Báo cáo vi sinh Biofilm (màng sinh học) và quy trình sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

Màng sinh học (Biofilm) là cấu trúc tập hợp của vi sinh vật có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng trên cạn và dưới nước. Đây là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh vật. Việc hình thành biofilm đem lại nhiều lợi ích cho bản thân vi sinh vật giúp tế bào tồn tại và chống chịu được những điều kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của môi trường thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm. Theo nghiên cứu của Kokare và cộng sự trong tự nhiên tồn tại nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo biofilm bao gồm các vi khuần Gram dương ( Streptococcus. sp, Bacillus sutillis…) và Gram âm (Escheriachia coli, Pseudomonas aeruginosa).Người ta thường bắt gặp MSH dưới dạng lớp váng trên bề mặt các hồ nước tù đọng, nơi lớp đá sỏi ven sông, suối; những mảng bám trên thành tàu… Ở môi trường sống của con người, MSH sinh sôi tại nơi ẩm thấp như phòng tắm, sàn nhà, đường ống nước và ống dẫn nước thải… Trong cơ thể sống, MSH xuất hiện dưới dạng cao răng; lớp xơ hóa gây nhiễm trùng phổi, lớp mủ nhiễm trùng trên một vết thương… Ta có thể nhìn thấy MSH bằng mắt thườngMSH đầu tiên được Anthony Van Leewenhoek (người Anh) nghiên cứu năm 1684 là một mảng bám răng. Do thiếu công cụ và phương pháp, mãi đến cuối thế kỷ 20, giới khoa học mới nhận thức hết ý nghĩa và tầm quan trọng của MSH. Từ đó đến nay, số lượng nghiên cứu về MSH tăng vọt. Sau nhiều năm tìm hiểu, các nhà khoa học tin rằng, MSH là thành phần tự nhiên trong hệ sinh thái Trái Đất và hình thành MSH là xu hướng chung của các loại vi khuẩn. 

MỞ ĐẦU

Màng sinh học (Biofilm) là cấu trúc tập hợp của vi sinh vật có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng trên cạn và dưới nước Đây là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh vật Việc hình thành biofilm đem lại nhiều lợi ích cho bản thân vi sinh vật giúp tế bào tồn tại và chống chịu được những điều kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của môitrường thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm Theo nghiên cứu của Kokare và cộng sự trong tự nhiên tồn tại nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo biofilm bao gồm các vi khuần Gram dương (

Streptococcus sp, Bacillus sutillis…) và Gram âm (Escheriachia coli,

Pseudomonas aeruginosa).

Người ta thường bắt gặp MSH dưới dạng lớp váng trên bề mặt các hồ nước tù đọng, nơi lớp đá sỏi ven sông, suối; những mảng bám trên thành tàu… Ở môi trường sống của con người, MSH sinh sôi tại nơi ẩm thấp như phòng tắm, sàn nhà, đường ống nước và ống dẫn nước thải… Trong cơ thể sống, MSH xuất hiện dưới dạng cao răng; lớp xơ hóa gây nhiễm trùng phổi, lớp

mủ nhiễm trùng trên một vết thương… Ta có thể nhìn thấy MSH bằng mắt thường

MSH đầu tiên được Anthony Van Leewenhoek (người Anh) nghiên cứu năm

1684 là một mảng bám răng Do thiếu công cụ và phương pháp, mãi đến cuối thế kỷ 20, giới khoa học mới nhận thức hết ý nghĩa và tầm quan trọng của MSH Từ đó đến nay, số lượng nghiên cứu về MSH tăng vọt Sau nhiều năm tìm hiểu, các nhà khoa học tin rằng, MSH là thành phần tự nhiên trong

hệ sinh thái Trái Đất và hình thành MSH là xu hướng chung của các loại vi khuẩn

I Khái niệm

Các vi khuẩn sống bám và gắn kết với nhau trên các bề mặt vốn là nơi tích tụ nhiều chất dinh dưỡng Theo thời gian, tập hợp vi khuẩn và các chất do chúng tiết ra hình thành một lớp vật chất gọi là màng sinh học (biofilm)

