1. Các loại tế bào vật chủ thu nhận: a. Tế bào nhân sơ: (vi khuẩn) Vật chủ nhân sơ : thường dùng là VK E.coli. +Chọn chúng làm tế bào chủ do chúng có ưu điểm như : sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và nhân giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector. +Ngoài ra còn sử dụng 1 số VK: Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces. b. Tế bào nhân chuẩn: Vật chủ nhân chuẩn: Gồm các tế bào nấm men, động vật, thực vật, tảo. Ưu điểm: để nhân giống, có rất nhiều loại tế bào đột biến, vì nó là nhân chuẩn nên dễ dàng biểu hiện đầy đủ các protein của SV nhân chuẩn.
Trang 1I Chương I: VẬT LIỆU CHO CÔNG NGHỆ GENE:
1 Các loại tế bào vật chủ thu nhận:
a Tế bào nhân sơ: (vi khuẩn)
- Vật chủ nhân sơ : thường dùng là VK E.coli
+Chọn chúng làm tế bào chủ do chúng có ưu điểm như : sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và nhân giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector
+Ngoài ra còn sử dụng 1 số VK: Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces
b Tế bào nhân chuẩn:
- Vật chủ nhân chuẩn: Gồm các tế bào nấm men, động vật, thực vật, tảo
- Ưu điểm: để nhân giống, có rất nhiều loại tế bào đột biến, vì nó là nhân chuẩn nên dễ dàng biểu hiện đầy đủ các protein của SV nhân chuẩn
2 Các hệ thống vector tạo dòng:
Các bước Nội dung thực hiện
Bước 1 Chọn và xử lý vector
Bước 2 Xử lý DNA cần cho tạo dòng
Bước 3 Tạo vector tái tổ hợp từ 2 thành phần trên
Bước 4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ là vi khuẩn
Bước 5 Chọn lọc dòng vi khuẩn có chứa vector tái tổ hợp cần tìm hay còn
gọi là phát diện dòng cần tìm trong thư viện gen
Vector: là một đoạn DNA, thường có dạng vòng được dùng để chuyển 1 đoạn DNA lạ vào tế bào chủ như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật, tế bào thực vật….Vector được dùng chủ yếu trong phương pháp chuyển gen hay phương pháp tạo dòng
Bốn đặc tính của 1 vector:
Đặc tính Nội dung
1 Vector phải có khả năng và xâm nhập được vào tế bào chủ
2 Vector phải tự sao chép tích cực bên trong tế bào chủ
Ôn tập
công
nghệ
gen.
Trang 23 Vector phải cho phép chọn lọc dễ dàng các dòng vi khuẩn có
mang vector tái tổ hợp
4 Vector phải có khả năng đặc biệt tiếp nhận tốt gen lạ
Thông thường có 5 loại vector:
1 Vector plasmid - Thông thường gắn 8-9kb DNA lạ, tế
bào vật chủ là vi khuẩn
2 Vector phage - Có thể gắn 15-30kb DNA lạ, xâm
nhiễm tế bào vi khuẩn cao
3 Vector cosmid (phối hợp giữa plasmid
và phage lamda) - Có thể gắn tới 35-50 kb DNa lạ, phát triển ở vi khuẩn
4 Vector virus của sinh vật nhân chuẩn
SV40 đối với động vật, CaMV đối với
thực vật
- Adenovirus
- Retrovirus
- Herpesvirus
- Vacciniavirus
- Có thể xâm nhiễm vào tế bào động vật, thực vật
5 Vector thể nhiễm sắc nấm men nhân
tạo - Có thể xâm nhập vào tế bào nấm men.- Đứa gen lạ có kích thước lớn
150-1000kb
Tùy theo DNA tạo dòng, người ta phân biệt được 2 loại thư viện gen:
Thư viện
gen
Đặc tính
Loại 1 Thư viện bộ
gen - DNA được tạo dòng là toàn bộ trình tự DNA của bộ gen
- Cho phép nghiên cứu toàn bộ các trình tự mã hóa
và không mã hóa chứa trong bộ gen
Loại 2 Thư viện
cDNA - DNA được tạo dòng là tập hợp tất cả cDNA uất phát từ các mRNA của 1 loạt tế bào chuyên biệt
- Chỉ cho phép biểu hiện của gen ở mức độ phiên
Trang 3mã trong tế bào sinh vật.
