Báo cáo vi sinh E.coli và các bệnh đường ruột

Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm. Mỗi năm, ước tính ở Hoa Kỳ xảy ra 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca trên 100 nghìn dân), 2 triệu ca xảy ra ở Anh (3.400 ca100 nghìn dân) và 75 nghìn ca ở Pháp(1.220 ca100 nghìn dân). Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm). Theo một thống kê năm 2008, mỗi năm ở Việt Namcó khoảng 250 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000 10.000 nạn nhân và 100 200 ca tử vong. Nhà nước Việt Nam cũng phải chi trên 3 tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân. Tiền thuốc men và viện phí cho mỗi nạn nhân ngộ độc do vi sinh vật tốn chừng 300.000 – 500.000 đồng, các ngộ độc do hóa chất (thuốc trừ sâu, phẩm màu…) từ 3 – 5 triệu đồng, nhưng các chi phí do bệnh viện phải chịu thì còn lớn hơn nhiều. Một số vụ việc được nhắc đến gồm: Trong tháng 8 năm 2012 đã xảy ra 4 vụ ngộ độc thực phẩm làm 179 người bị ngộ độc, trong đó 2 trường hợp tử vong. Trưa 27112012, 74 nữ công nhân của Công ty TNHH Giày Uy Việt (KCN Đông Xuyên, TP Vũng Tàu) có dấu hiệu bị ngộ độc thức ăn sau khi ăn suất cơm chay. Ở quận 12, TP HCM, 148 công nhân Công ty Terratex, cùng có triệu chứng đau bụng, buồn nôn và chóng mặt. Theo các công nhân, thức ăn tập thể mà họ dùng do chính nhà bếp của công ty nấu. Đây là lần thứ hai công ty này xảy ra ngộ độc tập thể. Trong 2 ngày 6 và 732013, gần 30 người ăn bánh mì ở Đà Nẵng phải nhập viện với các triệu chứng nôn ói kéo dài kèm đau đầu. Chiều 2832013, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm Thái Bình cho biết đã có 69 người bị ngộ độc phải đưa vào Bệnh viện đa khoa Tây Tiền Hải để điều trị. Tất cả 69 người bị ngộ độc đều là công nhân của Công ty TNHH Global MFG Việt Nam. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, trong đó vi sinh vật cũng là nguyên nhân quan trọng. Đáng quan tâm nhất là E.coli. E.coli là vi khuẩn chỉ thị về vệ sinh thực phẩm rõ ràng nhất. Nếu phát hiện E.coli cho phép ta xác định được thực phẩm bị nhiễm bẩn tương đối do phân. Vi khuẩn này hiện diện một cách rất tự nhiên trong đường ruột của chúng ta, có cả hàng trăm chủng E.coli, đa số là chủng có lợi nhưng lại có một số chủng rất có hại. Vì vậy, việc nghiên cứu E.coli đang được các nhà nghiên cứu quan tâm.

A MỞ ĐẦU:

Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm Mỗi năm, ước tính ở Hoa Kỳ xảy ra 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca trên 100 nghìn dân), 2 triệu ca xảy ra ở Anh (3.400 ca/100 nghìn dân) và 75 nghìn ca

ở Pháp(1.220 ca/100 nghìn dân) Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy

ra, đặc biệt là ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Theo một thống kê năm 2008, mỗi năm ở Việt Namcó khoảng 250- 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Nhà nước Việt Nam cũng phải chi trên 3 tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân Tiền thuốc men và viện phí cho mỗi nạn nhân ngộ độc do vi sinh vật tốn chừng 300.000 – 500.000 đồng, các ngộ độc do hóa chất (thuốc trừ sâu, phẩm màu…) từ 3 – 5 triệu đồng, nhưng các chi phí do bệnh viện phải chịu thì còn lớn hơn nhiều Một số vụ việc được nhắc đến gồm: Trong tháng 8 năm 2012 đã xảy ra

