ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT (STa, STb VÀ LT) CỦA VI KHUẨN E. COLI PHÂN LẬP TỪ LỢN CON BỊ TIÊU CHẢY

Bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra thường xuất hiện ở lợn con trước cai sữa và saucai sữa, mà nguyên nhân chủ yếu là do nhóm vi khuẩn ETEC mang gen mã hóa độctố ruột kém chịu nhiệt (LT) và gen mã hóa độc tố ruột chịu nhiệt (ST) gây ra (Gyles vàFairbrother, 2010). Bình thường các chủng vi khuẩn ETEC sống cộng sinh chiếm ưuthế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Khi có điều kiện bất lợi nhưthay đổi về thức ăn, thời tiết hoặc lợn bị mắc các bệnh khác, thì các chủng vi khuẩnETEC sẽ tăng sinh nhanh chóng, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy. Để gây bệnh,trước hết các chủng ETEC sẽ bám dính vào niêm mạc đường ruột thông qua các yếu tốbám dính như F4, F5, F6, F18…. Sau đó chúng sản sinh ra các loại độc tố đường ruộtnhư STa, STb và LT. Chính những độc tố này là nguyên nhân trực tiếp gây nên rối loạntrao đổi muối và nước trong đường ruột và hậu quả của nó là nước bị tiết quá mức vàođường ruột gây tiêu chảy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

NHA TRANG - 2016

LỜI CẢM ƠN

Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Em xin gửi đến sự biết ơn sâu sắc nhất dành cho TS Võ Thành Thìn – Trưởng bộ môn nghiên cứu vi trùng trực thuộc Phân viện Thú y miền Trung, thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Viện Trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, ThS Lê Đình Hải - Cán bộ bộ môn nghiên cứu vi trùng và ThS Lê Nhã Uyên – Giảng viên Trường Đại học Nha Trang đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em thực hiện đồ án này một cách tốt nhất

Xin cảm ơn cô ThS Khúc Thị An – Trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học và thầy

TS Nguyễn Văn Duy – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang cùng với các thầy, cô giảng viên phản biện đã cho em những kiến thức sâu sắc và những lời khuyên vô cùng quý báu để đồ án nghiên cứu này có thể hoàn thành tốt nhất

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn nghiên cứu vi trùng và tập thể cán bộ công nhân viên - Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho em trong suốt thời gian em thực hiện đồ án này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ, người thân và các bạn cùng đồng hành trong tập thể lớp 54CNSH – Trường Đại học Nha Trang đã gắn bó và động viên khích lệ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này

Nha Trang, ngày 11 tháng 7 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về vi khuẩn E coli 4

1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn E coli 4

1.1.2 Phân loại 4

1.1.3 Đặc điểm hình thái E coli và tính chất bắt màu 6

1.2 Tổng quan về nhóm ETEC 8

1.2.1 Các yếu tố gây bệnh của nhóm ETEC 8

1.2.1.1 Yếu tố bám dính (colonization-CF) 8

1.2.1.2 Các loại độc tố đường ruột 10

1.2.2 Cơ chế gây bệnh của ETEC 16

1.3 Một số nghiên cứu về vai trò của các độc tố đường ruột trong bệnh tiêu chảy ở lợn 17

1.3.1 Nghiên cứu trong nước 17

1.3.2 Nghiên cứu trên thế giới 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nội dung và đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên c ứu 20

2.2.1 Phương pháp khảo sát sự lưu hành của gen mã hóa độc tố STa, STb, LT của vi khuẩn E coli 20

2.2.2 Phương pháp đánh giá sự tương đồng của các gen mã hóa độc tố STa, STb và LT 22

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.3 Nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả khảo sát sự lưu hành của các gen mã hóa độc tố STa, STb, LT của các chủng vi khuẩn E coli 24

3.2 Tổ hợp gen c ủa các chủng mang gene mã hóa độc tố STa, STb và LT 27

3.3 Đánh giá sự tương đồng gen mã hóa độc tố STa, STb và LT 29

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

4.1 Kết luận 34

4.2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

Tài liệu tiếng Việt 35

Tài liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 43

Phụ lục 1: Hóa chất điện di 43

Phụ lục 2: Hóa chất nhuộm gel 43

Phụ lục 3: Cách kiểm tra ý nghĩa thống kê 43

Phụ lục 4: Kết quả khảo sát sự có mặt gen mã hóa độc tố đường ruột (STa, STb, LT) c ủa vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy 44

Phụ lục 4: Trình tự nucleotide gen eltAB của 10 chủng ETEC khảo sát 50

Phụ lục 5: Trình tự nucleotide gen estA của 10 chủng ETEC khảo sát 54

Phụ lục 6: Trình tự nucleotide gen estB của 10 chủng ETEC khảo sát 55

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AIEC : Adherent Invasive E coli

CFA : Colonization factor antigen (yếu tố bám dính)

Cs : Cộng sự

DAEC : Diffusely adherent E coli

DNA : Deoxyribonucleid acid

E coli : Escherichia coli

EAEC : Enteroaggregative E coli

EHEC : Enterohaemorrhagic E coli

EIEC : Enteroinvasive E coli

eltA : Gen mã hóa tiểu phân tử A của độc tố LT

eltAB : Gen mã hóa độc tố LT

eltB : Gen mã hóa tiểu phân tử B của độc tố LT

EPEC : Enteropathogenic E coli

ER : endoplasmic reticulum (mạng lưới nội chất)

est : Gen mã hóa độc tố ST

estA : Gen mã hóa độc tố STa

estB : Gen mã hóa độc tố STb

ETEC : Enterotoxigenic E coli

FAO : Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc

F4, F5, F6, F18,… : yếu tố bám dính

GM1 : Ganglioside (Thụ thể trên tế bào biểu mô niêm mạc ruột) hlt : Human heat labile toxin

LT : Heat labile toxin

PCR : Polymerase Chain Reaction

plt : Porcine heat labile toxin

ST : Heat stable toxin

STEC : Enteroaggregative E coli

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái c ủa vi khuẩn E coli 6

Hình 1.2 Cấu trúc độc tố kém chịu nhiệt LT 11

Hình 1.3 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố LT 12

Hình 1.4 Cấu trúc độc tố ST Cầu nối disulfide (màu đỏ) trên 2 biến thể của độc tố STa, vùng lõi của độc tố (gạch bên dưới) (Fleckenstein và cs, 2010) 14

Hình 1.5 Cầu nối disulfide (-S-S-) và các số chỉ vị trí acid amin trong cấu trúc độc tố STb (Sukumar và cs, 1995) 14

Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố STa 15

Hình 1.7 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố STb 15

Hình 1.8 Quá trình lây nhiễm và gây bệnh của ETEC 16

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gen mã hóa độc tố STa, STb, LT 27 Hình 3.2 Kết quả điện di mẫu đã được khuếch đại PCR 29

Hình 3.3 Một số vị trí sai khác trong trình tự nucleotide gen eltAB của các chủng ETEC 32

Hình 3.4 Một số vị trí sai khác trong trình tự acidamin của gen eltAB của các chủng ETEC 32

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các mồi (primer) được sử dụng trong mutiplex-PCR 21 Bảng 2.2 Các thành phần của phản ứng multiplex-PCR (25μl/ phản ứng) 22 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex-PCR 22 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự lưu hành của các gen mã hóa độc tố STa, STb, LT của

E coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy 24

Bảng 3.2 Kết quả tổ hợp gen mã hóa độc tố STa, STb và LT của các chủng ETEC

phân lập từ lợn con bị tiêu chảy 28

Bảng 3.3 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của gen estA giữa các chủng vi

khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy 30

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của gen estB giữa các chủng vi

khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy 31

Bảng 3.5 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của gen eltAB giữa các chủng

vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn con bị tiêu chảy 33

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Sự phân bố của các gen mã hóa độc tố STa, STb, LT của E coli 25

Biểu đồ 3.2 Tổ hợp gen mã hóa độc tố STa, STb và LT của các chủng ETEC phân lập

từ lợn con bị tiêu chảy 28

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Phương pháp nghiên cứu 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăn nuôi lợn là ngành có vị trí hàng đầu trong ngành chăn nuôi ở nước ta và đang

có sự phát triển mạnh mẽ Theo số liệu thống kê của FAO (2013),tổng đàn lợn trên thế giới là 977.020.798 con, trong đó Việt Nam có 26.261.400 con, đứng thứ 5 trên toàn thế giới sau Trung Quốc (475.922.000 con), Mỹ (64.775.000 con), Brazil (39.040.000 con) và Đức (27.690.100 con) Theo Tổng cục thống kê Việt Nam năm 2014 và năm

2015 cho biết: tại thời điểm tháng 4/2014, đàn lợn cả nước có tới 26,4 triệu con, tăng 0,3% và sản lượng thịt lợn hơi đạt 1,9 triệu tấn, tăng 1,7% so với cùng kỳ năm ngoái Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đã đạt được, ngành chăn nuôi đang đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, đặc biệt là tình hình dịch bệnh Song song với sự phát triển về quy mô chăn nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng xảy ra càng nhiều và khó kiểm soát, mức độ thiệt hại mà dịch bệnh gây ra cho ngành chăn nuôi ngày càng lớn

(Zimmerman JJ và cs, 2012) Trong đó bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli gây ra được

xem là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến hiệu quả chăn nuôi chưa cao Lợn bị mắc bệnh tiêu chảy thường sẽ dẫn đến còi cọc, chậm phát triển và có thể chết

(Erume và cs, 2008)

Bệnh tiêu chảy do E coli gây ra thường xuất hiện ở lợn con trước cai sữa và sau

cai sữa, mà nguyên nhân chủ yếu là do nhóm vi khuẩn ETEC - mang gen mã hóa độc

tố ruột kém chịu nhiệt (LT) và gen mã hóa độc tố ruột chịu nhiệt (ST) gây ra (Gyles và Fairbrother, 2010) Bình thường các chủng vi khuẩn ETEC sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật Khi có điều kiện bất lợi như thay đổi về thức ăn, thời tiết hoặc lợn bị mắc các bệnh khác, thì các chủng vi khuẩn ETEC sẽ tăng sinh nhanh chóng, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy Để gây bệnh, trước hết các chủng ETEC sẽ bám dính vào niêm mạc đường ruột thông qua các yếu tố bám dính như F4, F5, F6, F18… Sau đó chúng sản sinh ra các loại độc tố đường ruột như STa, STb và LT Chính những độc tố này là nguyên nhân trực tiếp gây nên rối loạn trao đổi muối và nước trong đường ruột và hậu quả của nó là nước bị tiết quá mức vào đường ruột gây tiêu chảy (Gyles và Fairbrother, 2010)

Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli có thể được điều trị bằng kháng sinh, tuy nhiên

trên thế giới cũng như trong nước hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và sự tồn dư kháng sinh trong thực phẩm là một vấn đề nan giải cần được quan tâm Đặc biệt, trong xu thế

hội nhập sâu rộng hiện nay, ngành chăn nuôi trong nước sẽ tiếp tục phải đối mặt với nhiều khó khăn và mức độ cạnh tranh với sản phẩm nhập khẩu ngày càng khốc liệt hơn, nhất là sự cạnh tranh của các nước trong khu vực ASEAN, khi mà Cộng đồng Kinh tế ASEAN được thành lập Vì vậy sản phẩm chăn nuôi phải sạch là điều kiện bắt buộc nếu muốn phát triển chăn nuôi Do vậy việc phòng bệnh bằng vaccine là một biện pháp vừa hiệu quả vừa an toàn đáp ứng được yêu cầu của người chăn nuôi

Đối với bệnh tiêu chảy ở lợn do các chủng vi khuẩn ETEC thì độc tố đường ruột đóng vai trò cực kỳ quan trọng, chúng phải được sử dụng như là những kháng nguyên

để phòng bệnh tiêu chảy Tuy nhiên một vấn đề phức tạp đặt ra hiện nay đó là sự đa

dạng về kháng nguyên của các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh (Lasaro và cs, 2008)

Theo các nghiên cứu trước, gen mã hóa độc tố STa và STb được tìm thấy ở các chủng ETEC là hoàn toàn giống nhau Tuy nhiên, chỉ có một biến thể mới của gen mã hóa độc

tố STb trong nghiên cứu của Christine Taillon và cs (2008) được tìm thấy, đó là sự thay đổi acid amin Histidine ở vị trí 12 thành acid amin Asparagine Theo Lasaro và cs năm

2008, có 16 kiểu gen khác nhau mã hóa cho độc tố LT được tìm thấy trong số 51 chủng

vi khuẩn ETEC phân lập từ người Trình tự gen mã hóa độc tố LT của 52 chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn có một số điểm khác nhau, những điểm khác nhau này liên quan đến khả năng bám của độc tố lên GM1 của tế bào và độc lực của chúng (Chengxian

Zhang và cs, 2009)

