chỉ thị phân tử AFLP

Kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR Đa hình độ dài các đoạn khuyếch đại Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) Để mô tả sự hiện diện của các độc tố alpha, beta, epsilon, iota bằng PCR của các chủng C. perfringens Phân tích sự da dạng di truyền của các chủng C. perfringens thông qua AFLP

Kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR

Đa hình độ dài các đoạn khuyếch đại Amplified fragment length polymorphisms

(AFLPs)

Phân tích độ dài di truyền

Kiểm tra dấu hiệu di truyền

Phân tích bộ sưu tập nguồn gene

Xây dựng bản đồ gene

Quản lí các chỉ thị thăm dò

6

Example 1

Clostridium perfringens

4 loại độc tố chính là: alpha, beta, epsilon

và iota

Có khả năng sinh hơn 14 loại độc tố

Là một trong những tác nhân gây bệnh

đường tiêu hóa ở vật nuôi

Clostridium perfringens là một trực khuẩn yếm khí

Use of single-enzyme amplified fragment length polymorphism for

chủng C perfringens

Vật liệu và phương pháp

1

3 Phản ứng phát hiện gen độc tố:

Các phản ứng được thực hiện trong 25 làn gel chứa:

 5,0 ml của mẫu DNA

 1,5 mM MgCl2

 200 mM của mỗi dNTP, 250 pmol của mỗi mồi oligonucleotide

 1,25 U của Taq DNA polymerase

Phản ứng ở 95ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, và 72ºC trong 1 phút Thực hiện trong 35 chu kì

Phản ứng phát hiện gen độc tố:

Các phản ứng được thực hiện trong 25 làn gel chứa:

 5,0 ml của mẫu DNA

 1,5 mM MgCl2

 200 mM của mỗi dNTP, 250 pmol của mỗi mồi oligonucleotide

 1,25 U của Taq DNA polymerase

Phản ứng ở 95ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, và 72ºC trong 1 phút Thực hiện trong 35 chu kì

Bacterial strains : Dạng sinh học A, Dạng sinh học B, Dạng sinh học C, Dạng

sinh học D

2

Tách chiết DNA

 1U của T4 DNA ligase, đệm ligase, và nước (tổng thể tích 20 ml)

 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 h

 Ligase DNA đã được đun nóng đến 80ºC trong 10 phút, pha loãng 1/5 trong nước cất vô trùng, và 5 ml được sử dụng cho mỗi phản ứng.

4

Phân tích thống kê

Phân tích các mô hình dải đã được thực hiện với phần mềm NTSYS (Numerical phân loại

và hệ thống phân tích đa biến) với hệ số Jaccard.

5

6

Kết quả

 Mỗi chủng có chứa từ 4 đến 12 mảnh vỡ DNA (band) khoảng 380-2,072 bp.

 Chủng tìm thấy là khác nhau liên quan đến sự hiện diện hay vắng mặt của ít nhất một band, và chiều dài của một band khoảng 1.050 và 1.450 bp.

Thảo luận

 Phát hiện gen mã hóa độc tố C perfringens bằng phương pháp PCR đã được thực hiện bởi một số tác giả, vì nó không cần sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm và không phụ thuộc vào sự hình thành bào tử trong ống nghiệm của cơ thể

 Typing là một công cụ dịch tễ học quan trọng đối với việc công nhận các ổ dịch, phát hiện ô nhiễm chéo và xác định nguồn lây nhiễm, nhận dạng của các chủng độc lực cao và giám sát các chương trình tiêm chủng.

Cây điều

Example 2

+ thuộc lớp cây hai lá mầm (Dicotyledoneae) + lớp phụ Archichlamideae

+ bộ Sapindales

+ họ Xoài (Anacardiaceae)

+ chi Anacardium

+ loài Occidentale

Vật liệu – phương pháp

 Vật liệu nghiên cứu gồm 26 mẫu DNA li trích từ lá điều

 Dựa vào các thông tin về nguồn gốc và các tính trạng của các mẫu lá điều đã được li trích DNA (bảng 1)

Phương pháp

 Từ nguồn nguyên liệu DNA được li trích sẵn, DNA sẽ được kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,4% và quang phổ kế

Phản ứng cắt và gắn adaptor

1X buffer T4 ligase có ATP; 0,05M NaCl; 0,05mg BSA; 1µl adaptor MseI; 1µl adaptor EcoRI; 2µl hỗn hợp enzyme (chuẩn bị ở trên); 600ng DNA mẫu

Nộ i d

un g 0 2

Nộ i d

un g 0 3

1µl primer nhân bản tiền chọn lọc

15µl hỗn hợp core mix AFLP

Biến tính ở 940 C trong 30s

Hồi tính ở 560 C trong 30s

Kéo dài ở 72+0 C trong 1’

Ủ ở 600 C trong 30’ và giữ lạnh ở

Ủ ở 600 C trong 30’ và giữ lạnh ở

Hỗn hợp phản ứng này được khuếch đại

PCR

3µl sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng

1µM primer EcoRI-ANN chất phát huỳnh quang

5µM primer MseI-CNN

15µl hỗn hợp core mix AFLP

Nhân bản chọn lọc

Phân tích

 Với 64 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc trên 4 mẫu PG5, PG6, TU9 và TU20 Kết quả khuếch đại chọn lọc được trình bày qua bảng 1

Kết quả

 Hình vẽ cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của 26 mẫu điều phân tích biến thiên từ 0,69 đến 0,92 => Như vậy, các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá gần nhau

Thank You !