Giới thiệu về máy sắc ký

Giới thiệu chung về sắc ký:1.1.Định nghĩa sắc ký: Định nghĩa của Mikhail S.Tsvett 1996: Sắc ký khí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một được táchtrên một cột hấp thụ đặt t

1 Giới thiệu chung về sắc ký:

1.1.Định nghĩa sắc ký:

Định nghĩa của Mikhail S.Tsvett (1996):

Sắc ký khí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một được táchtrên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy

Định nghĩa của IUPAC (1993):

Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bốgiữa 2 pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển đọngtheo một hướng xác định

Định nghĩa hiện đại: sắc ký là một phương pháp tách dựa trên sự phân bốkhác nhau của chất cần phân tích giữa pha động và pha tĩnh từ đó tách cácthành phần trong hỗn hợp

1.2 Phân loại:

Phân loại dựa vào cơ chế hoạt động của sắc ký gồm có: hấp phụ, phân bố,trao đổi ion, sắc ký rây phân tử … và vào tính chất của pha tĩnh cũng nhưphương pháp thể hiện sắc ký Ví dụ

- Phương pháp sắc ký lỏng rắn trên cột, phương pháp sắc ký phân bốkhí lỏng trên cột

- Phương pháp sắc ký phân bố lỏng lỏng trên bảng phẳng 2 chiều

- Phương pháp sắc ký phân bố lỏng lỏng pha ngược áp suất cao trêncột…

Cơ chế sắc ký có nhiều nhưng để thực hiện quá trình sắc ký thì có 2 dạng:dạng cột và dạng bản phẳng (bản kính, polime, giấy, kim loại)

Thông thường để đơn giản hóa thì người ta gọi tắt các phương pháp sắc kýlà: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel

Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong hỗn hợp mẫuđược vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh Mẫu đi vào tướng động đượcmang theo dọc hệ thống sắc ký (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bốđều khắp.

Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim đượcphủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc bề mặt rắn Sự tương tác xảy ra giữacấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử được phân bố ở pha động và pha tĩnh

Sự ái lực khác nhau của chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển vớinhững tốc độ khác nhau trong pha động của hệ thống sắc ký Kết quả làchúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quátrình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh

Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn

ra sau dưới dạng các đỉnh (peak) tách riêng lẻ tùy thuộc vào cách tiến hànhsắc ký và được hiển thị dưới dạng sắc ký đồ

2.2.Sắc phổ

Trong quá trình sắc ký, bằng cách nào đó ta có thể ghi được sự phân bốnồng độ các cấu tử dọc theo cột hoặc trên mặt phẳng ta thu được một đườngcong gọi là sắc phổ

2.3.Sắc ký đồ

Đường biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ chất đi ra khỏi cột sắc ký theothể tích dung môi rửa giải hoặc thời gian rửa giải được gọi là sắc ký đồ

Hình 1: sắc ký đồ phân tích EtHg trên ICP-MS2.4.Các loại đầu dò dùng trong sắc ký:

- Một số loại đầu dò thường dùng là FID, NPD, FPD, ECD, TCD, đầu

dò UV-VIS và đầu dò chỉ số khúc xạ RID …2.5.Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong sắc ký:

2.5.1 Peak sắc ký

2.5.2 Thời gian lưu, thể tích lưu

- Thời gian lưu(tR): là thời gian từ lúc tiêm mẫu đến lúc ghi nhận đượccực đại các mũi sắc ký, thường dung trong định danh (giây, phút) Từđây suy ra thể tích lưu VR

- Thời gian lưu chết (tM): là thời gian một chất hoàn toàn không tươngtác với pha tĩnh (không bị pha tĩnh giữ lại) đi qua cột đó cũng là thờigian di chuyển của pha động từ đầu cột đến cuối cột, còn gọi là thờigian chất phân tích được lưu giữ trong pha động => VM: thể tích lưuchết

- Thời gian lưu hiệu chỉnh (t’

R) là thời gian chất bị lưu giữ trong phatĩnh, được tính theo công thức: t’

R = tR - tM => V’