a Vector plasmid:
- Plasmid là phân tử DNA vòng có trong vi khuẩn Plasmid mang 1 hay nhiều gen và thường những gen đó có ích cho vật chủ
- Plasmid có ít nhát 1 DNa có nguồn gốc nhân lên -> có thể nhân lên không phụ thuộc vào NST của vi khuẩn
- Một vài loại có khả năng nhân lên bằng cách tự gài vào NST của vi khuẩn -> episom
- Kích thước plasmid khoảng từ 10-250 kb
- Số lượng bản sao từ 1-50
- Có 5 loại plasmid chính:
+ Plasmid F – có khả năng khởi động chuyển plasmid sang 1 cơ thể khác
+ Plasmid R – kháng lại kháng sinh
+ Plasmid col – mã hóa colicin 1 phân tử protein giết vi khuẩn khác
+ Plasmid thoái hóa – cho phép vi khuẩn làm thoái hóa những phân tử
chuyển hóa không bình thường nhưu toluene, acid salicylic
+ Plasmid độc – gây bệnh lý cho vật chủ như plasmid Ti sinh ra bệnh ung thư rễ cây trên cây 2 lá mầm
Các thế hệ plasmid:
Các thế
hệ
plasmid
1 pSC101 Góp phân tạo dòng các gen Eu
2 pBR322 Kích thước 4363 bp
Có 2 gen kháng kháng sinh:
- ApR – kháng ampicillin
- TcR – kháng tetracylin
Có 20 vị trí nhận biết RE
Có 11 vị trí đưa gen DNA lạ xem vào trong số đó có những vị trí nằm trong các gen kháng kháng sinh nên khí gen DNA lạ xen vào sẽ làm mất tính kháng kháng sinh tương ứng
3 Đây là plasmid mạnh nhất với 2 đặc tính:
Trang 4- Kích thước nhỏ nên sao chép nhanh, tạo ra số bản sao lớn
- Có mang polylinker, đó là một đoạn polynucleotide tổng hợp tương ứng với 1 chuỗi các vị trí nhân biết duy nhất của các RE
Hiện có 3 nhóm:
- Nhóm pUC, 2600bp, mang gen ApR và một phần gen lacZ để dễ phát hiện mẫu xen vào giữa gen lacZ là polylinker có thể cho phép gắn xen vào bất cứ gen lạ nào
- Nhóm pSP và Gemini, 3000bp mang gen ApRp và polylinker, có một promotor đặc trưng cho RNa polymerase ở 2 bên polylinker thuận lợi cho phiên mã ra nhiều RNA để làm mẫu dò nghiên cứu
- Nhóm pBluescript kết hợp được tất cả các ưu điểm trên
b Vector thực khuẩn thể:
- Thực khuẩn thể (phage) là virus gây nhiễm vi khuẩn, nó có 1 số tính chất:
Cấu trúc đơn giản phần chủ yếu là DNA (đôi khi là RNA) mang nhiều gen, trong đó có gen nhân thực khuẩn thể được bao bọc bởi lớp áo bảo vệ hoặc capsid là những phân tử protein
Quá trình gây nhiễm gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: những tiểu phần thực khuẩn thể buộc vào phía bên ngoài của
vi khuẩn và tiêm NST vào bên trong tế bào
+ Giai đoạn 2: DNA của thực khuẩn thể được tái sinh
+ Giai đoạn 3: những gen khác của thực khuẩn thể trực tiếp tổng hợp các
thành phần protein của nó Những tiểu phần mới được tập hợp lại và được giải phóng khỏi vi khuẩn
Chỉ có thực khuẩn thể lamda và M13 là được tìm thấy vai trò thực như
những vector chọn dòng
Tổ chức gen trong DNA lamda:
+ Là loại thực khuẩn điển hình có đầu và đuôi DNa chứa trong cấu trúc đầu polyhedral và đuôi -> buộc thực khuẩn thể vào bề mặt vi khuẩn để tiêm
DNA vào tế bào
Trang 5+ Kích thước 49 kb
+ Là chuỗi kép DNA có dạng thẳng và vòng
Tổ chức gen trong DNA M13:
+ Là thực khuẩn thể hình sợi, hoàn toàn khác gen lamda Chiều dài gồm
6407 nu và là DNA chuỗi đơn dạng vòng với vỏ chỉ có ba protein chứ không phải 15 protein Chu kỳ gây nhiễm đơn giản hơn và bộ gen không gài vào DNA vật chủ