Tại Việt Nam mặc dù đã có một số công trình nghiên cứu về sự lưu hành của gen

mã hóa độc tố đường ruột ở các chủng vi khuẩn phân lập từ lợn bị tiêu chảy Như nghiên

cứu của Lý Thị Liên Khai năm 2001 đã phân lập và xác định độc tố các chủng E coli

gây bệnh tiêu chảy cho lợn con ở Cần Thơ và Hồ Chí Minh Kết quả phát hiện 70/84 chủng có khả năng sản sinh độc tố STb - chiếm tỷ lệ lớn nhất, sau đó đến STa (57/84 chủng) và LT (40/84 chủng ); Bằng phương pháp phân tích PCR, Võ Thành Thìn (2012)

tìm ra 184 chủng E coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy ở Tây Nguyên và Nam Trung

Bộ, phát hiện 40,76% chủng vi khuẩn mang gene mã hóa độc tố STb, tiếp theo là độc tố STa (30,43%), độc tố LT (28,26% )… Tuy nhiên, chưa có một công trình nào so sánh trình tự gen mã hóa các loại độc tố đường ruột này Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “Đánh giá sự tương đồng gen mã hóa độc tố đường ruột (STa, STb và LT)

của vi khuẩn E coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy”

Mục tiêu đề tài

So sánh sự tương đồng gen mã hóa độc tố đường ruột (STa, STb và LT) của vi

khuẩn E coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy

Nội dung chính của đề tài

- Khảo sát sự có mặt của gen mã hóa độc tố STa, STb và LT của vi khuẩn E coli

- So sánh sự tương đồng của các gen mã hóa các loại độc tố STa, STb và LT

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Góp phần lựa chọn những trình tự gene mã hóa độc tố đường ruột đại điện cho các chủng gây bệnh ở Việt Nam để phát triển vaccine phòng bệnh tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn ETEC gây ra một cách có hiệu quả

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn E coli

1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli lần đầu tiên được nhà khoa học người Đức tên là Theodor

Escherich phân lập vào năm 1885 từ phân của một đứa bé và được mô tả như là một

trực khuẩn ngắn và được đặt tên là Bacterium coli commune (Escherich, 1988) Tên của

vi khuẩn sau đó được mô tả bởi những tên khác nhau bởi các tác giả khác nhau như

Bacillus coli, Bacterium coli Cho đến năm 1954 vi khuẩn này được đặt theo tên nhà

khoa học đầu tiên phân lập được vi khuẩn này là E coli (Cowan, 1954)

Vi khuẩn E coli chiếm phần lớn trong số các loài vi khuẩn hiếu khí ở các loài

động vật và người (thường khoảng 107-109 vi khuẩn/gram phân) Tuy nhiên ở loài chim

cảnh khỏe mạnh số lượng vi khuẩn E coli rất thấp Ngoài ra vi khuẩn này cũng được

tìm thấy nhiều trong môi trường, bụi bẩn và rác thải Mặc dù hầu hết các chủng vi khuẩn

E coli được coi là vi khuẩn thường trực trong đường tiêu hóa và không gây bệnh hoặc

là vi khuẩn cơ hội Bên cạnh đó một số chủng vi khuẩn mang những yếu tố độc lực được xem là những tác nhân gây bệnh ở người và động vật (Gyles và Fairbrother, 2010;

Fairbrother và cs, 2005)

1.1.2 Phân loại

Vi khuẩn E coli là một trực khuẩn Gram âm, không hình thành bào tử và được

phân loại như sau:

Trước đây, E coli gây bệnh đường ruột được chia thành 6 phân nhóm dựa trên khả

năng gây bệnh của chúng (yếu tố độc lực, dấu hiệu lâm sàng và cơ chế gây bệnh): EPEC,

EHEC, ETEC, EAEC, EIEC và DAEC (Kaper và cs, 2004) Gần đây đã xuất hiện thêm

hai nhóm mới, đó là AIEC được cho là có liên quan với bệnh Crohn, nhưng không sinh

ra tiêu chảy và STEC (Clements và cs, 2012)

EPEC: Mang kháng nguyên bám dính, có khả năng tấn công lên niêm mạc ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột nhưng không sản sinh độc tố, gây viêm ruột kèm sốt và tiêu chảy Vi khuẩn thuộc nhóm này thường gây bệnh tiêu chảy ở người, thỏ, chó, mèo, lợn và có thể ngựa Dịch bệnh do EPEC gây ra có liên quan đến việc tiêu thụ nước

uống bị ô nhiễm cũng như một số sản phẩm thịt (Feng và cs, 2011)

ETEC: Mang một số kháng nguyên bám dính và sinh độc tố đường tiêu hóa Vi khuẩn nhóm này thường gây bệnh tiêu chảy trên người, lợn, cừu, dê, bò, chó và ngựa

(Zinnah và cs, 2007) ETEC được công nhận là tác nhân gây tiêu chảy và bệnh được đặc

trưng bởi tiêu chảy nhẹ, không sốt và nhiễm ETEC xảy ra phổ biến ở các nước kém phát triển

EIEC: Vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mô tế bào ruột kết, làm dung giải thể thực

bào gây bệnh nghiêm trọng cho người giống như Shigella EIEC thường gây tiêu chảy nước và đôi khi gây bệnh lỵ cho cả trẻ em và người lớn (Kaper và cs, 2004)

EHEC: Nhóm này thường sản sinh yếu tố xâm nhiễm, độc tố Shiga (Stx) Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh thường gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng Thường được phân lập được từ người và động vật nhai lại

EAEC: Bám lên thành ruột non và ruột già, sản sinh độc tố đường tiêu hóa Vi khuẩn nhóm này chỉ có thể tìm thấy ở người và có thể ở lợn, bò

DAEC: Có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt ở trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên

1.1.3 Đặc điểm hình thái E coli và tính chất bắt màu

 Hình thái

Hình 1.1 Hình thái của vi khuẩn E coli (Vũ Khắc Hùng, 2012)

E coli là trực khuẩn, có hình que, kích thước khoảng 2 x 0,6 μm - 3x0,6 μm, có

lông tơ xung quanh, không hình thành bào tử và có thể có giáp mô Trong cơ thể động vật, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Trong môi trường nuôi cấy, trực khuẩn

E coli có thể dài từ 4 μm - 8 μm và những loài này thường gặp trong canh khuẩn già

Phần lớn E coli di động do có lông xung quanh nhưng có một số không thấy di động (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997)

