Phạm Đức Tuấn Cục Lâm Nghiệp – Dự án DANIDA Tóm tắt ứng dụng của chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận
Trang 1Tạp chí NN&PTNT số 19/2007, trang 69-75
ứng dụng của chỉ thị phân tử (RAPD vμ ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền vμ xây dựng vườn giống cây
cóc hμnh
TS Nguyễn Việt Cường TTCNSH lâm nghiệp
TS Phạm Đức Tuấn Cục Lâm Nghiệp – Dự án DANIDA
Tóm tắt
ứng dụng của chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội
Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn của ở 6 xã
của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Aí thuộc tỉnh Ninh Thuận Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 (bảng 2) và 2 mồi lục
lạp gồm rnH - trnK và atpB - rbcL Kết quả cho thấy 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) có mức độ đa dạng di truyền thấp, mặc dù các cây trội được chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng
cách về không gian khá xa Từ bảng hệ số tương đồng của các dòng cây trội, có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau khi xây dựng vườn giống nhằm nâng cao khả năng tổ hợp chung của các cây trong vườn giống khi giao phối với nhau Các dòng có quan hệ di truyền quá gần gũi cần phải loại bỏ là X11, X22, X35, X37, X43, X50, như vậy 34 dòng còn lại vẫn đáp ứng được tiêu chuẩn công nhận giống cây lâm nghiệp TCN 147 -2006 về xây dựng vườn giống
Từ khóa: Chỉ thị phân tử, trình tự cpADN, cây Cóc hành
I Đặt vấn đề
Ngày nay công nghệ sinh học đã có những tiến bộ vượt bậc giúp cho các nhà khoa học rút ngắn được quá trình nghiên cứu chọn tạo giống của mình Kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu, còn gọi là chuỗi phản ứng trùng hợp hay kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được hoàn thiện vào giữa những năm 80 đã đem đến sự tiến bộ ở tất cả các lĩnh vực của sinh học hiện đại, trong đó chỉ thị phân tử đóng vai trò ngày càng quan trọng trong nghiên cứu đa dạng
di truyền (7) Những ứng dụng này giúp các nhà chọn giống loại bỏ nhanh và chính xác các cây có quan hệ di truyền quá gần gũi trong xây dựng vườn giống
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền chỉ thị RAPD (Ramdom Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên) được dùng phổ biến vì kỹ thuật này đơn giản,
ít tốn kém Còn để nhận dạng loài hay xuất xứ thường dùng chỉ thị lục lạp là do lục lạp có tính bảo thủ cao và quan trọng hơn nữa là tần số đột biến thấp hơn so với ADN nhân, nên sự đa hình của ADN lục lạp (cpADN) được sử dụng trong nghiên cứu về hình thái và quan hệ loài
như ở các chi Cistrus, Hemerocallis, Gordonia và Polyspora (6, 9, 10, 11)
Nghiên cứu đa dạng di truyền đối các loài cây bản đại chưa nhiều nhất là những loài cây mọc nhanh trong rừng khộp khô hạn ở vùng Ninh Thuận Trong bài này tác giả xin giới
thiệu về nghiên cứu đa dạng di truyền của loài xoan chịu hạn (Azadirachta excelsa) của Ninh
Thuận trong chọn lọc cây trội và loại bỏ các cây trội có quan hệ di truyền quá gần gũi trong
xây dựng vườn giống Xoan chịu hạn Azadirachta excelsa ở Ninh Thuận thường được gọi là