M13 là phương tiện tách dòng hấp dẫn vì:
+ Dạng tái bản DNA chuỗi kép của bộ gen M13 rất giống plasmid và có được xử lý như vậy trong các mục đích thí nghiệm
+ Những dạng này dễ dàng được tạo ra từ nuôi cấy tế bào E.Coli và có thể đưa vào bởi sự gây nhiễm
+ Những gen được tách dòng với vector dựa trên M13 có thể thu được ở dạng DNA chuỗi đơn
+ Những chuỗi đơn này có thể dễ dàng để phân tích thứ tự và dễ dạng gây biến biến dị invitro
Các thế hệ
vector
phage
Thế hệ 1 Phage tự nhiên
lamda 48502bp Thế hệ 2 Phage EMBL 3
và 4 Có polylinker tiếp nhận 15-20 kb DNA là thích hợp
Thích hợp cho vector thiết lập thư viện bộ gen Thế hệ 3 Lamda GEM
11 và 12 Có vùng polylinker.Có promotor đặc trưng cho RNA polymerase để
tổng hợp một lượng lớn RNA, để dò DNA trong thư viện gen
Thế hệ 4 Lamda 11 và
18-23 Đây là vector biểu hiện có mang 1 gen lacZ để phát hiện vector tái tổ hợp trong thư viện gen
c Các NST nhân tạo của động vật có vú: (MAC) có nguồn gốc từ người TEL, CEN… Đưa MAC vào tế vào động vật có vú và giữ ổn định trong tế bào
Trang 6d Các NST nhân tạo của nấm men:
- Nấm men (YAC) cho phép tạo dòng những đoạn DNA có kích thước
150-1000 kb (trung bình là 350 kb)
NST nhân tạo này kết cấu có 3 trình tự sau thì nhân đôi và phân ly rất tốt: + TEL: trình tự đầu cuối của NST
+ CEN: trình tự trung tâm của NST
+ ARS: trình tự sao chép tự chủ
e Các vector là virus của sv nhân thực:
Virus là những phương tiện chọn dòng đối với các cơ thể khác Có tiềm năng đưa vào được cả tế bào động vật lẫn thực vật
3 Hệ thống các enzyme:
biến nhất)
Nhóm III
Điểm cắt Xa điểm nhận biết
1000bp
Nằm trong điểm nhận biết
Nằm ngoài điểm nhận biết
Khả năng methyl
hóa gốc Adenine
Điều kiện để cắt ATP, Mg++, Mg++
S-AdoMet
Mg++ hoặc Mn++ Mg++, S-AdoMet
Cấu trúc của
enzyme (số chuỗi
polypeptide)
Khác nhau Giống nhau Khác nhau
Polymerase: tham gia tái bản DNA và phiên mã tổng hợp RNA, được sử
dụng nhiều trong kỹ thuật di truyền
- Gồm 2 nhóm:
+ DNA polymerase -> xúc tác tổng hợp chuỗi polynucleotide theo chiều 5’-3’ + RNA polymerase -> tham gia tổng hợp RNA
Trang 7- Taq polymerase: được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus suối nước nóng -> sử dụng trong PCR và RAPD tổng hợp DNA trong điều kiện có dung dịch đệm, Mg+ primers
- DNA polymerase I: có hoạt tính exonuclease 5’-3’ và 3’-5’ -> xúc tác phản ứng thay thế sợi (chức năng exonclease 5’-3’ phân hủy sợi không làm khuôn trong khi polymerase tổng hợp bản sao mới) Chức năng exonuclease 5’-3’ có thể được loại bỏ bằng cách cắt enzyme để tạo ra đoạn Klenow Đoạn này vẫn duy trì các hoạt tính polymerase và
exonuclease 3’-5’ Đoạn Klenow được sử dụng để sao chép một phân tử DNA mạch đơn
- Enzyme phiên mã ngược: là một DNA polymerase phụ thuộc RNA -> sản sinh ra sợi DNA từ sợi khuôn RNA, không có hoạt tính exonuclease kèm theo Chủ yếu sử dụng ddeer sao chép các phân tử mRNA khi chuẩn
bị khuôn cDNA để tách dòng, mặc dù nó cũng có tác động trên khuôn DNA