Vi khuẩn E coli bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu Nếu

lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm có thể thấy giáp mô, còn khi soi tươi sẽ không thấy được Dưới kính hiển vi người ta có thể phát hiện được cấu trúc pili- một yếu tố

bám dính của vi khuẩn E coli lên tế bào niêm mạc ruột (Pizarro-Cerda và Cossart, 2006)

 Đặc tính nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 370C (98,60F), tuy nhiên cũng có trường hợp E coli sinh trưởng ở nhiệt độ cao tới 490C (120,20F), pH thích hợp 6,4-7,5 (tối ưu là 7,2-7,4 ) (Lê Thanh Bình, 2012)

Trên môi trường EMB (Eosin Methylen Blue), khuẩn lạc của E coli có màu đỏ

tím, có ánh kim

Trên môi trường nước thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu tro lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi

phân thối (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997)

Trên môi trường NA (Nutrient Agar), TSA (Tripticase Soy Agar) qua 18-24h ủ ở

370C hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đường kính 2 - 3mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974)

Trên môi trường thạch máu, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, một số chủng có vòng dung huyết xung quanh, sau 24h nuôi cấy ở 370C Trên môi trường thạch thường, sau 12-18h ở nhiệt độ 35-370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tròn, lồi, không trong suốt, bóng láng

Trên môi trường MacConkey: Sau 24h nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy, rìa gọn được bao quanh vòng đục Một số chủng vi khuẩn không lên men đường lactose thì khuẩn lạc sẽ có màu nhạt (Nguyễn

Như Thanh và cs, 1997)

 Đặc tính sinh hóa

Vi Khuẩn E coli có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose,

Glucose, Galactose, Xylose, Mantiol nhưng không lên men Adonit và Inozit Tuy nhiên,

có một vài chủng E coli không lên men Lactose

Một số phản ứng sinh hóa khác: Phản ứng dương tính với Indol và MR, hầu hết các chủng âm tính với VP, không sinh H2S, không sử dụng Citrar (Nguyễn Như Thanh

và cs, 1997)

 Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn E coli được chia làm các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng

nguyên thân O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên bám dính F Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã tìm ra được 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F (Fairbrother, 1992)

Kháng nguyên O (kháng nguyên thân): Được coi như là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết và tạo thành những hạt nhỏ, khó tan

Kháng nguyên H (kháng nguyên lông): Là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O Kháng nguyên này có khả năng tạo miễn dịch mạnh và phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O (Orskov, 1978)

Kháng nguyên K là kháng nguyên hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O và tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ

Kháng nguyên F (Kháng nguyên bám dính): Hầu hết các chủng E coli đều sản

sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh thì không

có kháng nguyên này Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh,

đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột (Carter và cs, 1995)

1.2 Tổng quan về nhóm ETEC

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ

biến ở lợn con trước cai sữa và sau cai sữa, gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế các nước trên thế giới (Nagy và Fekete, 1999) Để gây bệnh, vi khuẩn ETEC bám chặt vào các thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột nhờ vào các yếu tố bám dính như F4 (K88 ), F5 (K99 ), F6, F18, F41; sau đó sản sinh một hay nhiều độc tố ruột, bao gồm độc tố chịu nhiệt (STa, STb) và độc tố không chịu nhiệt (LT) (Gyles Faibrother, 2010)

1.2.1 Các yếu tố gây bệnh của nhóm ETEC

Các chủng ETEC gây tiêu chảy cho động vật nhờ 2 yếu tố độc lực cơ bản là: kháng nguyên bám dính có trên bề mặt vi khuẩn như F4, F5, F6, F17, F18, F41 và độc tố đường ruột (STa, STb và LT)

khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu (Sellwood và cs, 1975) Fimbriae cũng có thể

chứa nhiều bản sao của tiểu đơn vị nhỏ, một trong số đó có thể là yếu tố mang đặc trưng bám dính

Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu

kỹ Để gây tiêu chảy, đầu tiên ETEC phải bám dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố bám dính (CF hay CFA)

Danh pháp của fimbriae chưa được tiêu chuẩn hóa và được đặt tên dựa trên các tiêu chí như: nguồn gốc chủng (F44, 987P, F107), cấu trúc (K88, K99) và chức năng

bám dính (CFA) Các yếu tố bám dính phổ biến có trên bề mặt vi khuẩn E coli đã được

tìm thấy như K88, K99, 987P, F17, F18 và F41

K88 (F4) Fimbriae: Là yếu tố bám dính đầu tiên được phát hiện trong các chủng

ETEC phân lập từ lợn và là kháng nguyên bám dính phổ biến nhất ở các chủng E coli

gây bệnh tiêu chảy trên lợn con sau cai sữa Theo nhiều kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy ở lợn con thường xuyên mang yếu tố bám dính F4 và F18 ở nhiều nước như ở cộng hòa Slovak; ban đầu F4 được cho là một kháng nguyên vỏ, nhưng sau đó được xác định là một kháng nguyên có cấu trúc sợi nhỏ mịn

Nó được mã hóa bởi gen trên plasmid, và có 3 biến thể đó là ab, ac và ad Các loại glycoprotein của màng ruột có thể là một thụ thể sinh học của F4 Tuy nhiên, có tới 50% lợn không có thụ thể cho F4, và sự thiếu hụt này là do yếu tố di truyền qua các thế hệ

(Van den Broeck và cs, 2000)

F5 (K99) Fimbriae: Lúc đầu cũng được cho là vỏ bao, nhưng sau đó đã được chứng minh là sợi nhỏ phụ Kháng nguyên bám dính F5 được mã hóa bởi gen trên plasmid Đây là yếu tố bám dính phổ biến nhất được sản xuất bởi các chủng ETEC phân lập từ

bò và cừu Kháng nguyên bám dính F5 chủ yếu xuất hiện ở các phần dưới của ruột non, đặc biệt là ở động vật nhỏ F5 bám vào các thụ thể đặc hiệu N-glycolylneuraminic acid-GM3 là yếu tố trung gian gắn ETEC vào phía sau niêm mạc ruột non ở động vật non,

và đôi khi ở động vật lớn tuổi (Gyles và Faibrother, 2010)

F6 (987P) Fimbriae: Các gen mã hóa F6 fimbriae được tìm thấy ở cả trên nhiễm sắc thể, plasmid và mã hóa 3 cấu trúc protein gồm FasA là nhóm lớn, FasF và FasG là nhóm nhỏ Đây là yếu tố trung gian liên kết vi khuẩn với ruột non chủ yếu ở lợn con Ở ruột lợn già rất ít khi quan sát được sự liên kết của vi khuẩn với các thụ thể F6 hiện diện

trong chất nhầy ruột hơn với thụ thể trên tế bào biểu mô ruột Vì thế, tiêu chảy do F6

của ETEC hầu như chỉ ở lợn sơ sinh (Schifferli và cs, 1987)