Màng sinh học (MSH) là lớp vật liệu hữu cơ nhớt, hình thành từ cấu trúc cộng sinh của vi khuẩn, với thành phần gồm các phức hợp polysaccharide,

protein, DNA và nước (chiếm 97%) MSH có nhiều trong thiên nhiên, đặc biệt ở những vùng có độ ẩm cao

vì vậy, nhiều công nghệ ngăn ngừa MSH đã ra đời

Sự va chạm ngẫu nhiên các tế bào với bề mặt tạo sự bám dính lúc đầu, sự bám dính được khuyến khích bởi sự tương tác giữa 1 hay nhiều cấu trúc tế bào và

bề mặt Các cấu trúc tế bào bao gồm phần phụ chứa protein (pili, tiên mao), các protein bề mặt và các polysaccharide Sự gắn dính của một tế bào vào bềmặt là một tín hiệu để biểu hiện các gen mã hóa cho các protein tổng hợp các phân tử tín hiệu giữa các tế bào và bắt đầu hình thành mạng lưới Một khi chuyển sang hình thành biofilm, tế bào tự do mất tiên mao và không di động Việc chuyển từ tế bào phát triển tự do sang phát triển biofilm là do sảnxuất cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) Hầu hết các vi khuẩn sử dung c-di-GMP là chất truyền thông tin thứ 2 Đây là phân tử điều hòa nội bào, chuyển thông tin từ môi trường bên ngoài (tín hiệu thứ nhất) đến các bộ máy tế bào tạo đáp ứng thích hợp gồm di chuyển, độc tính và hình thành biofilm

Giai đoạn gắn kết: Vi khuẩn gặp được một bề mặt thích hợp tiến hành gắn kết Giai đoạn sinh trưởng: Sau vài giờ, lớp chất nhầy polysaccharide do vi khuẩn sản sinh ra phát triển thành cấu trúc 3 chiều, phức tạp tạo lớp màng sinh học hoàn chỉnh Các vi khuẩn liên tục trao đổi thông tin

Giai đoạn phân tán: MSH đã hoàn chỉnh sẽ phân tán để xâm chiếm bề mặt mới nhờ giải phóng các tế bào nhỏ

III. Quy trình sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

1 Giới thiệu sản phẩm

Thạch dừa (Nata de coco) được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn

Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già có bổ sung các chất

dinh dưỡng cần thiết Đây là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ cellulose vi khuẩn Sản phẩm thạch dừa là một món ăn tráng miệng dai, trong suốt Thạch dừa thô là sản phẩm trắng trong như thạch agar, hơi dai, có bản chất hoá học là polysaccharide nên không có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng có đặc tính kích thích nhu động ruột làm cho việc điều hoà bài tiết được tốt hơn Chế phẩm từ dừa này còn có tác dụng phòng ngừa ung thư và có thể giữ cho da được mịn màng Những năm gần đây, số lượng người mắc bệnh béo phì ở các nước phát triển đang gia tăng rất nhanh

Thạch dừa - loại thực phẩm chứa ít năng lượng và có giá trị cảm quan cao -

là một phương thuốc thần diệu để giảm nguy cơ mắc bệnh béo phì

2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

A xylinum là trực khuẩn trong chi Acetobacter , đây là loài có khả năng tạo

màng bacterial cellulose (BC) tốt nhất và nhiều nhất trong tự nhiên, là vi khuẩn Gram âm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không di động các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, có thể tích lũy 4,5% acetic acid Acetic acidsinh ra do hoạt động của vi khuẩn

pH tối ưu để A xylinum phát triển là tùy vào từng chủng và nó không phát triển

ở 370C ngay cả trong điều kiện dinh dưỡng tối ưu Theo Marcomide (1996)

thì A.xylinum có thể phát triển được ở pH từ 3 - 8, nhiệt độ 12-320C và nồng

độ ethanol lên đến 10%

Nguồn carbohydrate mà A xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là

glucose, fructose, manitol, sorbitol; hiệu suất thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose

Các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho A.xylinum gồm: phản ứng catalase, oxi

hóa ethanol thành acetic acid , chuyển hóa glucose thành acid , không sinh trưởng trên môi trường Hoyer, chuyển hóa glycerol, không tạo sắc tố nâu, khả năng tạo màng cellulose

Cơ chế tổng hợp BC của A xylinum từ nguồn đường glucose

Glucoseglucokinase

Glucose-6-phosphate Phosphoglucomutase

Glucose-1-phosphate UDP-glucose pyrophosphorylase

UDP-Glucose

Cellulose synthase

Cellulose

Đầu tiên các vi khuẩn sẽ tiết ra chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, tiếp đó là

sự hình thành các sợi cellulose được polime hóa từ glucose dưới tác dụng của enzyme có trong bao nhầy Các sợi này càng ngày càng dày lên và kết nối với nhau thành lớp cellulose có trong bao nhầy Lớp cellulose này sau đóđược thoát ra khỏi tế bào hoàn toàn

