Báo cáo vi sinh 2 chuẩn

Dovậy cần tuân thủ một số quy tắc để đảm bảo an toàn cho bản than và chongười khác trong phòng thí nghiệm: - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật.. - Vẽ và mô tả hìn

BÀI 1

NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

1 Các quy tắc an toàn cơ bản trong phòng thí nghiệm

Các thao tác an toàn là yêu cầu rất quan trọng trong phòng thí nghiệm visinh vật nói chung Khoảng cách giữa người làm thí nghiệm phải hợp lý

để hạn chế tối đa sự di chuyển trong phòng thí nghiệm, bởi sự di chuyểnlàm xáo động không khí và làm tăng khả năng nhiễm trong quá trìnhphân tích Khi làm việc với vi sinh vật chúng ta thường thao tác với một

số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml).nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh nên cần luôn luôn cẩn thậnvới tất cả các chủng loại thao tác Mặt khác sinh viên cũng phải sử dụngnhiều hóa chất, trong đó có các axit hoặc những hóa chất có độc tính Dovậy cần tuân thủ một số quy tắc để đảm bảo an toàn cho bản than và chongười khác trong phòng thí nghiệm:

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm, mang khẩu trangkhi thao tác với VSV

- Mặc áo blouse trong thời gian làm thí nghiệm

- Trước khi bắt đầu làm thí nghiệm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lautẩm cồn 700 hoặc dung dịch diệt khuẩn khác, để khô Thực hiện tương

tự cho hai tay

- Cần ghi chú tên chủng, ngày, tháng làm thí nghiệm lên tất cả các hộppetri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy

- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm VSV ra nơi làm việc, dung khăn giấy tẩmchất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện việc khử trùng tại bàn làmviệc.

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Busen.Tắt ngọn lửa khichưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thaotác

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác pipet, không hút bằng miệng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cảmảnh vỡ vào một túi rác riêng

- Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng

- Tất cả các chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm VSV cần đượchấp khử trùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác Các dụng cụ, bìnhchứa nhiễm VSV cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn trướckhi rửa và tái sử dụng

- Cần gói cẩn thận bằng giấy báo hoặc ràng bằng băng keo khi đătchồng các đĩa pipet lên nhau

- Không mở hộp petri và dung mũi ngửi để tránh nhiễm VSV vàođường hô hấp

- Khi đốt que cấy có dính sinh khối VSV, cần đặt vòng hoặc đầu quecấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm VSV vào không khí

- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng trước khi rời phòng thínghiệm

2 Sổ viết nhật ký làm việc thí nghiệm

1 Cấu tạo của kính hiển vi

- Khi quan sát bằng kính hiển vi ta cần quan sát từ vật kính theo thứ tự4X, 10X, 40X rồi mới đến 100x.

- Chú ý : không sử dụng vật kính 100X để quan sát khi không cần thiết

- Nếu trên vật kính có ghi chữ oil thì cần nhỏ một giọt dầu set lên lamen

- Sauk hi dung xong kính phải dùng bông tẩm xăng lau đầu vật kính

- Vẽ và mô tả hình dạng, kích thước của vsv thuộc các nhóm đó

- Yêu cầu về kỹ năng:

+ Kỹ năng sử dụng kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử+ Kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản giọt ép

+ Kỹ năng quan sát đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiểnvi

- Cho một giọt nước vô trùng lên lame.

- Cho tiếp mẫu vi sinh vật lên rồi giàn đều khoảng 1cm2

- Đặt lamen lên ( tránh có bọt khí)

- Mang đi quan sát trên kính hiển vi

Chú ý: Nếu giọt nước tràn ra ngoài lam kính thì dùng giấy thấm bớt nước

hoặc dùng vaelin bôi quanh mép lam kính để giọt dung dịch không bịkhô

Cho vsv vào

nước giàn đều

2 Cách quan sát trên kính hiển vi

- Đặt tiêu bản (vết bôi) vừa thực hiện ở trên vào kinh hiển vi và cố địnhlại

- Bật đèn với kính hiển vi điện tử hoặc lấy ánh sáng mặt trời đối vớikính hiển vi quang học

- Sau đó ta tiến hành quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 4X Mắtnhìn vào thị kính và tay chỉnh ốc vi cấp ( chỉnh thô để đưa tiêu bảnlên) cho tới khi nhìn thấy ảnh mờ của sinh vật cần quan sát

- Tiếp tục ta chuyển lên quan sát bằng vật kính 10X, điều chỉnh ốc vicấp để nhìn rõ vsv hơn

- Làm tương tự đối với vật kính 40X

- Khi dùng đến vật kính 100 X ta phải nhỏ một giọt dầu soi lên trênlame và điều chỉnh sao cho vật kính chìm vào trong giọt dầu Điềuchỉnh nút vi cấp sao cho nhìn thấy vsv một cách rõ nhất

IV KẾT QUẢ

Mẫu nấm mốc Aspergillus ở ngô

- Vẽ và mô tả hình dạng, kích thước của vsv thuộc các nhóm đó.