F18 Fimbriae: Được mã hóa bởi gen trên plasmid F18 có hai loại biến thể là Fab

và Fac, dựa trên sự khác biệt chuỗi huyết thanh và trình tự nucleotide F18ab ít biểu

hiện ở invivo, invitro và thường được kết hợp với Stx2e của chủng E coli liên quan đến bệnh phù (ED) Còn F18ac thì biểu hiện hiệu quả hơn ở invitro, invivo Lợn sơ sinh

không có thụ thể đối với F18, do đó chúng không có khả năng kháng với F18 Tuy nhiên, lợn cai sữa dễ bị hơn do sự gia tăng của các thụ F18 (Gyles và Fairbrother, 2004)

Vì vậy F18 của E coli phổ biến nhất ở lợn cai sữa (Chen và cs, 2004)

F41 Fimbriae: Được mã hóa bởi gen hiện diện trên nhiễm sắc thể và được tìm thấy

ở cả trâu, bò và các chủng ETEC gây bệnh ở lợn Nó chủ yếu được thể hiện cùng với K99 fimbriae trên ETEC của kháng nguyên O nhóm 9 và 101, mặc dù một số chủng, chủ yếu là từ lợn, có thể sản xuất F41 một mình F41 bám dính ở phía sau ruột non ở lợn sơ sinh và bê có thể dẫn đến tiêu chảy, cho dù K99 fimbriae có mặt hay không (Gyles và Fairbrother, 2004)

F17 fimbriae: F17 là fimbriae chủ yếu trên chủng ETEC ở bò Bốn biến thể gen a,

b, c, d đã được mô tả dựa trên sự khác biệt trong tiểu đơn vị chính F17 F17 cũng đã được tìm thấy trên các chủng ETEC bò, mặc dù vai trò của nó trong tiêu chảy do các

chủng ETEC chưa được làm sáng tỏ (Mainil và cs, 2000)

1.2.1.2 Các loại độc tố đường ruột

 Độc tố kém chịu nhiệt (Heat-labile enterotoxin LT)

- Cấu trúc

Độc tố LT được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn ETEC có cấu trúc và chức năng tương đối giống với độc tố CT (cholera enterotoxin) được sản xuất bởi các chủng vi

khuẩn Vibrio cholerae Độc tố LT có trọng lượng phân tử khoảng 84 kDa, có dạng độc

tố AB5 với 1 tiểu phân tử A (có trọng lượng 28kDa) kết hợp không cộng hóa trị covenlent) với 5 tiểu phân tử B (trọng lượng 11,5kDa) Trong đó tiểu phân tử A chịu trách nhiệm cho phần hoạt động enzym của độc tố và nó bị phân cắt bởi enzym protease

(non-để tạo thành 2 chuỗi peptide là A1 (21kDa) và A2 (9kDa) Hai chuỗi peptide A1 và A2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide giữa A1-Cys187 và A2-Cys199 Chuỗi A2 tạo thành cái móc liên kết không đồng hóa trị giữa tiểu đơn vị A và lỗ hổng giữa của vòng

5 tiểu phân tử B (Fairbrother và cs, 2005; Liu, 2014) Chuỗi A1 của tiểu phân tử A là

một ADP-ribosyltransferase, đó chính là vị trí hoạt động của độc tố và đóng vai trò cho

sự ổn định của độc tố (Gyles và Fairbrother, 2010) 5 tiểu phân tử B trong cấu trúc của

LT sắp xếp thành vòng nhẫn 5 cạnh bền vững Mỗi tiểu phân tử B có 1 vị trí gắn với thụ thể có trên tế bào niêm mạc ruột là monosialoganglioside GM

Hình 1.2 Cấu trúc độc tố kém chịu nhiệt LT

Cấu trúc tinh thể của E coli LT-I (bên trái) và LT-II (bên phải) Các tiểu phân tử A1

được biểu thị bằng màu vàng đậm và A2 màu vàng, trung tâm hoạt động nằm ở tiểu phần này (có đánh dấu *), cầu disulfide được biểu thị bằng mũi tên đen liên kết A1 và A2 5 tiểu phân tử B được biểu thị như là các cấu trúc sợi màu đỏ, trắng, hồng, xanh lá

cây và màu xanh (Oludare Odumosu và cs, 2010)

Độc tố LT tiết ra bởi các chủng ETEC được phân thành 2 nhóm biến thể khác nhau

đó là LTI (từ bây giờ gọi là LT) và LTII, trong đó chỉ có độc tố LTI bị trung hòa bởi

độc tố kháng bệnh tả (Guth và cs, 1986; Fukuta và cs, 1988) LTI thường được tìm thấy

ở các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người và động vật, trong khi LTII chỉ tìm thấy ở một

số ít chủng phân lập từ động vật và không có khả năng gây bệnh (Elsinghorst, 2002) LTI: Cho đến hiện nay, người ta xác định được 2 biến thể của độc tố LTI đó là LTp-

I và LTh-I Biến thể LTp-I được tìm thấy ở những chủng vi khuẩn phân lập từ lợn và LTh-I tìm thấy ở những chủng phân lập từ người Hai biến thể này có cấu trúc tượng tự nhau nhưng khác nhau ở một vài acid amin và có thể gây miễn dịch chéo cho nhau

(Tsuji và cs, 1982; Liu, 2014) Gen mã hóa độc tố LTI, eltAB là sự kết hợp của 2 gene

eltA mã hóa cho tiểu phân tử A (LTA) và gene eltB mã hóa cho tiểu phân tử B (LTB)

Trình tự gen mã hóa eltAB tương đồng 80% với gen ctxAB (gen mã hóa độc tố CT) Cả

2 độc tố LT và CT có khoảng 240 acid amin (Mudrak và Kuehn, 2010; Fan và cs, 2004)

Độc tố LTI có thể bám vào thụ thể trên niêm mạc ruột là ganglioside GM1 (monosialotetrahexosylganglioside), ngoài ra LT còn có khả năng bám vào thụ thể khác

như GM2 và một số glycoprotein có ở ruột (Fukuta và cs, 1988; Teneberg và cs, 1994; Backstrom và cs, 1997)

LTII: Có trọng lượng phân tử tương tự LTI nhưng nó có đặc tính kháng nguyên khác với LTI và CT Về mặt cấu trúc, tiểu phân tử A của độc tố LTII tương đồng 57% với độc tố LTI , tuy nhiên tiểu phân tử B của 2 biến thể này hoàn toàn khác nhau Những nghiên cứu trước đây người ta cho rằng nhóm độc tố LTII có 2 biến thể là LT-IIa