R = VR - VM

- Thời gian chất phân tích được giữ trong pha động là giống nhau ở tất cả cácchất, các chất phân tích chỉ khác nhau ở thời gian chất phân tích bị lưu giữtrên pha tĩnh (t’

R)

2.5.3 Hệ số phân bố K, tỉ số phân bố k

Hệ số phân bố K:

CM: là nồng độ của chất tan trong pha động

CS: là nộng độ của chất tan trong pha tĩnh

K tùy thuộc vào bản chất của chất tan và, bản chất 2 pha tĩnh, động

Tỉ số phân bố k:

K =

nS: số mol của chất tan trong pha tĩnh

nM: số mol của chất tan trong pha động

Ý nghĩa của hệ số phân bố K:

- Hệ số phân bố K là đại lượng đại diện cho cân bằng động của chấtphân tích trong hai pha là pha tĩnh và pha động

- K càng lớn thì chất phân tích càng bị giữ lại mạnh

- K tùy thuộc vào bản chất của chất tan, pha tĩnh, pha động và nhiệt đọ,không phụ thuộc vào đặc tính của cột sắc ký (kích thước hạt, chiều dàicột)

- Để thay đổi K ta thường thay đổi thành phần của pha động

2.5.4 Hệ số chứa (dung lượng hay hệ số lưu)

- K’ tùy thuộc vào bản chất của chat tan, pha tĩnh, pha động, nhiệt

độ và đặc tính của cột sắc ký (kích thước hạt, chiều dài cột)

- Pha động có năng suất rửa giải càng mạnh, K’ càng nhỏ, cácpeak càng ra nhanh và càng gần nhau.

- Khi K’ > 1 thì chất tan có ái lực với pha tĩnh lớn hơn pha động

- Mối liên hệ tR = tM(1 + K’) => K’ tang, tR và VR tang.2.5.5 Thuyết đĩa về tách sắc ký

Đĩa lý thuyết là một lát mỏng của cột sắc ký (gồm 2-3 lớp hạt) trongmỗi một đĩa thiết lập một cân bằng giữa các pha tĩnh và pha động

Số đĩa lý thuyết là số đo hiệu quả của cột

N = Trong đó: L: là chiều dài cột sắc ký và H là chiều cao đĩa lý thuyết

Hay

• Ý nghĩa của thuyết đĩa về tách sắc ký

- Khi tang hiệu quả cột thì H giảm đi có nghĩa là H càng bé thì sốđĩa lý thuyết càng nhiều

- N càng lớn bề rộng đáy càng nhỏ Cùng thời gian lưu, một cộtchứa nhiều đĩa lý thuyết thì bề rộng đát càng nhỏ tức mũi càngnhọn

- Chiều cao đĩa lý thuyết H đặc trưng cho độ hiệu nghiệm của cột,nghĩa là peak sắc ký rộng hay hẹp, chiều cao đĩa lý thuyết chưacho biết khả năng tách

- Số đĩa càng lớn thì hiệu năng tách càng cao

- Sắc ký lỏng có số đĩa lý thuyết nhỏ hơn 20000

- Sắc ký khí có số đĩa lý thuyết lớn hơn vài tram ngàn

2.5.6 Độ chọn lọc α:

Ý nghĩa hệ số phân giải:

- Hệ số phân giải là một đại lượng dùng để đánh giá hai peak liên tiếp

có thể tách được hay không Để tăng Rs có thể tăng ∆tR hoặc giảm W2

và W1

- Để tách được thì Rs > 1 Để phân tích định lượng chính xác thì cácmũi sắc ký phải tách xa nhau hoàn toàn Do đó cần chọn điều kiện saocho Rs của các cặp phải thỏa mãn Rs > 1,5 thì phân tích mới chính xác

3 Sắc ký khí

3.1 khái niệm:

Cơ sở để tách bằng sắc ký khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: phatĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua toàn bề mặt tĩnh đó.Nếu pha tĩnh là rắn thì gọi là sắc ký khí-rắn.Chất rắn nhồi cột thường làsilicagel, rây phân tử hoặc than hoạt tính Quá trình này chủ yếu là hấp phụ.Nếu pha tĩnh là lỏng, ta có sắc ký khí-lỏng Chất lỏng bao bọc quanh bề mặtmột chất rắn trơ, gọi là chất mang, tạo nên một lớp phim mỏng Cơ sở cho

sự tách ở đây chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏngnày

3.2 Thiết bị:

3.2.1 Hệ thống cung cấp khí mang:

Các khí mang phải trơ về mặt hóa hoc như He, Ả, Ns, CO2 và H2 và việc lựachọn khí mang thường được quyết định bởi loại detector sử dụng.

Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressureregulators), các thiết bị đo áp suất (gauges) và thiết bị đo tốc độ dòng

Hệ thống khí mang còn chứa một hệ thống lọc phân tử để tách nước và cácchất nhiễm bẩn khác

Tốc độ dòng được kiểm soát bởi các bộ điều chỉnh áp suất hai giai đoạnđược lắp vào các bình chứa khí mang

Áp suất của khí vào thiết bị nằm trong khoảng từ 10 đến 50 psi để có tốc độdòng từ khoảng 30 đến 150ml/min đối với cột nhồi và khoảng từ 1 đến25ml/min đối với cột mao quản Nói chung, nếu áp suất đi vào thiết bị khôngđổi thì tốc độ dòng sẽ không đổi Để đo tốc độ dòng khí người ta dùng thiết

bị đo tốc độ dòng (flowmeter) với bọt xà phòng và đồng hồ bấm giây

3.2.2 Hệ thống tiêm mẫu:

Các thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vilượng (microsyringe) để tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao susilicon (septum) chịu nhiệt vào một buồng hóa hơi )injector) Buồng nàyđược đốt nóng với nhiệt độ thích hợp và được nối với cột tách

Đối với các cột tách thông thường, cỡ mẫu thường thay đổi từ một vài đến20µl Cột mao quản đòi hỏi lượng mẫu đưa vào nhỏ hơn nên trong trườnghợp này hệ thống chia dòng mẫu được thiết kế trong bộ injector được sửdụng để chỉ giao một phần nhỏ lượng mẫu được tiêm đi vào cột, phần còn lạiđược thải ra ngoài

Kỹ thuật tiêm mẫu

- Hút dung dịch mẫu vào bơm tiêm và điều chỉnh dung dịch đến vạchrồi kéo ngược pít-tông ra sau để lượng mẫu đó chuyển hết vào thânbơm tiêm (đầu kim rỗng) Sau khi xuyên qua lớp đệm cao su silic củainjector để yên khoảng 3 đến 5 giẩy để kim được cân bằng nhiệt độtrong injector rồi mới đẩy pít-tông Cách này giúp tránh một số cấu tử

khó bay hơi còn đọng lại ở đầu kim gây sai số khi định lượng nhữngcấu tử này.

- Tiêm mẫu có chia dòng (split injector):

Thích hợp cho mẫu có các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn 0.1%mẫu

Với các phân tích có độ phân giải cáo, các kết quả tốt nhất thu đượccho lượng nhỏ nhất của mẫu (≤ 1µl) tiêm vào có thể dò tìm khoảng ≤1mg cho mỗi cấu tử

Việc tiêm toàn bộ mẫu sẽ làm quá tải cột có đường kính 0.32mm hoặcnhỏ hơn Trong khi đó tiêm mẫu có chia dòng chỉ đưa vào cột khoảng0.2 đến 2% lượng mẫu mẫu được tiêm nhanh (< 1s) qua lớp đệm cao

su silic (septum) vào vùng hóa hơi của hệ thống tiêm mẫu (injector)được giữ ở nhiệt độ cao (ví dụ ở 350oC) để quá trình bay hơi mẫu diễn