Cóc Hành, đây là loài cây bản địa, gỗ lớn có chiều cao 20 - 30m, thường mọc hỗn giao Cà chí, Căm xe Căm liên Bằng Lăng thực bì thảm tươi gồm có cỏ Long công, Táo rừng, Trâm bầu, Cứt lợn có phân bố ở nhiều nước như Campuchia Malaixia Philippin Việt Nam (1) Cóc hành có hoa nhỏ, trắng, lưỡng tính mọc ra ở những nhánh, từng chùm, có mùi hương thơm giống như mật ong, trái hình bầu đục dài từ 1- 2cm, có hạt cứng ở bên trong, khi chín có màu vàng hoặc vàng hơi xám và có một lớp cơm ngọt bao quanh hạt cứng Cóc hành loài cây mọc nhanh, ưa sáng, thân thẳng, rễ ăn sâu xuống đất và phân bố rộng để chống chịu với điều kiện gió mạnh và khô hạn của môi trường, cây xanh quanh năm, kể cả mùa khô khắc nhiệt của
Trang 2vùng Ninh Thuận (1) Bảng 1 tóm tắt một số đặc trưng hình thái chủ yếu của 3 loài: Cóc hành
(A exselsa) Xoan ta (M azedarach L), Xoan chịu hạn (A indica A.Juss) (2, 3, 4, 5, 8)
II Vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu
1 Vật liệu nghiên cứu
Các cây trội Cóc hành được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn của ở 6 xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc ái thuộc tỉnh Ninh Thuận Xã Ma Nới – Ninh Sơn tuyển chọn được 7 cây trội là X5, X41, X42, X22, X23, X24, X40; Xã Hòa Sơn – Ninh Sơn tuyển chọn được 18 cây trội là X39, X43, X44, X46, X47, X48, X49, X50, X14, X15, X16, X17, X18, X19, X20, X21, X8, X13; xã Phước Đại - Bắc Aí tuyển chọn được 5 cây trội là X26, X34, X35, X36, X37; xã Phước Hòa – Bắc Aí được 1 cây là X6; xã Phước Thắng – Bắc Aí được 8 cây là X1, X25, X27, X28, X29, X30, X32, X33, xã Phước Chính – Bắc Aí 1 cây là X3
Bảng1: Một số đặc trưng hình thái của 3 loài( Xoan ta, Cóc hành, Xoan chịu hạn)
Tên thường gọi
Tên khoa học
Xoan ta
M azedarach L
Cóc hành
A exselsa Jack
Xoan chịu hạn (Neem)
A indica A.Juss
nứt dọc, rộng
Nâu đen hay xám, nứt dọc, rảnh
Tán lá Rụng lá mùa đông,
xanh đậm
Thường xanh, xanh bóng
Thường xanh, vàng nhạt mùa khô
lần, lẻ, mép răng cưa
Kép lông chim 1 lần, chẵn, mép răng cưa
Kép lông chim 1 lần, chẵn, mép răng cưa
Hoa tự Cụm hình chuỳ Chùm màu trắng, mùi
mật ong, lưỡng tính
Chùm màu trắng
Quả-hình dạng
Dài
Bầu dục
2 – 3 (cm)
Bầu dục
1 – 2 (cm)
Bầu dục
1 – 2 (cm)
Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của hãng OPERON (Mỹ)
gồm: OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 (bảng 2) và 2 mồi lục lạp gồm rnH -
trnK và atpB - rbcL (bảng 3)
Bảng 2 Trình tự mồi RAPD
Trang 3Bảng 3 Trình tự mồi lục lạp
TT Tên mồi lục lạp Trình tự
trnK
ACG GGA ATT GAA CCC GCG CA CCG ACT AGT TCC GGG TTC GA
rbcL
TAG TCT CTG TTT GTT CTC AT ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG
2 Phương pháp
ADN genome của các cây trội Cóc Hành được tách từ các mẫu lá khô được bảo quản bằng silicagel theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% (thông thường ở các cây nông nghiệp sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose từ 1-1,5% để có độ phân giải tốt hơn, tuy nhiên đối cây rừng khi sử dụng agarose 0,8% đã cho độ phân giải rất tốt, xem các hình 1 từ 1 đến 5, do vậy trong nghiên cứu này không sử dụng agarose ở nồng độ cao để tiết kiện kinh phí), quan sát dưới đèn cực tím và chụp
ảnh bằng hệ thống Thermal Imaging SystemFTI-500, Farmacia Biotech
Kỹ thuật PCR với các mồi ngẫu nhiên RAPD được tiến hành với tổng thể tích là 25μl/mẫu gồm những thành phần sau: ADN tổng số (50 ng); mồi RAPD (10 ng); dNTP (2,5 mM); MgCl2 (50 mM); enzym Taq polymerase (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94oC - 4 phút; 94oC - 1 phút; 34oC – 1 phút; 72oC – 2 phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72oC -7 phút; giữ nhiệt độ ở 4oC
Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp được tiến hành với tổng thể tích là 25μl/mẫu gồm những thành phần sau: ADN tổng số (20 ng); mồi cpDNA (5 ng cho mồi xuôi và 5 ng cho mồi ngược); dNTP (2,5 mM); MgCl2 (50 mM); enzym Taq polymerase (0,25 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94oC - 4 phút; 94oC – 30 giây; 57oC – 1 phút; 72oC – 1 phút 45 giây, lặp lại 40 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72oC - 10 phút; giữ nhiệt
độ ở 4oC
3 Phân tích số liệu
Các băng ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo ADN chuẩn (ADN marker) Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu
là 0 Các số liệu này được đưa vào sử lý theo chương trình NTSYS pc để tính ma trận tương
đồng giữa các đôi mẫu theo phương pháp UPGMA dựa vào hệ số tương đồng di truyền Jaccard:
Jij = a/(n-d)
Trong đó: a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j; d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng
i và j; n: Tổng số băng thu được; Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j Số liệu thu được
được sử lý bằng phần mềm NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu
hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa các dòng cây trội Xoan chụi hạn Ninh Thuận (Azadirachta
excelsa)
III Kết quả nghiên cứu vμ THảO luận
1 Kết quả phân tích với các mồi RAPD
Trang 4S¶n phÈm PCR víi c¸c måi RAPD ®−îc ®iÖn di trªn gel agarose 1% (h×nh 1, 2 vµ 3)
A
1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 M
28 29 30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43 44 46 47 48 49 50 M
B
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
M 24 25 26 28 29 30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43
H×nh 1 S¶n phÈm PCR ADN genome cña mét sè c©y tréi Cãc hµnh víi måi OPC18 (A)
vµ OPC20 (B)
Trang 5
A
1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43
M 24 25 26 28 29 30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43
B
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
H×nh 2 S¶n phÈm PCR ADN genome cña mét sè c©y tréi Cãc Hµnh
víi måi OPC14 (A) vµ OPB17 (B)
Trang 6
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 29
30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43 44 46 47 48 49 50
A
30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43 44 46 47 48 49 50
B
(A) và OPC13 (B)
Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy: Các sản phẩm PCR ADN genome của các cây trội Cóc Hành với 6 mồi RAPD cho thấy chỉ có mồi OPC20 là không cho đa hình, 5 mồi còn lại cho đa hình nh−ng mức độ đa hình thấp Điều này cho thấy sự đa dạng thấp ở các cây trội
đã chọn lọc ở rừng tự nhiên tại 6 xã thuộc 2 huyện của tỉnh Ninh Thuận Trong 5 mồi này có các mồi OPC13, OPB10 và OPB17 cho nhiều băng đa hình hơn ở mồi OPC13 các mẫu X40, X42, X43 và X46 đ−ợc nhận biết do sự vắng mặt của các băng 5, 7,10, 12, 13, 15 và sự có mặt
Trang 72 Kết quả phân tích với các mồi lục lạp
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26
M 2 26 27 28 29 30 32 33 34 35 36 37 3940 41 42 43 44 46 47484950
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19
25 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 32 33 34 35 36 37 39404142 43
Hình 4 Sản phẩm PCR ADN genome
của một số cây trội Cóc hành với mồi
lục lạp atpB – bcL
Hình 5 Sản phẩm PCR ADN genome của một số cây trội Cóc hành với mồi
atpB – rbcL cắt bằng enzyme TaqI