(Pickett và cs, 1987) và biến thể LT-IIb Hai biến thể này tương đồng với nhau 71% ở

tiểu phần A và 66% ở tiểu phân tử B Gần đây một số tác giả còn cho thấy một biến thể mới LT-IIc được mô tả từ chủng ETEC phân lập từ đà điểu bị bệnh và biến thể này ít

độc hơn so với LT-IIa và LT-IIb (Nardi và cs, 2005, Nawar và cs, 2010) Bởi vậy cho

đến hiện tại có 3 biến thể của LT-II đã được phát hiện Tuy nhiên vai trò gây bệnh của

LT-II thì vẫn còn hạn chế được nghiên cứu (Fukuta và cs, 1988)

Các gen mã hóa độc tố LT hầu như giống hệt nhau về trình tự giữa các chủng ETEC

ở lợn Chỉ có nucleotide mã hóa hai loại acid amin thứ 44 (S44N) và thứ 60 (S60T) của

gen mã hóa eltB ở tiểu phân tử B, khác nhau giữa 4 chủng (trong tổng số 52 chủng nghiên cứu) (Chengxian Zhang và cs, 2009)

- Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT

Hình 1.3 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố LT (Gyles và cs, 2010)

Sau khi vi khuẩn bám lên lớp tế bào biểu mô ruột thì độc tố LT được giải phóng ra,

và sẽ bám lên các receptor trên lớp tế bào biểu mô niêm mạc ruột Sau khi bám vào niêm mạc ruột, độc tố LT xuyên qua màng ngoài tế bào và đi vào thể Golgi và mạng lưới nội chất (ER- endoplasmic reticulum) Sau khi phân tách thành 2 phần tại mạng lưới nội chất, tiểu phân tử A1 sẽ di chuyển tới tế bào chất và chuyển phần ADP-ribosyl

từ NAD đến protein của liên kết GTP (GTP-binding protein) là Gsα Quá trình bám của GTP lên Gsα làm cho Gsα tách khỏi phức hợp protein Gsβγ và gây hoạt hóa enzyme Adenylate cyclase, làm gia tăng cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào

Vì vậy, enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được hoạt hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường Điều này dẫn đến kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và HCO3- ngăn tế bào lông nhung hấp thụ

Na+ Hàm lượng ion Cl- trong ruột già tăng lên, kéo theo nước từ tế bào di chuyển vào lòng ruột, gây ra tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998)

 Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable enterotoxin ST)

- Cấu trúc

Độc tố chịu nhiệt (ST) của các chủng vi khuẩn ETEC là những monomeric toxin có trọng lượng phân tử nhỏ, có chứa những gốc cystein tự do là những cầu nối disulfide giúp cho độc tố ổn định về nhiệt Hoạt tính của độc tố này có thể tồn tại ở 1000C trong vòng 15 phút Độc tố ST được chia thành hai nhóm là STa và STb

Heat-stable enterotoxin STa (STI): là một peptide gồm 18 hoặc 19 amino acid với trọng lượng phân tử nhỏ (khoảng 2 kDa) Cho đến hiện tại có 2 biến thể của độc tố STa

được tìm thấy là STp (ST porcine hoặc STIa) được tiết ra từ những chủng E coli phân

lập được trên lợn và STh (ST human hoặc STIb) từ những chủng vi khuẩn phân lập trên người Cả 2 biến thể này đều giống nhau ở 14 acid amin tận cùng, đây cũng chính là phần có chức năng của độc tố và được xem như là vùng độc tố Cả 2 biến thể có chứa

3 cầu nối disulfide được hình thành từ 6 acid amin Cystein là Cys6-Cys11, Cys7- Cys15

và Cys10-Cys18 Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C

(GCC) (Ozaki và cs, 1991; Gariepy và cs, 1987)

Hình 1.4 Cấu trúc độc tố ST

Cầu nối disulfide (màu đỏ) trên 2 biến thể của độc tố STa, vùng lõi của độc tố (gạch

bên dưới) (Fleckenstein và cs, 2010)

Heat – stable enterotoxin STb (STII): Độc tố STb là một chuỗi peptide chứa 48 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 5,1 kDa, trong đó có 4 acid amin Cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10-Cys48 và Cys21-Cys36 Chính các cầu nối này có vai trò giúp cho STb bền vững trong tế bào chất Độc tố STb và độc tố STa có cấu trúc độc tố và tính kháng nguyên không giống nhau, nên cả 2 đều không thể trung hòa độc tố còn lại (Dubreuil, 2008)

Theo Chengxian Zhang và cs, 2009: các gen estA mã hóa độc tố ST hoàn toàn

giống hệt nhau về trình tự giữa các chủng ETEC ở lợn Độc tố STa ban đầu tiết ra là một chuỗi 72 acid amin, sau khi xuyên vào tế bào chất chúng bị phân cắt thành độc tố chứa 18 đến 19 acid amin

Hình 1.5 Cầu nối disulfide (-S-S-) và các số chỉ vị trí acid amin trong cấu trúc độc

tố STb (Sukumar và cs, 1995)

- Cơ chế gây tiêu chảy

Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố STa (Gyles và cs, 2010)

STa: STa kết hợp với enzyme xuyên màng Guanylate cyclase C (GC-C), kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy Quá trình xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột và gây tiêu chảy của STa xảy ra nhanh, độc tố STa kích thích giải phóng cGMP đạt nồng độ tối đa sau 5 phút, tuy nhiên quá trình này duy trì trong thời gian ngắn (He và Yun, 2010)

Hình 1.7 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của độc tố STb (Gyles và cs, 2010)

STb: Tác động của độc tố STb là bám vào thụ thể của nó dẫn đến hấp thụ Ca2+ từ bên ngoài vào bên trong tế bào Sự gia tăng nồng độ Ca2+ trong tế bào sẽ hoạt hóa enzyme phospholipase, dẫn đến giải phóng acidarachidonic từ lớp màng lipid Acid này

sẽ kích thích tế bào sản sinh PGE2 và 5- hydroxyltryptamine( 5-TH) gây tăng tiết một

số ion Cl- vào ruột và ức chế hấp thụ Na+, cuối cùng là sự tích lũy chất lỏng trong lòng ruột và gây tiêu chảy (Gyles và Fairbrother, 2010)

