong một công trình tổng quan quan trọng tại Hội nghị Quốc tế về Linh chi ở New Zealand

Trong đó, riêng Trung Quốc đã phát hiện tới gần 100 loài (Zhao et Zhang, 2000), đảo Hải Nam tới 78 loài (Wu et al., 1998), mới bổ sung thêm ở Trung Quốc (Wu & Dai, 2004), lên tổng số gần 110 loài Theo thống kê danh lục ở Việt Nam, Trịnh Tam Kiệt (2001) nêu tên gần 40 loài (mô tả 3 loài), Ngô Anh (2003) tìm thấy ở vùng Thừa Thiên Huế tới 36 loài (mô tả 6 loài),…

Gần đây tại Đại hội Nấm y học quốc tế (IMMC) ở Seattle (USA), GS Moncalvo (2005)

đã trình bày một công trình đang tiến triển về phân tích ADN gần 50 loài Ganoderma (tiếc rằng cũng chỉ có vài loài Amauroderma được khảo cứu, chủ yếu do Lê Xuân Thám cung

cấp), kết hợp các dẫn liệu phân tích các đặc trưng phân hóa bào tử đảm của Lê Xuân Thám (1998), đã đi đến giả thiết táo bạo cho rằng nguồn gốc họ Linh chi Ganodermataceae Donk

có lẽ phát xuất từ châu Phi?

Hình 1.22 Cấu trúc thứ bậc của vùng V4 ở các loài Ganoderma - mối quan hệ phát

sinh chủng loại (Hong & Jung, 2004)