- T4 DNA – polymerase: có nguồn gốc từ phage T4 ký sinh trong tế bào vi khuẩn Có hoạt tính giống đoạn Klenow và được sử dụng trong tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao bởi hoạt tính exonuclease 3’-5’ mạnh hơn T4 DNA-polymerase
- Terminal transferase: được trích ly từ tuyến ức bò, có chức năng xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của DNA -> được dùng khi thêm đuôi polynucleotide để tạo đầu so le cho DNA trong kỹ thuật tạo dòng
- Enzyme alkaline phosphatase: phân lập từ E.Coli hay ruột bò Có chức
năng loại bỏ nhóm 5’ phosphate của DNA, RNA và các nu tự do -> sử dụng để loại bỏ 5’ phosphate của DNA và RNA trước khi đánh dấu phóng xạ bằng 32P, sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng
- Enzyme T4 polynucleotide kinase: có nguồn gốc từ phage T4 ký sinh trong E.coli -> chức năng ngược lại với alkaline phosphatase -> xúc tác thêm vào 5’ phosphate ở DNA và RNA -> sử dụng để đánh dấu phóng xạ
ở đầu 5’ của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự DNA và phosphoryl
Trang 8hóa các trình tự DNA không có nhóm phosphate ở đầu 5’ để chuẩn bị cho phản ứng nối của kỹ thuật tạo dòng
Enzyme nối DNA-ligase: xúc tác hình thành liên kết nối 2 đoạn DNA và RNA Sửa chữa các mối liên kết phosphodiester bị đứt gãy 1 cách ngẫu nhiên hoặc trong tái bản DNa hay DNa tái tổ hợp -> sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng
- E.coli DNA-ligase: tách chiết từ E.coli -> xúc tác cho các phản ứng nối 2
trình tự DNa có đầu dính
- T4 DNA-ligase: chiết từ phage T4 ký sinh ở E.coli -> xúc tác cho phản ứng nối 2 trình tự có đầu bằng -> sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo dòng
- T4 RNA-ligase: chiết từ phage T4 ký sinh ở E.coli -> xúc tác cho phản ứng nối 2 trình tự RNA bằng liên kết phosphodiester -> thường được sử dụng để đánh dấu phóng xạ ở đầu 3’ của RNA trong kỹ thuật sản xuất mẫu dò
Enzyme nuclease: là nhóm phân cắt DNA và RNA
- DNase – I: có khă năng cắt liên kết ngay sau 1 base pyrimidine trên DNA mạch đơn hay mạch kép -> được sử dụng để loại DNA trong chế phẩm RNA và protein, tạo điểm đứt trong kỹ thuật đánh dấu mẫu dò
- Nuclease S1: tách chiết từ Aspergillus oryzae -> phân giải DNA mạch
đơn, mạch kép -> được sử dụng phân tích đặc điểm cấu trucsphaan tử lai DNA-RNA, loại bỏ đầu so le để tạo đầu bằng, loại bỏ các nút vòng trên RNA trong phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA
- Exonuclease III: chiết từ E.coli -> xúc tác phản ứng phân giải tuần tự các nucleotide từ đầu 3’OH tự do cảu DNA theo chiều 3’-5’ tạo ra
nhữngvùng mạch đơn trên DNA mạch kép -> ứng dụng tạo cấu trúc mạch đơn của một vùng phân tử DNA
- RNase A: có hoạt tính rất mạnh, chịu được nhiệt độ 90oC trong 60p -> có khả năng cắt liên kết phosphodiester ngay sau 1 base pyrimidine của RNA -> đưuọc sử dụng để loại bỏ RNA trong chế phẩm DNA hoặc protein, loại bỏ các đoạn không bắt cặp trên RNA
Trang 9- RNase H: khả năng loại bỏ RNA trong phân tử lai RNA-DNA -> thường được sử dụng để loại bỏ RNA sau phản ứng phiên mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ 2 của CANA tạo DNA mạch kép
II Chương II: TẠO DÒNG GENE.