- Yêu cầu về kỹ năng thực hành:

+ Kỹ năng sử dụng kinh hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử

+Kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản giọt ép

+ Kỹ năng quan sát các đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kínhhiển vi

1 Mẫu vật

- Quan sát tế bào vi khuẩn : sữa chua, nước dưa chua, các loại thựcphẩm ôi thiu…

- Nấm men: dịch ép hoa quả lên men, rượu nếp…

- Nấm mốc: thực phẩm bị mốc, bánh mì, hoa quả bị thối…

- Thuốc nhuộm : Xanh Methylen

Dung dịch gốc: pha 6g xanh Methylen trong 100ml rượu ethylic.Dung dịch thuốc nhuộm: hút 1ml dd trên pha trong 40ml nước cất

- Xăng hoặc xylen để lau kính hiển vi sau khi quan sát

- Dầu soi

1 Làm tiêu bản sống

- Lấy lam kính, lamelle sạch

- Sau đó nhỏ một giọt xanh Metylen lên trên lam kính

- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

- Dùng que cấy lấy một lượng mẫu vi sinh vật vừa đủ cho lên lam kính.( Đặt mẫu vi sinh vật ở giữa giọt xanh metylen ssau đó giàn đều ).

- Đậy lamelle lên và mang đi quan sát lần lượt với các vật kính 4X,10X, 40X và 100X

Xanh Cho vsv vào đậy metylen Dàn đều lame

2 Làm tiêu bản cố định

Khử trùng que cấy bằng đèn cồn

- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi sinh vật giàn đều lên trên lam kính, sau đó hơ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi sinh vật

- Nhỏ một giọt xanh methylen lên, để 1-2 phút

- Rửa lại bằng nước cất, thấm bớt nước trên lam kính

- Đợi 1 phút cho lam kính hết nước

- Đậy lamelle lên trên

- Mang mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi với các vật kính lần lượt là4X, 10X, 40X và 100X.( vật kính 100X khi quan sát ta phải sử dụng dầu soi)

1 giọt xanh metylen Giàn đều đậy lame Đèn cồn

3 Quan sát trên kính hiển vi

- Đặt tiêu bản vừa làm ở trên vào giá để tiêu bản của kính hiển vi và cốđịnh lại

- Bật đèn, tiến hành lấy ánh sáng từ phía ánh sáng mặt trời (đối với kínhhiển vi không có đèn).

- Tiến hành quan sát dưới vật kính 4X: mắt hìn vào thị kính, tay để vào

ốc chỉnh thô để đưa tiêu bản lên xuống sao cho từ đó ta xác định đượcđiểm cần quan sát

- Khi thấy hình ảnh mờ của vi sinh vật, ta chuyển lên xem ở vật kính 10X, và bắt đầu điều chỉnh ở nút vi cấp để thấy hình ảnh của vi sinh vật

rõ hơn

- Tiếp tục chuyển lên vật kính 10X

- Tới khi xem ở vật kính 100X thì ta nhỏ một giọt dầu lên trên lamelle.điều chỉnh để thị kính 100X sao cho đầu kim chìm trong giọt dầu Tiếnhành quan sát và điều chỉnh nút vi cấp để nhìn thấy hình ảnh của vi sinhvật một cách rõ nhất

Từ 4 - 20µm

2 Nấm mốc Có cấu tạo hình sợi phân

nhánh, màu sắc phong phú

Từ 3 – 10µm

Mẫu vi khuẩn lactic của nước dưa chua

Mẫu sữa chua

VK lactic

Mẫu nước thịt

Mẫu nấm mốc Aspergillus ở ngô

BÀI 4

QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT ( NHUỘM GRAM)

I MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU

- Quan sát, nhận biết và phân biệt được các loại vi sinh vật đang quan sát

- Vẽ và mô tả về hình thái, kích thước

- Yêu cầu về ky năng thực hành:

+ Kỹ năng sử dụng kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang hoc

+ Kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản giọt ép

+ Kỹ năng quan sát các vsv trên kính hiển vi

- Cách lấy giống vsv để làm tiêu bản:

Đốt đèn cồn lên.Một tay cầm ống nghiệm chứa vsv, tay còn lại cầm que cấy

hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng

Sau đó mở nắp ống nghiệm , khử trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn ,đưa que cấy vào lấy sinh khối của vsv ra

Sau khi kết thúc các thao tác thì hơ các dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn đểkhử trùng lần nữa

- Cách làm dịch huyền phù cho từng loại vsv:

+ Làm vào ống nghiệm+ cho một ít nước cất vào trong ống nghiệm+ dùng que cấy lấy một ít khối vi sinh vật cho vào trong ốngnghiêm

+ Lắc đều ta được dung dịch huyền phù

mẫu chứa vsv

nước

- Làm tiêu bản:

+ Lấy 1 giọt huyền phù vừa làm nhỏ lên lam kính+ Tán đều dung dịch huyền phù trên lam kính ra+Để khô tự nhiên hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô+ Nhỏ một giọt thuốc tím nhuộm gentian vào giữa vết bôi, để 1-2p+Rửa bằng nước( rửa nhẹ cho tiêu bản trôi hết màu) Để khô

+Nhỏ một giọt thuốc nhuộm Lugol vào giữa vết bôi (để trong 2p) sau đó rửa lại bằng cồn

1-+Nhỏ một giọt thuốc nhuộm FuchSin vào giữa vết bôi để trong tầm1-1.5p Sau đó rửa lại bằng nước

+Để khô hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn để vết bôi khô

+Mang đi quan sát dưới kính hiển vi

Tím gentina lugol FuchSin

giọt huyền phù

2 Quan sát dưới kính hiển vi

- Đặt tiêu bản vết bôi vừa làm ở trên vào giá để tiêu bản của kính hiển

vi và cố định lại

- Tiến hành quan sát ở vật kính 4X, khi thấy hình ảnh mờ của vsv tachuyển lên vật kính 10X và 40X.

- Tiếp theo sử dụng dầu soi để soi vật kính 100X

tế bào, có tiêu mao mọc khắp cơ thể, có thể di động , không hình thành bào tử

Nhuộm gram âm (-)

2 Bacillus Hình mầm

tròn hoặc hình bầu dục

Gồm cả hìnhque và hình bầu dục

Vi khuẩn E.coli

E.coli

Vi khuẩn răng miệng

Vi khuẩn cộng sinh : rễ cây

- Thuốc nhuộm : Xanh metylen hoặc tím Gential

- Xăng hoặc xylen để lau vật kính

1 Làm tiêu bản ép giọt

- Lấy một ít cao răng cho vào giữa giọt thuốc nhuộm

- Tán đều cao răng với thuốc nhuộm

- Đậy lame phía trên và mang đi quan sát dưới kính hiển vi

thuốc nhuộm cao răng

tán đều

2 Quan sát trên kính hiển vi

- Đặt tiêu bản (vết bôi) vừa thực hiện ở trên đặt vào giá để tiêu bản củakính hiển vi và kẹp lại

- Sau đó tiến hành quan sát từ vật kính 4X, 10X, 40X và 100X

- Riêng vật kính 100X phải sử dụng dầu soi

Vi khuẩn răng miệng

Vi khuẩn răng miệng

2 Mẫu môi trường

- Mẫu đất : Hòa tan 0.5g đất vào 4ml nước cất

- Mẫu không khí tại phòng thí nghiệm: Mở nắp đĩa thạch ra và đặt ở độ cao 1.5m trong phòng thí nghiệm Để sau 2 phút sai đó đậy nắp và ghinhãn

- Mẫu không khí tại cănng tin ký túc xá

- Mẫu không khí tại Cầu Diễn - Từ Liêm - Hà Nội

- Mẫu nước xống gần khu tái định cư Cầu Diễn

- Mẫu nước ký túc xá

3 Môi trường nuôi cấy lỏng (MPN)

- Môi trường Coliform ( pha 1l )

+ Lactoza : 10g+ Cao thịt : 5g+ Pepton : 10g+ NaCl : 5g+ Nước : 1000mlCân chính xác các hóa chất, các thành phần môi trường và hòa tan trong 1l nước cất

4 Môi trường nuôi cấy đặc (MPA)

- Thành phần:

+ Cao thịt : 5g+Pepton : 5g+Muối : 5g+ Thạch : 20g+ Nước : 1000mlCân chính xác các lượng hóa chất, thành phần môi trường rồi hòa tan trong 1000ml nước cất

1 Đối với phương pháp CFU (Colony for ming unit)

a Đối với mẫu đất

- Bước 1: Pha loãng mẫu:

+ Mẫu gốc: Hòa tan 0.5g đất với 4ml nước cất

+ Hút 0.5ml dung dịch từ ống 1 cho vào 4.5ml nước cất (ống 2).