Kết quả thử nghiệm trên hình 4, 5 cho thấy: Kết quả cho thấy về độ dài của sản phẩm PCR ở các cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận với cả 2 mồi lục lạp đều nhận được phân đoạn
đặc trưng và không có đa hình Điều này cho thấy mối quan hệ di truyền rất gần nhau của các cây trội đã chọn lọc Để có thể phân tích sâu hơn về sự khác nhau giữa các cây trội đã chọn
lọc trong xây dựng vườn giống hữu tính và vô tính, sản phẩm PCR với mồi lục lạp atpB – rbcL
được cắt với enzym TaqI với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự ADN, kết quả thể hiện trong hình 5 Sau khi cắt enzym cũng không xuất hiện đa hình, điều này cho thấy mối quan hệ di truyền rất gần nhau của các cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận trong rừng tự nhiên
ở 6 xã của 2 huyện thuộc tỉnh Ninh Thuận
Qua các kết quả phân tích với các mồi RAPD và lục lạp cho thấy chỉ có sự khác biệt nhỏ ở mức độ gen nhân, có thể là do tác động của điều kiện sinh thái lên các tính trạng thích nghi của từng vùng cụ thể
Trang 83 Quan hệ di truyền giữa các cây trội Cóc Hành và lựa chọn cặp bố mẹ trong xây dựng vườn giống (Quan hệ di truyền giữa các cây trội Cóc Hành được thể hiện trên hình 6 và hình 7)
Qua biểu đồ quan hệ di truyền (hình 6) và hệ số tương đồng di truyền hình 7 cho thấy các cây trội đã chọn lọc có mối quan hệ di truyền tương đối gần nhau (hệ số tương đồng di truyền từ 69% đến 100%) Chỉ có các mẫu 28, 40, 42, 43, 46 và 48 là có độ tương đồng di truyền dưới 80% còn lại 34 mẫu có độ tương đồng trên 80% Mặc dù đối tượng nghiên cứu là cây ở rừng tự nhiên, hơn nữa địa điểm chọn lọc các cây trội về không gian cũng khá xa nhau (
6 xã thuộc 2 huyện là Ninh Sơn và Bắc ái) Do đó trong chọn giống cây rừng nên ứng dụng công nghệ sinh học nhiều hơn nhằm rút ngắn thời gian và kinh phí trong đánh đa dạng di truyền của nguồn giống chọn lọc cũng như loại các cặp cây trội có quan hệ di truyền quá gần gũi khi xây dựng rừng giống và vườn giống nhằm nâng cao khả năng tổ hợp chung của các cây trong vườn giống khi giao phối với nhau
Nhìn vào hình 6, 7 ta có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau để xây dựng vườn giống, có 6 cặp Cóc hành có quan hệ di truyền rất gần gũi như cặp X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37 cần phải loại một nửa trong số đó trong vì chúng có hệ số tương đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981 Như vậy 6 dòng (cây trội ) cần loại khi xây dựng vườn giống là X11, X22, X35, X37, X43, X50 Theo tiêu chuẩn công nhận giống cây lâm nghiệp TCN 147 -2006 (Quyết định 4108/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng
12 năm 2006) khi xây dựng vườn giống vô tính thế hệ một cần phải có ít nhất 30 dòng vô tính,
đối chiếu với tiêu chuẩn công nhận giống, số dòng Cóc hành đưa vào xây dựng vườn giống là
số lượng dòng vô tính (34 dòng)
X1 X23 X44 X16 X3 X17 X5 X21 X47 X30 X32 X35 X8 X11 X34 X50 X13 X22 X19 X37 X15 X24 X25 X26 X14 X29 X33 X41 X39 X49 X6 X36 X18 X20 X48 X28 X40 X46 X42
Trang 9IV Kết luận
1 Kết luận: Từ kết quả nghiên cứu thực nghiệm trên, đề tài xác định:
1 Các dòng Cóc hành được nghiên cứu ở 6 xã thuộc 2 huyện của tỉnh Ninh Thuận
có mức độ đa dạng di truyền thấp
2 Có 6 cặp Cóc Hành có hệ số tương đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981 là cặp X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37