ra nhanh Một dòng chảy mạnh của khí mang lôi kéo mẫu qua buồngtrộn, ở đó có sự hóa hơi hoàn toàn và hòa trộn tốt Tại điểm chia dòng,một phần nhỏ của hơi đi vào trong cột sắc ký còn phần lớn qua vanchia dòng đến lỗ thoát khí thải Tỉ lệ của mẫu không được giới thiệuvào cột được gọi là tỉ số chia dòng (split ratio) có giá trị từ 50:1 đến600:1 Sau khi mẫu bị đưa ra khỏi buồng tiêm mẫu (khoảng 30 s), vanchia dòng đóng lại và khí mang được giảm tương ứng Một µl chấtlỏng được tiêm vào sẽ tạo khoảng 0.5 ml thể tích khí và nhanh chónglàm đầy buồng tiêm mẫu Vài khí có thể thoát ra trở lại theo đườngcủa đệm cao su silicon Các cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sẽ thoát ra đầutiên rồi đến các cấu tử có nhiệt độ sôi cao hơn Nhiệt độ của buồngtiêm mẫu nên đủ lớn để giảm thiểu phần mất này của mẫu Tuy nhiênnếu nhiệt độ quá cao, sự phân hủy mẫu có thể xảy ra Trong suốt quátrình tiêm mẫu và sắc kí, có dòng khí 1ml/ph làm sạch lớp đệm cao su

silicon để tách hơi mẫu dư và các khí thoát ra từ lớp đệm cao su này(septum purge).

- Tiêm mẫu không chia dòng (splitless injection):

Thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng độ nhỏ hơn0.01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80 % mẫu được giới thiệuvào cột Hệ thống tiêm mẫu tương tự như trường hợp tiêm mẫu chiadòng (hình 2), nhưng ống thủy tinh trong buồng tiêm mẫu là thẳng,trống và không có buồng trộn mẫu Một thể tích lớn (khoảng 2 µl) củadung dịch được pha loãng trong dung môi có nhiệt độ sôi thấp đượctiêm chậm (khoảng 2s) vào trong ống thủy tinh của buồng tiêm mẫuvới lỗ thoát chia dòng bị đóng Nhiệt độ của buồng tiêm mẫu cho chế

độ không chia dòng giữ thấp hơn (khoảng 220oC) so với chế độ chiadòng vì mẫu bị lưu giữ lâu hơn trong buồng tiêm mẫu và tránh mẫu bịphân hủy nhiệt

3.3 Cột sắc ký:

3.3.1 Giới thiệu

Trong thực tế có nhiều dạng cột tách khác nhau nhằm thỏa mãn cácmục đích nghiên cứu Nói chung, cột tách sắc kí cần thỏa mãn các yêucầu sau:

− Đảm bảo trao đổi chất tôt giữa pha động và pha tĩnh nhờ việctối ưu hóa các thông số của phương trình Van Deemter

− Độ thấm cao tức có độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khímang nhất định

- Khả năng tải trọng cao của cột

- Có khoảng nhiệt độ sử dụng rộng và chịu được nhiệt độ cao

3.3.2 Cột nhồi:

Cột thường được làm bằng thép không rỉ, nicken, thủy tinh với đườngkính khoảng từ 3 đến 6 mm và chiều dài khoảng từ 1 đến 5 m Cộtnhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặcbản thân hạt rắn là pha tĩnh Chất mang rắn thường là diatomite đãđược silan hóa để giảm liên kết hydro với các chất phân cực:

Kích thước hạt đồng nhất sẽ làm giảm chiều cao cột và tăng độ phângiải Cở hạt nhỏ sẽ làm giảm thời gian cân bằng hòa tan nhờ vậy làmcải thiện hiệu quả của cột Tuy nhiên, nếu kích thước hạt càng nhỏ thìcàng ít không gian trống giữa các hạt và áp suất để ép pha động quacột hải càng cao Kích thước hạt được biểu diễn theo micromet hoặc

cở mesh, tức là cở lưới mà hạt có thể đi qua hoặc bị giữ lại trên sàng

Ví dụ các hạt cở 80/100 mesh đi qua được cở sàng 80 mesh (170µm)nhưng không đi qua được cở 100 mesh (150 µm) Yêu cầu của chất

mang rắn là không tham gia vào sự tách và có khả năng giữ được phatĩnh (không ít hơn 10 %)

- Một số loại chất mang rắn:

Có hai điều quan trọng cần chú ý khi chọn một chất mang là: cấu trúc

và đặc tính bề mặt Cấu trúc góp phần vào hiệu quả của chất mang,trong khi các đặc trưng bề mặt chi phối sự tham gia của chất mangvào kết quả của việc tách Các chất mang phải là các chất trơ về mặthóa học với tất cả các loại mẫu Nó nên có diện tích bề mặt lớn để phalỏng có thể trải thành một lớp phim mỏng và cấu trúc bề mặt phảithích hợp để lưu giữ lớp phim mỏng đó Tuy nhiên, diện tích bề mặtlớn không là điều đảm bảo cột hiệu quả Hầu hết các chất mang trongsắc ký cột nhồi được tạo từ diatomite

Hầu hết các chất mang trong sắc ký cột nhồi được tạo từ diatomite:Thứ nhất, tương tác bề mặt chất mang (hấp phụ hoặc xúc tác) chính lànguyên nhân gây ra những peak có đuôi hoặc biến dạng Chính nhữngnhóm -OH hay oxit trên bề mặt chất mang là nguyên nhân của nhữngtương tác đó Có thể che các nhóm này bằng một lượng nhỏ pha lỏngphân cực Nhưng cách tốt nhất hiện nay là silan hóa với các thuốcthử DMCS (dimethyl dichorosilan) hoặc HMDS (hexamethyldisilazane) Thứ hai, kích thước hạt càng nhỏ thì số hạng A trongphương trình Van Deemter càng nhỏ, nhưng sự chệnh lệch áp suấttrong cột sẽ tăng vượt khỏi giới hạn làm việc thực tế Hiệu suất cộtchỉ có thể cải thiện nếu dùng các hạt có kích thước như nhau

- Tỉ lệ phần trăm pha lỏng

Lượng chất lỏng cần phải đủ để bao bọc các hạt bằng một lớp mỏngđồng nhất Pha lỏng quá nhiều sẽ đọng lại ở những chỗ trống giữa cáchạt làm giảm hiệu suất cột Trên chất mang Chromosrb khi tỉ lệ phalỏng lớn hơn 30% hiệu quả của cột giảm đi rất nhiều Trước đây

người ta hay tẩm 15-30% chất lỏng, nhưng hiện nay có khuynh hướngchỉ tẩm 2-10% Vì thời gian lưu tỉ lệ với lượng pha lỏng trong cột nênphép phân tích càng nhanh khi cột có lượng pha lỏng phủ lên càngnhỏ Khi tải chất lỏng quá thấp sẽ xuất hiện những tâm hấp phụ trênchất mang Muốn tránh điều này cần phải dùng những chất mang trơ.

Độ bay hơi của mẫu thử cũng phải tính đến khi chọn lượng pha lỏng.Các chất khó bay hơi như steroit cần phải được phân tích trong nhữngcột có tải thấp (khoảng 3% hay thấp hơn) Các chất rất dễ bay hơi nhưcác hydrocacbon nhẹ thì cần có cột tải cao (20-30%) vì lượng chấtlỏng càng nhiều thời gian các chất có trong pha lỏng càng lâu, sựphân bố càng tốt

- Mật độ nhồi:

Mật độ nhồi có một sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự lưu giữ trên pha tĩnh.Pha tĩnh được phủ trên một chất mang trên cơ sở phần trăm trọnglượng, trong khi vật liệu nhồi được đặt trong cột trên cơ sở thể tích.Nếu mật độ nhồi của chất mang tăng lên, khối lượng tổng của pha tĩnhtrong cột tăng lên

- Chuẩn bị pha tĩnh và nhồi cột:

Tẩm pha tĩnh lên chất mang có nhiều cách, một trong số đó là dùngmáy cất quay chân không Lấy một lượng pha tĩnh tính toán sẵn hòatan vào trong một dung môi thích hợp trong một bình đáy tròn, chotiếp chất mang rắn với lượng tính toán thích hợp vào Lắp bình vàomáy cất quay Quay bình cho đến khi dung môi bay hết Đun nóngbình bằng cách thủy hoặc bằng đèn hồng ngoại Lấy đoạn ống thẳng

có chiều dài và đường kính mong muốn, nút một đầu bằng bông thủytinh, đầu kia lắp một cái phểu, đổ đầy chất mang đã tẩm pha lỏng vàophểu Lắc cột bằng máy lắc hoặc đập nhẹ vào cột đến khi không thấygiảm thể tích chất mang trên phểu nữa thì cột đã nạp đầy Nút đầu còn