3 Phân lập và tuyển chọn chủng A xylinum cho sản xuất thạch dừa

Vi khuẩn Acetobacter có thể được phân lập từ dấm, rượu, bia, hoa quả, chuối

chín, váng giấm Ví dụ: muốn phân lập vi khuẩn acetobacter từ không khí, người ta pha rượu thành dung dịch 5 – 6% (hoặc theo kinh nghiệm dân gian, chỉ cần lấy một phần rượu hòa với 7 phần nước lã, đựng trong cốc miệng rộng, giữ ở tủ ấm 300 C trong 2 – 3 ngày Rượu sẽ đục và trên bề mặt xuất hiện một váng mỏng Lấy váng mỏng này pha loãng ra, và phân lập trên môi

trường thạch dĩa Để ức chế sự phát triển của các loại nấm men Mycoderma (thường phát triển đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter),

người ta bổ sung vào môi trường phân lập 1 – 1.5% acid acetic

Một ví dụ phân lập Acetobacter xylinum như sau:

 Môi trường 1: Dành cho phân lập

SA (amoni sunfat) 0,8%

DAP (diamoni phosphat) 0,2%

Ta sẽ phân lập các chủng vi khuẩn A xylinum từ màng của bia, chuối, giấm,

nước dừa Để tiến hành phân lập, trước tiên phải tiến hành làm dịch lên men.Cho vào bình tam giác có dung tích 500ml khoảng 200ml nước hoa quả hoặcgiấm hay bia, bổ sung 1-1,5% acetic acid, để ở nhiệt độ 28-32oC (nhiệt độ phòng) Sau 5-7 ngày, trên bề mặt dung dịch sẽ xuất hiện màng trắng

Tiến hành pha loãng váng trắng đến nồng độ 10-10 Sau đó cấy trang trên bề mặt môi trường phân lập để tách khuẩn lạc đơn Sau khi ủ từ 4-7 ngày, trên môi trường thạch đĩa xuất hiện các khuẩn lạc với kích thước khác nhau Hầu như các khuẩn lạc có đường kính từ 0,6-2,4 mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa dày lên và sẫm màu hơn xung quanh Cũng có dạng bề mặt xù xì nhăn nheo

Đĩa nuôi cấy ở nồng độ 10-10

Sau khi đã có khuẩn lạc đơn, ta lấy từng khuẩn lạc đơn, cấy trên ống thạch nghiêng chứa môi trường 2, mỗi khuẩn lạc là một mẫu, để giữ giống cần tiếnhành cấy chuyền 2 tháng 1 lần từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác Sau một thời gian tuyển chọn liên tục từ các nguồn nguyên liệu nói trên, đã phân lập được 60 mẫu vi khuẩn acetic

- Tiếp theo là làm tiêu bản nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi

- Nghiên cứu đặc tính sinh hóa của các chủng đã được chọn

Trong 60 mẫu phân lập được, sau khi tuyển chọn thì có 6 mẫu là chủng vi

khuẩn A xylinum

6 chủng vi khuẩn A xylinum được cấy sang môi trường 4 và được theo dõi khả

năng tạo màng Ở một vài chủng, màng xuất hiện vào ngày thứ 3, đa số xuất hiện ở ngày thứ 5 Ba ngày đầu kể từ khi phát hiện màng dày nhanh, những ngày sau đó màng phát triển nhưng chậm lại Sau 20 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở bảng sau

(+) có

(-) không

(++) màng dày tăng dần

(+++) màng rất dày và tăng rất nhanh

Hầu hết vi khuẩn A xylinum là vi khuẩn hiếu khí, vì thế trên môi trường lỏng bao giờ chúng cũng phát triển thành lớp màng Kết quả cho thấy 2 chủng A3

và A6 cho màng dày nhất Vì vậy 2 chủng này được giữ lại để tiếp tục nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng

Tiến hành nuôi cấy 2 chủng trên môi trường số 3 nhằm mục đích xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn

Tiến hành xác định số lượng tế bào tại các thời điểm: 0, 24, 48, 72, 96, 120,

144, 168, 192, 216, 264, 288, 312, 336, 360, 384, 408, 432 (h) bằng phương pháp đếm số lượng tế bào trên buồng đếm hồng cầu

Quá trình sinh trưởng của 2 chủng:

Số lượng vi khuẩn đạt cực đại sau 14 ngày nuôi cấy

Chủng Acetobacter xylinum được sử dụng trong quy trình sản xuất dưới đây có nguồn gốc từ Philippine và các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc tạo sản phẩm sẽ được khảo sát như sau

1 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa trong môi trường lên men

Hàm lượng nước dừa trong môi trường lên men ảnh hưởng đến năng suất lên men, hàm lượng chất khô cũng như độ dày sản phẩm tạo thành Sau đây là kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của yếu tố này (thể tích môi trường lên men là 500ml).Ta thấy hàm lượng nước dừa già tăng thì khối lượng và độ dày sản phẩm cũng tăng

2 ảnh hưởng của nguồn Nitơ

- Nguồn Nitơ sử dụng cho quá trình lên men là (NH4)2HPO4, (NH4 )2SO4

- Nồng độ (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của

A xylinum và khả năng tổng hợp cellulose cũng như độ dày của màng

cellulose tạothành

- Nồng độ của muối amoni quá cao: vi khuẩn không sử dụng hết, lượng muối

dư sẽ ức chế ngược trở lại sự phát triển của tế bào vi khuẩn Do đó ảnh hưởng đến hoạt tính của vi khuẩn, lượng cellulose sinh tổng hợp được sẽ thấp

- Nồng độ muối amoni quá thấp: lượng nitơ cung cấp cho quá trình sinh trưởng

và phát triển của A xylinum không đủ, hiệu suất sinh tổng hợp cellulose

không cao

- Mặt khác Nitơ còn có mặt trong nhiều thành phần như: acid nucleic,

một số vitamin tham gia vào quá trình tạo cellulose Nếu hàm lượng các chấtnày quá thấp hay quá cao sẽ ảnh hưởng tới tính chất hóa lý của môi trường

Vì vậy, ảnh hưởng tới quá trình tạo thành màng cellulose của A xylinum.

Tóm lại: Phải bổ sung một lượng muối cân đối, vừa đủ vào dịch lên men, tạo

điều kiện tối ưu cho A xylinum sinh trưởng và phát triển, có như thế

cellulose thu được mới nhiều và dày hơn

3 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon

- Do hàm lượng đường trong môi trường nước dừa già không cao nên ta phải bổsung thêm đường để đảm bảo nhu cầu sinh trưởng, phát triển và sinh tổng

hợp sản phẩm của A xylinum

- A xylinum có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như: lactose,

maltose, dextrin, galactose, saccharose, trong đó lên men đường glucose là

tốt nhất Ứng với mỗi loại đường, khả năng lên men của A xylinum là khác

nhau nên sự tổng hợp cellulose cũng không giống nhau

- Khi sử dụng glucose cho quá trình lên men sẽ cho khối lượng thạch dừa cao nhất và trạng thái thạch dừa thu được cũng rất tốt Tuy nhiên khi người ta làm thí nghiệm sử dụng saccharose ở các nồng độ khác nhau cho quá trình lên men thì người ta thấy rằng saccharose ở nồng độ 10% sẽ cho khối lượng thạch dừa cao nhất Trong thực tế sản xuất người ta thường sử dụng

saccharose do giá thành rẻ và cho năng suất khá cao

4 Ảnh hưởng của pH

- pH của môi trường lên men ảnh hưởng đến sự phát triển và hiệu quả sinh tổng

hợp cellulose của A xylinum

- Độ pH ảnh hưởng nhiều đến năng suất cũng như sự hình thành sản phẩm

- Theo kết quả của bảng trên ta thấy, ở pH < 3.0 và pH > 7.0 hầu như A

xylinum không phát triển được Chúng phát triển nhanh nhất trong khoảng

pH = 3.5 – 4.5, khối lượng và độ dày thạch tạo thành cũng cao nhất pH lên men phù hợp nhất là 4.0

5 ảnh hưởng của nhiệt độ

- Ngoài các yếu tố trên nhiệt độ lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành sản phẩm

- Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men thạch dừa là 28 – 320C Ở nhiệt độ này thạch tạo thành có khối lượng cao và dày chắc Ở khoảng nhiệt độ 20 – 250Cthì thạch mỏng và mềm hơn Nhiệt độ quá thấp (< 200C), thạch không hình thành hoặc nếu có thì tốc độ tồng hợp cũng rất chậm Nhiệt độ cao hơn (>

350C) môi trường lên men trở nên đặc sệt và ta cũng không thu được thạch dừa

V Sản xuất thạch dừa từ A xylinum

Sử dụng chủng Acetobacer xylinum có nguồn gốc từ Philippine

1 nhân giống

- Môi trường nhân giống: 1l nước dừa, 8g SA, 2g DAP, sucrose 20g

- Tiến hành nhân giống 1 cấp, 2 cấp hoặc nhiều cấp tùy vào qui mô sản xuất

- Môi trường được thanh trùng bằng cách đun sôi trong vòng 10-45 phút Để nguội đến 28-32oC cấy giống theo tỉ lệ 10% Lắc hay sục khí trong thời gian 18-20h Sau đó giống được đưa vào sản xuất

2 Chuẩn bị môi trường

- Nước dừa già được thu nhận ở các nhà máy cơm dừa nạo sấy Thành phần gồm đường, protein, dầu béo, khoáng, vitamin…hòa tan và một số hợp chất khác

- Lọc để loại bỏ tạp chất Dịch nước dừa sau khi được lọc, thu vào thùng chứa

- Bổ sung dinh dưỡng: cứ 10l nước dừa già bổ sung thêm 20g SA, 20g DAP, 700gr sucrose Tạo môi trường tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp sản phẩm

- Môi trường sau khi được bổ sung dinh dưỡng được thanh trùng bằng cách đunsôi trong 10-45 phút để tiêu diệt các vi sinh vật có trong môi trường Sau đó làm nguội

- Dùng acetic acid để điều chỉnh pH về 3,5-4,5, chỉnh nhiệt độ đến 28-32oC

3 Lên men

- lên men bề mặt, theo từng mẻ, các khay lên men được đậy kín

- Đổ môi trường vào các dụng cụ lên men bề mặt, cấy giống với tỷ lệ

10%.Trong suốt quá trình lên men cần chú ý các yếu tố môi trường có thể làm ảnh hưởng đến sản phẩm

4 Thu nhận và hoàn thiện sản phẩm

- Dùng vợt để vớt khối cellulose ra khỏi dịch lên men

- Dùng máy cắt để cắt khối cellulose thành miếng nhỏ đều đặn

- Ngâm sản phẩm trong dung dịch Na2CO3 3-5% trong 15 phút để trung hòa hết acid dư

- Xả nước lạnh để loại hết các chất còn dính trên sản phẩm

- Đun sôi để thạch dừa trong và đẹp hơn, bắt mắt hơn

- Ngâm đường

- Bổ sung syrup, hương trái cây

- Đóng gói

VI Đánh giá chất lượng sản phẩm

Mô tả sản phẩm: Sản phẩm thạch dừa có màu trắng trong, hơi đục, dai, mềm và

có mùi thơm do các thành phần bổ sung vào thạch dừa thô khi chế biến.Chỉ tiêu đánh giá chất lượng sản phẩm:

2 Chỉ tiêu hóa học

Độc tố: nước dừa ban đầu không chứa các độc tố nên yêu cầu sản phẩm không được chứa độc tố, trong quy trình sản xuất không nhiễm phải độc tố từ môi trường chế biến

Phụ gia: trong quá trình chế biến, có bổ sung thêm đường, acid, và các chất phụ gia nên yêu cầu sản phẩm không chứa dư lượng các chất phụ gia và bảo quản vượt quá giới hạn cho phép

3 Chỉ tiêu vi sinh:

Môi trường chứa thạch dừa có chứa đường và các loại vitamin, khoáng chất thích hợp cho sự phất triển của nấm mốc và vi sinh vật do đó mà cần chú ý vấn đề an toàn vi sinh cho thực phẩm thạch dừa

- Tổng số vi sinh vât hiếu khí: không quá 104 CFU/g, Phương pháp (PP) thử TCVN 5667:92

- E Coli: không quá 3 CFU/g, PP thử TCVN 5155:90

- Clostridium perfingens: không quá 10 CFU/g, PP thử TCVN 4991:98

- Staphylococus aureus: không quá 10 CFU/g , PP thử TCVN 5166:90