1.2.2 Cơ chế gây bệnh của ETEC

(1) Lợn con ăn thực phẩm chứa vi khuẩn E coli gây bênh

(2) Vi khuẩn E coli bám vào các thụ thể trên biểu mô ruột non nhờ vào các kháng

nguyên bám dính, và sản sinh các loại độc tố đường ruột (ST và LT )

(3) Nước và chất điện giải không được hấp thu từ ruột vào cơ thể

(4) Lợn bị tiêu chảy, giảm cân, có thể gây chết

Hình 1.8 Quá trình lây nhi ễm và gây bệnh của ETEC

Cơ chế gây bệnh tiêu chảy của ETEC được tóm tắt ở hình 1.8 Các chủng ETEC xâm nhập vào động vật bằng cách trực tiếp hay gián tiếp xâm nhập vào đường ruột và khi có đủ điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nhân lên với số lượng lớn, bám vào các thụ thể trên biểu mô ruột non nhờ vào các kháng nguyên bám dính Hầu hết các ETEC gây bệnh sản xuất một hoặc nhiều yếu tố bám dính, chúng là yếu tố trung gian gắn ETEC với các thụ thể trên tế bào biểu mô niêm mạc ruột (GM1), vi khuẩn sẽ bám vào các lớp tế bào biểu mô nhung mao ruột và sản sinh các loại độc tố đường ruột như độc tố chịu nhiệt

ST, độc tố kém chịu nhiệt LT Chính những độc tố này tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm cho nước và chất điện giải không được hấp thu từ ruột vào cơ thể, ngược

lại thẩm xuất từ cơ thể vào ruột (Sarmiento và cs, 1988) Nước tập trung ở ruột làm cho ruột căng lên, cộng với khí do vi khuẩn E coli trong ruột lên men tạo ra càng làm cho

ruột căng lên, sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích hệ thần kinh thực vật

ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột mạnh đẩy nước và phân ra ngoài gây tiêu chảy ETEC là nguyên nhân tiêu chảy nghiêm trọng, có thể dẫn đến mất nước, mệt mỏi, và có thể gây chết (Gyles và Fairbrother, 2010 )

1.3 Một số nghiên cứu về vai trò của các độc tố đường ruột trong bệnh tiêu chảy

ở lợn

1.3.1 Nghiên cứu trong nước

Khi nghiên cứu về vai trò gây bệnh của E coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1-60

ngày tuổi, tác giả Trương Quang (2005) đã có kết luận: 100% mẫu phân của lợn bị tiêu

chảy phân lập được E coli với số lượng gấp 2,46-2,73 lần ở lợn 1-21 ngày tuổi và 2,1 lần ở lợn 22-60 ngày tuổi so với lợn không tiêu chảy Tỷ lệ các chủng E coli phân

1,88-lập từ lợn bị tiêu chảy có độc lực mạnh và các yếu tố gây bệnh cao hơn rất nhiều so với

ở lợn không bị tiêu chảy Cụ thể, yếu tố bám dính: 93,33% so với 33,33%; độc tố chịu nhiệt (LT): 90% so với 11,11%, cả hai loại ST+LT: 73,33% so với 1,4%, độc lực mạnh (giết chết 100% chuột): 90% so với 0%

Tìm hiểu nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tiêu chảy lợn con, Hồ Soái và cs (2005) đã nhận xét: 100% mẫu phân lợn tiêu chảy phân lập được E coli với số lượng nhiều gấp

2,37 lần ở lợn 1-45 ngày tuổi và gấp 2,31 lần ở lợn 45-60 ngày tuổi so với lợn bình

thường không tiêu chảy Độc lực của vi khuẩn E coli gây chết chuột từ 50-100%, thời gian gây chết 6-36 giờ Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E coli gồm: 60% có độc tố STb,

40% độc tố LT và 20% độc tố STa, 2 chủng sản sinh 2 loại độc tố STb và LT, 2 chủng sản sinh 3 loại độc tố STa, STb và LT

Nghiên cứu của Trịnh Quang Tuyên và cs (2003) cho biết yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được có sự khác nhau Các chủng sinh độc tố STb chiếm

tỷ lệ cao nhất (84,44%), tiếp đến là STa (60%) và thấp nhất là LT (32,22%) E coli

thuộc nhóm ETEC phân lập được có tỷ lệ khác nhau trong năm tổ hợp các yếu tố gây

bệnh là STa/STb: 3,33% và STb: 15,56% Độc lực của các chủng E coli rất mạnh, trong

9 chủng nghiên cứu có 7/9 chủng gây chết 100% số chuột (18-72 giờ) và 2/9 và gây chết 50% (18-36 giờ)

Nghiên cứu của Nguyễn Cảnh Dũng và cs (2011): vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu

chảy cho lợn con sau cai sữa nuôi tại Lâm Đồng với tỷ lệ bị tiêu chảy là 11,41% Tỷ lệ

phân lập vi khuẩn E coli là 74,71% (mẫu phân), 78,10% (bệnh phẩm) Yếu tố gây bệnh

của vi khuẩn E coli là 2 yếu tố bám dính F4 (40%) và F5 (15%); 4 yếu tố độc tố STb

(75%), STa (55%), LT (46%) Kết quả này cho thấy độc tố STb của các chủng vi khuẩn

E coli phổ biến nhất trong số các độc tố đường ruột gây bệnh tiêu chảy

1.3.2 Nghiên cứu trên thế giới

Theo nghiên cứu của Berberov và cs năm 2004 cho rằng chủng ETEC sản xuất

nhiều độc tố là nguyên nhân quan trọng của bệnh tiêu chảy ở người và động vật Lợn con Gnotobiotic đã được sử dụng để nghiên cứu tầm quan trọng của độc tố LT trong nhiễm một chủng ETEC sản sinh nhiều độc tố Kết quả là tất cả lợn con tiêm LT của chủng ETEC phát triển tiêu chảy sau 12-16h và tiêu chảy tiếp tục cho đến khi lợn con

bị tiêm chết 15/18 (83%) lợn con tiêm chủng ETEC (LT) phát triển giảm cân nặng và trở nên còi cọc Tỷ lệ phát triển của sự mất nước ở lợn con tiêm phòng với LT dòng đột biến (24,8% ± 3,9%) là thấp hơn so với lợn tiêm LT phổ biến của chủng ETEC (34,9%

± 3,4%) Sự mất cân bằng điện giải ở lợn con tiêm LT cũng xảy ra, lợn con tiêm LT – dòng đột biến có kali huyết thanh thấp hơn đáng kể và ít tăng nồng độ Cl- so với những lợn con được tiêm phòng với LT của chủng ETEC