4 vụ ngộ độc thực phẩm làm 179 người bị ngộ độc, trong đó 2 trường hợp tử vong Trưa 27/11/2012, 74 nữ công nhân của Công ty TNHH Giày Uy Việt (KCN Đông Xuyên, TP Vũng Tàu) có dấu hiệu bị ngộ độc thức ăn sau khi ăn suất cơm chay Ở quận 12, TP HCM, 148 công nhân Công ty Terratex, cùng có triệu chứng đau bụng, buồn nôn và chóng mặt Theo các công nhân, thức ăn tập thể mà họ dùng

do chính nhà bếp của công ty nấu Đây là lần thứ hai công ty này xảy ra ngộ độc tập thể Trong 2 ngày 6 và 7/3/2013, gần 30 người ăn bánh mì ở Đà Nẵng phải nhập viện với các triệu chứng nôn ói kéo dài kèm đau đầu Chiều 28/3/2013, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm Thái Bình cho biết đã có 69 người bị ngộ độc phải đưa vào Bệnh viện đa khoa Tây Tiền Hải để điều trị Tất cả 69 người bị ngộ độc đều là công nhân của Công ty TNHH Global MFG Việt Nam Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, trong đó vi sinh vật cũng là nguyên nhân quan trọng Đáng

quan tâm nhất là E.coli E.coli là vi khuẩn chỉ thị về vệ sinh thực phẩm rõ ràng nhất Nếu phát hiện E.coli cho phép ta xác định được thực phẩm bị nhiễm bẩn

tương đối do phân Vi khuẩn này hiện diện một cách rất tự nhiên trong đường ruột

của chúng ta, có cả hàng trăm chủng E.coli, đa số là chủng có lợi nhưng lại có một

số chủng rất có hại Vì vậy, việc nghiên cứu E.coli đang được các nhà nghiên cứu

quan tâm

Đề tài: “E.coli và các bệnh đường ruột”

B NỘI DUNG:

I Giới thiệu chung về E.coli:

1 Nguồn gốc và tên gọi:

Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli)

hay còn được gọi là vi khuẩn đại tràng là một

trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong

đường ruột của động vật máu nóng (bao

gồm chim và động vật có vú) Vi khuẩn này cần

thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành

phần của khuẩn lạc ruột Sự có mặt của E.coli

trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân E.coli thuộc họ vi

khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn

Năm 1885, tại München, một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Koch về vi khuẩn Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng Vi khuẩn do Escherich phát

hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Tuy nhiên, nó được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều

Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli dưới kính hiển vi với kích thước 2

kiểu gọi, đến năm 1919, vi khuẩn kia được định danh thống nhất toàn cầu

là Escherichia coli.

2 Đặc điểm:

a Đặc điểm hình thái:

E.coli là trực khuẩn Gram âm, có hình que,

2 đầu tròn, dài ngắn khác nhau Kích thước

trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;, trong

những điều kiện không thích hợp (ví dụ như

trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có

thể rất dài như sợi chỉ, thường đứng riêng lẽ từng tế bào, cũng có khi ghép từng đôi một, có khi kết với nhau thành từng đám hoặc một chuỗi ngắn Rất ít chủng

E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động

b Tính chất nuôi cấy:

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số có thể

phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tùy ý

Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C

Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng

20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có

váng mỏng Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn E.coli không mọc

trên canh thang Selenit

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M Trên môi

trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên

thạch lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey) Không mọc được trên môi trường SS.

Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh, như

EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton

c Tính chất hóa sinh :

E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi Hầu hết E.coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên

men rất chậm Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên

men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform.

E.coli có khả năng sinh indole Không sinh H2S Không sử dụng được nguồn carbon của citrate trong môi trường Simmons Có decarboxylase, vì vậy có khả năng khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic Betagalactosidase dương tính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính

Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia

E.blatta e

E.fergus onii

E.herma nnii

E.vulner is

E.alberti i

+: >90% dương tính -: < 10% dương tính T: 10-90% dương tính

*Cơ chế chuyển đổi: Indole được tạo ra bằng cách khử khử amin từ tryptophan qua các axit indolepyruvic phân tử trung gian Tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin, trong đó các amin (NH 2 ) nhóm các phân tử tryptophan được lấy ra Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là indole, axit pyruvic , amoni (NH 4 + ) và năng lượng Pyridoxal phosphate được yêu cầu như một coenzyme

d Kháng nguyên :

Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E.coli.

Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được chia thành ba loại: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử

Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định

e Phân loại :

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh Với

sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B)

Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli) hay E.coli gây tiêu chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).

_ Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:

EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột

EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột

EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột

DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán

EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột

_ Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:

MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não

UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

3 Quy trình tóm tắt xác định số lượng E.coli:

4 Một số phương pháp phát hiện E.coli:

Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập Bệnh phẩm phân được nuôi cấy trên môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên môi trường đặc, trước đây thường sử dụng thạch thường, hiện nay có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy đếm, vừa có khả năng định danh Tiến hành cấy máu khi nghi có nhiễm khuẩn máu

Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa học và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh mẫu

Chuẩn bị mẫu: Cân 50 g mẫu + 450ml dung dịch đệm phosphate

Số ống dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãngCấy ống dương tính lên EMB Ủ ở 350C/ 24 – 48 giờChọn khuẩn lạc điển hình làm thử nghiệm IMViC

Test IMViC

++ Đếm số ống EC dương tính với E.coli

E.coli

Để xác định các E.coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp

khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào nuôi, phương pháp đồng ngưng kết, ELISA, kỹ thuật khuếch đại gen PCR…

Có 2 loại phương pháp:

_Phương pháp truyền thống: phương pháp MPN, phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp làm giàu vi khuẩn…

_Phương pháp hiện đại: phương pháp PCR, phương pháp ELISA…

4.1 Phương pháp truyền thống: Phương pháp làm giàu vi khuẩn

a Nguyên lý

Phương pháp này dựa vào làm giàu vi khuẩn trước trong canh thang dinh dưỡng và MacConkey, rồi làm giàu trong canh thang LST và EE sau đó ria lên thạch L-EMB Những khuẩn lạc khả nghi được kiểm tra về đặc tính sinh hóa và huyết thanh của EEC

b Thiết bị và đồ thủy tinh

1. Chậu nước 440C và 41,50C

2. Tủ ấm 350C

3. Máy pha trộn

4. Ống nghiệm, pipet, đĩa Petri

c Môi trường và thuốc thử

1. Môi trường lên men (carbohydrate fermentation medium) (mt 46)

2. Thạch L-EMB (Levine’s methylene blue agar) (mt 76)

3. Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14)

4. Môi trường indole và thuốc thử (mt 44, mt 98)

5. Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt28)

6. Thạch MacConkey (mt 80)

7. Canh thang MacConkey (mt 17)

8. Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19)

9. Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6)

10. Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3)

11. Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86)

12. Canh thang urê (các thành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93)

13. Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54)

14. Kháng huyết thanh E.coli

d Cách làm

1. Chuẩn bị mẫu:

Cân 25g mẫu bằng thao tác vô khuẩn rồi cho vào 225ml canh thang MacConkey và 225ml canh thang dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làm đồng nhất trong 30 giây (1:10)

4. Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh :

Trung hòa canh thang LST và EE với 10% NaHCO3, nhỏ một giọt canh thang của mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh

đa giá OB và một giọt nước muối 0,5% Trộn các giọt trên và xem ngưng kết

5. Xác nhận tính chất sinh vật hóa học :

Ria từ canh thang LST dương tính lên thạch L-EMB và EE dương tính lên thạch MacConkey và thạch L-EMB Ủ ấm ở 350C trong 24h

e Chọn những khuẩn lạc điển hình và cấy vào môi trường: TSI, VP, indole,

urease, KCN, citrate và adonitol Đồng thời cấy lên mặt thạch nghiêng PCA cùng một khuẩn lạc dùng để kiểm tra huyết thanh

Đặc tính sinh vật hóa học của E.coli

-f Nhận diện huyết thanh E.Coli gây bệnh đường ruột:

*Thạch EMB: Thạch Eosin methylene thạch màu xanh, có chứa thuốc nhuộm eosin

và xanh methylene EMB agar chọn lọc bởi vì thuốc nhuộm anilin trong phương tiện truyền thông tím ức chế sự phát triển của sinh vật Gram dương Lactose men chuyển hóa đường lactose trong các phương tiện truyền thông và sản xuất các sản phẩm phụ axit, gây ra một sự thay đổi màu sắc trên môi trường Vì vậy, EMB cũng

là một phương tiện khác biệt Sản xuất axit mạnh mẽ bởi các sinh vật như E.coli

kết quả trong một ánh xanh kim loại Yếu hơn quá trình lên men kết quả lactose trong môi trường với một màu hơi hồng tím Thuộc địa của men nonlactose vẫn không màu, hoặc ít nhất không đậm hơn so với màu sắc của các phương tiện truyền thông

4.2 Phương pháp hiện đại: Phương pháp ELISA

a Nguyên tắc

Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate) Nếu có

sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác

phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.

Kháng nguyên ( Antigen ) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu Kháng nguyên

bao gốm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit Cấu trúc kháng

nguyên:

_E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K

(Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông)

_Kháng thể ( Antibody ) là protein ﻹ - globulin được sinh ra bởi tế lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên

Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit) Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml(một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104)

b Các phương pháp Elisa :

*ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:

_Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa) KN sẽ được cố định trên bề mặt Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết

_Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn

_Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu

chuẩn) Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.

_Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa

KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh

_Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme)

_Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ

_Thêm cơ chất Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại)

*Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein

nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KN (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này

(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi

(5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán

(6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp

ở bước 5)