3 Các dòng Cóc hành có quan hệ di truyền gần gũi cần loại khi xây dựng vườn giống là X11, X22, X35, X37, X43, X50
2 Kiến nghị: Đây mới là các nghiên cứu bước đầu về đa dạng di truyền (mới sử dụng 6 mồi
RAPD và 2 mồi lục lạp) Để có thể phân tích sâu sắc và toàn diện hơn về sự khác nhau giữa các dòng Cóc hành, nên tiếp tục phân tích các mẫu với một số mồi lục lạp khác và tất cả các sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cần được cắt với các enzym giới hạn với mục đích tìm ra sự khác nhau trong trình tự cpADN (chloroplast DNA)
Tμi liệu tham khảo
1 Danh mục các loài thực vật Việt Nam tập II, nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội 2003
2 Lee S L Wickneswari R., Mahani M C., Zarki A H (2000), Mating System parameters in a Tropcal Tree Species, Shorea Leprosula Miq (Dipterocarpaceae), from Malaysian Lowland Dipterocarp Forest Biotropica 32 (4ê): 693-702
3 Nguyễn Tích và Trần Hợp , 1971 Cây rừng Việt Nam Nhà xuất bản Nông thôn, Hà Nội
4 Nicolosi E, Deng Z N, Gentile A, La Malfa S, Continella G, Tribulato E (2000),
”Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular
markers” Theor Appl Genet., 100, pp 1155-1166
5 Phạm Hoàng Hộ, 1991 Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất bản Montréal
6 Rohlf F J (1993), “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis
system”, Version 1.80 Applied Biostatitics, New York
7 Richar G, Olmstead, Jeffrey D, Palmer (1994), “Chloroplast DNA Systematics:
Areview of methods and data anlysis” American Journal of Botany, Vol 81, No 9,
1205 – 1224
8 Saghai Maroof M A., Biyashev R M., Yang G P., Zhang Q., Allard R W, (1994),
“Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity,
chromosome location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 91, pp
5466-5470
9 Trần Đình Lý, 1993 1900 cây có ích Nhà XB Thế Giới Hà Nội
10 Viện ĐTQH Rừng, 1980-1985 Cây gỗ rừng VN Nhà XBNN Hà Nội
11 Vụ KHCN, Bộ NN-PTNT, 2000 Tên cây rừng Việt Nam Nhà XB Nông nghiệp, Hà Nội
Trang 10Application of molecular marking (rapd and chloroplasts adn) in
research of inheritance diversity and establishment of
Nguyen Viet Cuong, Pham Duc Tuan
Summary The application of molecules marking (RAPD and chloroplasts ADN) in research of
inheritance diversity for 40 elite clones of Azadirachta excelsa, those were selected in dry
diptericarpaceae nature forest in 6 communes of Ninh Son and Bac Ai districts, Ninh Thuan province Stimulant used for PCR multiplication were RAPD random stimulants of OPERON Corporation (USA) comprising: OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 (table 2)
and 2 chloroplasts stimulants include rnH - trnK and atpB – rbcL The received outputs of this analysis showed that 40 elite clones of Azadirachta excelsa have low level of inheritance
diversity, although these plus trees were selected from nature forest and apart from each other Base on similar coefficient table of elite clones, we can select the parent couples with far inheritance relationships for establishment of seed orcharch in order to improve general combination of the plant in the seed orchard when crossing The near inheritance relative clones should be moved out including: X11, X22, X35, X37, X43, X50, so 34 remaining clones are still meet the sector standard 04 TCN 147-2006 on establishment of seed orchard
Keywoods: RAPD, Chloroplasts, Azadirachta excelsa