Theo nghiên cứu của Zhang và cs năm 2006 Tất cả các chủng có K88+ đều xâm

chiếm ruột non của lợn con Tuy nhiên, chỉ có các chủng mang LT và STb dương tính mới gây ra tiêu chảy đáng kể Lợn con được tiêm với các chủng chứa K88+/LT+ đều mất nước sau 18h tiêm, trong khi lợn con được tiêm với các chủng chứa K88+/STb+ thì không, mặc dù tiêu chảy phát triển ở nhiều lợn con khác nhau Độc tố LT giúp ETEC nhân lên trong ruột của lợn con gnotobiotic, cụ thể số lượng CFU trong mỗi gram của hồi tràng từ lợn con được tiêm chủng 8035 (K88 +/LT +), 8015 (K88 +/STb +), và 8017 (K88 +) lần lượt là 1,2 × 10 9 , 5,7 × 10 8 , và 5,9 × 10 8 ; Khu vực thuộc địa của vi khuẩn

là 429,59µm2; 384,15µm2 và 1241,31µm2 ở động vật được tiêm lần lượt với các chủng

8017, 8015, và 8035 Từ những kết quả trên ta thấy LT và STb đóng vai trò lớn vào sự tiêu chảy do nhiễm ETEC

Năm 2008 Erume và cs khi nghiên cứu về vai trò của độc tố ST và LT góp phần

vào độc lực của ETEC cho biết tất cả lợn con được tiêm với các chủng khác nhau có STb, LT đột biến (MUN300) đã phát triển tiêu chảy nặng, giảm cân và sau đó xảy ra tình trạng hấp hối Nhìn chung trong số 20 lợn con được kiểm tra thì tình trạng hấp hối xảy ra trong khoảng từ 16-96h, đa số ở 71h và chỉ có một con lợn con MUN301 hấp hối

tại 96h Heo con tiêm LT bổ sung estB/eltAB đột biến (MUN301) có tỷ lệ trung bình giảm cân là 63% Mặt khác khi loại bỏ estB và eltAB đã ngăn chặn được sự phát triển

của tình trạng mất nước và điện giải mất cân bằng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự lưu hành các gen mã hóa độc tố đường ruột STa, STb, LT của các

chủng E coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy

Đánh giá sự tương đồng về nucleotide và acid amin của các gen mã hóa các loại độc tố STa, STb và LT

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Gen mã hóa độc tố STa, STb và LT của các chủng khuẩn E coli phân lập được từ

lợn con bị tiêu chảy

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ 2.1 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp khảo sát sự lưu hành của gen mã hóa độc tố STa, STb, LT

của vi khuẩn E coli

Gen mã hóa độc tố đường ruột STa, STb, LT của vi khuẩn E coli được xác định bằng phản ứng Multiplex-PCR theo mô tả của của Boerlin và cs năm 2005:

Xử lý và phân tích trình tự nucleotide

Giải trình tựKhuếch đại trình tự gen bằng PCRChọn ngẫu nhiên 10 chủng lần lượt mang các loại gen STa, STb và LT

Phân tích sản phẩm Multiplex - PCRKhảo sát gen mã hóa độc tố STa, STb, LT bằng Multiplex - PCR

Tách chiết DNAChủng E coli (ETEC)

 Tách chiết DNA

Mẫu DNA từ các chủng vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp sốc nhiệt Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường TSB (tryptosoy broth), vi khuẩn được thu hoạch bằng cách li tâm ở 40C với tốc độ 3000 vòng/phút, trong 5 phút Sau khi li tâm, xác vi khuẩn (cặn) được hòa tan trong trong nước không có enzyme Dnase, Rnase và đun sôi cách thủy ở 1000C trong 5 phút để phá vở màng tế bào Tiến hành sốc nhiệt bằng cách làm lạnh nhanh trong đá hoặc trong tủ lạnh từ 5-10 phút; ly tâm 4000 vòng/phút trong 4 phút Cuối cùng thu hoạch nước nổi phía trên có chứa DNA của tế bào vi khuẩn DNA được bảo quản ở 200C

 Các cặp mồi dùng trong phản ứng multiplex PCR

Các cặp mồi dùng trong phản ứng multiplex PCR thì được mô tả bởi P Boerlin và

cs năm 2005 với trình tự các cặp mồi được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự các mồi (primer) được sử dụng trong mutiplex-PCR

Mồi Trình tự mồi (theo chiều 5’-3’) Gen Kích cỡ (bp)

STa- F CAACTGAATCACTTGACTCTT estA 158

 Thành phần các chất và chu trình nhiệt trong phản ứng PCR

Các thành phần của phản ứng được liệt kê ở bảng 2.2, chu trình nhiệt trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex-PCR

Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian ( phút)

2.2.2 Phương pháp đánh giá sự tương đồng của các gen mã hóa độc tố STa, STb và LT

Để so sánh sự tương đồng của các gen mã hóa độc tố STa, STb và LT, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ đoạn gen mã hóa các loại độc tố

STa, STb và LT Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR được thiết kế dựa vào các chuỗi gen hiện có trên ngân hàng gen

Sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại được giải trình tự tại phòng Nghiên cứu và Phát triển, Công ty TNHH thương mại, sản xuất và dịch vụ Nam Khoa, Tp Hồ Chí Minh theo phương pháp Sanger

Trình tự nucleotide thu được tiến hành xử lý, so sánh, phân tích bằng phần mềm BioEdit

theo phương pháp ClustalW Multiple Alignment Trình tự nucleotide gen eltAB, estA và

estB của các chủng tham chiếu trên Ngân hàng gen có mã số là DQ778054, EU113243 (gen eltAB), M58746, M25607 (gen estA), M35729 và AY028790 (gen estB)

Mức độ tương đồng nucleotide gen eltAB, estA, estB và chuỗi acid amin của các loại

độc tố giữa các chủng vi khuẩn ETEC được phân tích theo phương pháp ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/)

ở Phân viện thú y miền Trung

- Các loại môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn như TSB (trypton soy broth), TSA (trypton soy agar)

- Các loại hóa chất dùng trong phản ứng PCR và điện di: Go Taq Green Master Mix (Prornega), agarose, Tris base, Boric axit, EDTA

 Trang thiết bị

Máy luân nhiệt (máy PCR), tủ hấp, tủ sấy, box cấy, hệ thống đọc gel, hệ thống điện di, máy ly tâm, máy trộn mẫu vortex, lò vi sóng

 Các dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường

Đĩa petri, các loại micro pipet, đầu tip, ống eppendorf