- Tạo dòng gen là kỹ thuật để nhân những đoạn DNA
- Nó có thể được thực hiện bởi 2 phương pháp khác nhau:
+ Dựa vào tế bào (cell based)
+ Sử dụng phương pháp PCR
- Một vector cần thiết để mang đoạn DNA quan tâm vào tế bào chủ
- Kỹ thuật này là bước đầu tiên của hầu hết các thí nghiệm công nghệ gen
Nguyên lý tạo dòng:
- Bước 1: tổng hợp đoạn gen cần chèn
- Bước 2: cắt giới hạn
- Bước 3: kết nối
- Bước 4 biến nạp
Quy trình chung:
- Bước 1: xác định, phân lập, xử lý đoạn gen hoặc DNA cần được tạo dòng, chọn và xử lý vector
- Bước 2: chèn đoạn gen mục tiêu vào vector thích hợp tạo vector tái tổ hợp
- Bước 3: chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ thích hợp
- Bước 4: chọn lọc các tế bào chủ đã được chuyển vector tái tổ hợp
Mục đích của tạo dòng gen:
- Thiết lập ngân hàng bộ gen,
- Thiết lập ngân hàng cDNA,
- Sản xuất protein, enzyme,
- Sản xuất vaccine,
- Sản xuất kháng sinh
Ưu điểm:
- Lưu trữ được hệ gene cần giữ
- Vừa nhân gen và vừa tạo dòng
Trang 10- Có thể nhân những gen ta chưa biết rõ trình tự (nhưng đối với PCR thì không vì PCR cần phải biết rõ trình tự để có thể tạo mồi đặc hiệu)
Nhược điểm: phức tạp, tốn kém, nhiều kỹ thuật, lâu dài
Vì sao cần vector mang gen vào tế bào chủ?
Nếu gen đưa vào trực tiếp -> nhận biết là lạ => bị tiêu diệt gần hết Nếu không bị tiêu diệt thì cũng sẽ không thể nhân lên được vì không có hệ thống
hỗ trợ => không thể tách dòng
1 Phân lập các gen lạ hoặc DNA lạ cần tạo dòng:
- Cắt DNA lạ của tế bào cho bằng enzyme giới hạn
- Phân lập các đoạn DNa cần tạo dòng
- Trong trường hợp tạo dòng 1 gen chưa biết có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng dựa vào dự đoán cấu trúc protein do gen mã hóa hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA
- Tạo đầu dính khi cần thiết
2 Chọn và xử lý vector:
Nguyên tắc chọn vector:
- Dựa vào kích thước và bản chất của DNa cần tách dòng làm căn cứ chọn vector (kích thước đoạn chèn (insert size) -> ngắn (,15kb) -> chọn thoải mái các vector, nếu dài -> chọn hệ thống vector khác)
- Lưu ý sự tương đồng các vị trí cắt đặc hiệu của các enzyme giới hạn giữa đoạn DNa và vector tách dòng (tách dòng plasmid không có vị trí cắt giới hạn)
- Vector tách dòng phải thích hợp với tế bào chủ, có khả năng tái bản trong
tế bào chủ, tạo số lượng bản sao lớn, nhưng không gây ảnh hưởng tới tế bào chủ (đối với vi khuẩn là hầu hết là plasmid, 1 số nấm men ->plasmid, động vật, thực vật -> chọn hệ thống vector khác)
- Gen chỉ thị trong vector tách dòng càng dễ nhận biết càng tốt (chọn plasmid có số lượng bản sao lớn) (gen chỉ thị: kháng kháng sinh, chỉ thị màu… )
- Vector tác dòng phải có hiệu quả tách dòng cao (tạo tỷ lrrj vector tái tổ hợp cao)
Trang 11 Xử lý vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại
3 Chèn đoạn gen mục tiêu vào vector:
- Vector và insert cần tạo dòng được trộn chung theo tỷ lệ nhất định
- Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung
- Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của
E Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai
4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ:
- Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là có khả năng thấm vector tái tổ hợp Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được cảm ứng Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp
Biến nạp: là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho
D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus Biến nạp được thực hiện với vector chuyển gen là plasmid
- Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ thích hợp.( đi qua thành và màng tế bào Trong tự nhiên có thể có DNA vào tế bào vi khuẩn được tuy nhiên xác suất này rất thấp => cần có vector và cần xử lý tế bào chủ)
- Nếu DNA đưa vào là DNA của virus thì được gọi là sự lây nhiễm
- Những tế bào chủ có khả năng thu nhận DNA đã qua xử lý lý học và hóa học gọi là những tế vào có năng lực (khả nạp)
Quy trình biến nạp:
- Ống nghiệm có sẵn competent xell -> đưa plasmid vào ống