+Hút 0.5ml dung dịch từ ống 2 cho vào 4.5ml nước cất (ống 3)

+ Hút 0.5ml dung dịch từ ống 3 cho vào 4.5ml nước cất (ống 4)

Ta được 1 dãy ống nghiệm có nồng độ giảm dần: 10-1 , 10-2 , 10-3, 10-4

0.5 g đất 0.5ml dd 0.5ml dd 0.5ml dd 0.5ml dd

4ml nước bình 1(10-1) bình 2(10-2) bình 3(10-3) bình 4(10-4)

Chú ý: Trước khi hút mẫu cần lắc đều các ống nghiệm.

- Bước 2: Lấy 0.1ml dd ở ống có độ pha loãng 10-4 cho vào đĩa petri

0.1ml dd có nồng độ 10-4

Yêu cầu: Khi chuyển dd vào đĩa petri cần tiến hành quan sát ngọn lửađèn cồn đê tránh nhiễm bẩn mẫu, chỉ mở hé đĩa petri nhỏ dd mẫu vàosau đó dùng que trang đã khử trùng trang đều ( nhẹ nhàng), vừa trangvừa quay đều hộp thạch Sau đó để vào tủ ấm ở 370C

- Bước 3 : Đếm mẫu pha loãng tối đa từ 25 – 300 khuẩn lạc Tính toán

số lượng CFU/1ml mẫu

+ Kết quả: Đĩa 1 có 25 khuẩn lạc Đĩa 2 có 36 khuẩn lạc+ Đĩa 1: CFU = A*D/V = 25*10-4/0.1 = 0.025(CFU/0.1ml)

+Đĩa 2: CFU = A*D/V= 35*10-4/0.1 = 0.036(CFU/0.1ml)+ Trong đó: A là số khuẩn lạc trung bình / đĩa

D là độ pha loãng

V là thể tích dung dịch huyền phù (ml)

- Ở nồng độ 10-4 trong 1ml mẫu có 0.25 CFU

→ Ở dd gốc trong 1ml mẫu có 2500 CFU nên trong 4ml dd ban đầu sẽ có

10000 CFU

→Trong 1g đất sẽ có 20000CFU

b Mẫu không khí:

- Tại căng tin ký túc:

+Thời gian lấy mẫu: 14h đến 14h02 ngày 21/11/2011+ Thời gian phân tích: 15h ngày 21/11/2011

+ Thời gian đọc kết quả : 15h20 ngày 25/11/2011+ Số khuẩn lạc 15

2 Phương pháp MPN (Most Probable numer)

- Tiến hành đối với mẫu nước cống (gần khu tái định cư Phú Diễn)

9ml dd môi trường nuôi cấy

ống Durham

- Bước 2: Pha loãng mẫu

+ Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm mỗi dãy có 3 ống nghiệm

+ Hút 1ml dung dịch nước cống cho vào mỗi ống nghiệm ở dãy 1 Ta

có nồng độ 10-1+ Hút 1ml dung dịch ở ống 1 cho sang từng ống một ở dãy ốngnghiệm thứ 2 Ta có nồng độ 10-2

+ Hút 1ml dung dịch ở ống 2 sang cho từng ống nghiệm thứ 3.Ta

được nồng độ 10-3.+Sau đó ủ ấm ở 370 C

Dd gốc 1ml 1ml 1mlDãy 1: 10-1

1 ml 1ml 1ml

9ml dịch dưỡng 1a 1b 1c

Dãy 2: 10-2

1ml 1ml 1ml 2a 2b 2cDãy 3 : 10-3

3a 3b 3c

- Bước 3: Đọc kết quả

+ Dãy 1 (độ pha loãng 10-1): 3 ống đều sinh bọt khí

+ Dãy 2 (độ pha loãng 10-2): 3 ống đều sinh bọt khí+Dãy 3 (độ pha loãng 10-3): 3 ống đều sinh bọt khíChỉ số dương tính là 3:3:3, so sánh với bảng tra MPN, dung cho 3 dãy ốngngiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp, cho biết số Coliform có xác suất lớpnhất MPN trong ông nghiệm có độ pha loãng 10-2 tính trong 1ml mẫu khôngpha loãng sẽ là lớn hơn 2400 Vậy trong 100ml mẫu không pha loãng sẽ là

HÌNH ẢNH VỀ MẪU

Mẫu đất

Mẫu nước ký túc xá

Mẫu khí trong phòng thí nghiệm

Mẫu khí trong căng tin ký túc xá