CÔNG NGHỆ LÊN MEN THREONINE

CÔNG NGHỆ LÊN MEN THREONINE .Chức năng chính của threonine là hỗ trợ hình thành collagen và elastin hai chất liên kết tế bào trong cơ thể. Ngoài ra, nó rất tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch và thúc Sản xuất threonine GVHD: PGSTS Lê Văn Việt MẫnSVTH: Nhóm 5 Page 4đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất.Tuy nhiên, những người ăn chay cần phải cân nhắc loại acid amin này vì nó tồn tại chủ yếu trong thịt. Và để bổ sung threonine, bạn có thể ăn phó mát làm từ sữa đã gặn kem, gạo tấm, đậu tươi, lạc, hạt điều. Thế nhưng hàm lượng amin này trong các nguồn trên lại rất thấp, nên buộc phải dùng sinh tố bổ sung. Trong công nghệ hóa học: ứng dụng làm chất hoạt động bề mặt, làm mỹ phẩm… Trong Y học, dược học: dùng làm thành phần hòa tan trong thuốc chứa bệnh, hồi sức…1.2 Các phương pháp sản xuất threonine:

MỤC LỤC

Trang

1 Mở đầu ………3

1.1 Giới thiệu chung về threonine……….3

1.2 Các phương pháp sản xuất threonine……… 4

2 Nguyên liệu ……… 4

2.1 Nguồn nguyên liệu dùng trong công nghiệp……… 4

2.2 Nguyên liệu phụ 5

2.3 Giống Vi sinh vật 7

3 Quy trình công nghệ 9

4 Giải thích quy trình công nghệ 9

4.1 Xử lý rỉ đường 9

4.2 Chuẩn bị môi trường ……… 11

4.3 Nhân giống và cấy giống 12

4.4 Lên men 12

4.5 Ly tâm 15

4.5 Trao đổi ion 15

4.7 Cô đặc chân không 18

4.8 Sấy phun……….19

4.9 Đóng gói……… 20

5 Sản phẩm……… 21

5.1 Chỉ tiêu cảm quan………21

5.2 Chỉ tiêu hóa lý……… 21

5.3 Chỉ tiêu vi sinh……… 21

6.Thành tựu công nghệ 22

Danh Mục Hình

Hình 1.1.1.1 Công thức cấu tạo Threonine……… 3

Hình 2.3.1 Vi khuẩn E.coli 7

Hình 3.1 Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất L – Threonine 9

Hình 4.1.1.1 Thiết bị nồi phản ứng 10

Hình 4.1.3.1 Thiết bị ly tâm lọc 11

Hình 4.4.3.1 Con đường tổng hợp threonine 14

Hình 4.4.4.1 Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học 15

Hình 4.6.6.1 Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion 18

Hình 4.7.4.1 Thiết bị cô đặc chân không dạng màng rơi hai cấp 19

Hình 4.8.3.1 Thiết bị sấy phun kết hợp với sấy băng tải 20

Hình 5.1 Sản phẩm L- Threonine thương mại……… 21

Danh Mục Bảng Bảng 1.1.2.1 Lượng axit amin cần thiết trong thức ăn……….3

Bảng 2.1.1 Thành phần các chất trong mật rỉ……… 5

Bảng 2.2.1 Tiêu chuẩn của nước 6

Bảng 2.2.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men 7

Bảng 5.3.1 chỉ tiêu vi sinh của Sản Phẩm L- Threonine 21

1 Mở đầu :

1.1 Giới thiệu chung về threonine:

1.1.1 Cấu tạo:

Hình 1.1.1.1 Công thức cấu tạo Threonine

- Tên hóa học: (2S,3R)-2-Amino-3-hydroxybutanoic Acid

- Công thức hóa học: C4H9NO3

- Mã di truyền: ACU, ACC, ACA, ACG

- Khối lượng phân tử : 119.12 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy: 2560

C

1.1.2 Ứng dụng của threonine:

- Trong thực phẩm hằng ngày:

Trong những 20 acid amine đươc tìm thấy thì threonine là một trong 10 acid amine

không thay thế ( histidine, isoleucine, lysine, methionine, leucine, phenylamine, threonine, triptophan, Arginine và valine ) rất cần thiết cho bữa ăn hằng ngày

Bảng 1.1.2.1 Lượng axit amin cần thiết trong thức ăn

(Số mg axít amin trong 1g N trong protein, số trong dấu ngoặc là lấy sữa bằng 100 để

620 (100)

370 (100)

580 (100)

220 (100)

270 (100)

100 (100)

420 (100) Sữa

bò

320 (100)

590 (97)

410 (111)

630 (109)

200 (91)

270 (100)

92 (92)

480 (114)

(103)

530 (87)

410 (111)

660 (114)

380 (173)

290 (107)

100 (100)

440 (105) Thịt

bò

300 (94)

550 (90)

340 (92)

600 (103)

215 (98)

280 (104)

81 (81)

570 (136)

(88)

520 (85)

370 (100)

670 (116)

270 (123)

220 (81)

80 (80)

210 (50)

(75)

780 (128)

340 (92)

650 (112)

260 (118)

240 (89)

240 (89)

47 (47) Bột

mì

260 (81)

440 (72)

270 (73)

480 (83)

210 (95)

170 (63)

69 (69)

150 (36)

Chức năng chính của threonine là hỗ trợ hình thành collagen và elastin - hai chất liên kết

tế bào trong cơ thể Ngoài ra, nó rất tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch và thúc

đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất.Tuy nhiên, những người ăn chay cần phải cân nhắc loại acid amin này vì nó tồn tại chủ yếu trong thịt Và để bổ sung threonine, bạn có thể ăn phó mát làm từ sữa đã gặn kem, gạo tấm, đậu tươi, lạc, hạt điều Thế nhưng hàm lượng amin này trong các nguồn trên lại rất thấp, nên buộc phải dùng sinh tố bổ sung

- Trong công nghệ hóa học: ứng dụng làm chất hoạt động bề mặt, làm mỹ phẩm…

- Trong Y học, dược học: dùng làm thành phần hòa tan trong thuốc chứa bệnh, hồi sức…

1.2 Các phương pháp sản xuất threonine:

1.2.1 Thủy phân Protein:

- Cơ chất là bột mì, bột đậu nành, Protein từ máu, keratin…

- Đây là phương pháp cổ điển, hiệu suất rất thấp, khó thực hiện, và khó điều khiển các thông số

- Sản phẩm tạo ra sẽ nằm dưới dạng D

- Sản xuất threonine theo phương pháp này thì giá thành sản phẩm sẽ cao

1.2.2 Tổng hợp hóa học:

- Ưu điểm là sản xuất ổn định, có thể chuẩn hóa điều kiện sản xuất và hiệu suất

- Nhược điểm là vấn đề tinh sạch khó khăn do sản phẩm tạo ra dưới dạng hỗn hợp( dạng

L và dạng D)

- Ứng dụng trong công nghệ hóa học hay là làm thức ăn cho 1 số loài gia cầm

1.2.3 Chuyển hóa sinh học:

- Dùng những sinh khối của vi sinh vật để chuyển hóa 1 cơ chất thành sản phẩm thông qua 1 hay 2 phản ứng

- Vấn đề tinh sạch và điều khiển thông số khó hơn phương pháp lên men,

- Khó thực hiện vì phản ứng có thể là nội bào hay ngoại bào nên không có cơ chế điều hòa của vi sinh vật

- Cơ chất tham gia phải có cấu tạo tương tự như sản phẩm Nên phạm vi ứng dụng bị hạn chế

- Để khắc phục người ta kết hợp với phương pháp hóa học: tổng hợp ra các tiền thân của các acid amine sau đó dùng vi sinh vật để chuyển thành L- threonine

1.2.4 Phương pháp lên men:

- Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thức ăn để lấy acid amine

- Đây là phương pháp thông dụng nhất, sản lượng và sản phẩm tạo ra có chất lượng cao hơn, giá thành sản phẩm rẻ hơn

- Tận dụng được những nguồn cơ chất rẻ tiền, đơn giản.Phương pháp tiến hành và điều khiển thông số dễ dàng

2 Nguyên liệu :

2.1 Nguồn nguyên liệu dùng trong công nghiệp:

Trong công nghiệp nguồn nguyên liệu được sử dụng là dịch thủy phân tinh bột và mật rỉ đường Trong bài này ta sẽ khảo sát quá trình sản xuất threonine từ nguyên liệu là mật rỉ

- Thiết bị chứa citern

- Trong rỉ đường luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn,thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua,dẫn đến làm giảm chất lượng của rỉ đường.Vì vậy, trong sản

xuất ta hay dung fluosilicat natri để bảo quản

Tiêu chuẩn lựa chọn nguyên liệu:

- Chất khô >= 75%

- Hàm lượng saccharose : 50 - 51% lượng đường

- Hàm lượng N không ít hơn 1.4%

- Số lượng vi sinh vật không quá 15000 cfu/1g nguyên liệu

- Khi sử dụng rỉ đường, có thể dùng những con số sau để tính toán pha môi trường(%)

- Saccharose = 50%

- Đường khử: 6 - 9%

Cần bổ sung thêm :

Nguồn N là ure hoặc amoni sulfat

Nguồn P là supephosphat (khoảng 1% so với rỉ đường)

Rỉ đường trước khi đem sử dụng cần phải được xử lý: pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1, acid hóa bằng H2SO4 tới pH=2.8-3.0 và ly tâm thu dịch trong

2.2 Nguyên liệu phụ :

Tiêu chuẩn các nguyên liệu dùng trong lên men:

Nước: tiêu chuẩn nước dùng trong công nghệ thực phẩm

Bảng 2.2.1 Tiêu chuẩn của nước

2 mg/L

5 mg/L 0.3 - 0.5 mg/L

Chỉ tiêu vi sinh

Chỉ số Coli (số Coli/1 lít nước)

Chuẩn số Coli (số mL nước có

1Coli)

Vi sinh vật gây bệnh

< 20 >50

Trong số các loại này, thì E.coli và các chủng đột biến của nó có những ưu điểm là tốc độ

sinh trưởng cao Trong năm 2002, sản lượng sản xuất threonine của thế giới đạt khoảng

30000 tấn, với tốc độ tăng trưởng hàng năm khoảng 15%/năm

Qua đột biến tạo được các chủng tổng hợp threonine cao như là: E coli 7256, E coli

H-7729, E H-8311, E coli H-8460, E coli TF427, B flavum BD122, B flavum AJ12314 Trong bài này ta sử dụng giống: E coli TRN212

- Chi (genus): Escherichia

- Loài (species): E coli

- Tên hai phần: Escherichia coli

Đặc tính chung:

- Là loại trực khuẩn hình que, kích thước (1,1 - 1,5) x (2 - 6)μm, Gram (−) và yếm khí tùy tiện

- Loài vi khuẩn này có bộ gen di truyền giống như Shigella spp Chúng được xếp loại

theo tính kháng nguyên của chúng, chủ yếu là kháng nguyên loại O và H

- Loài vi khuẩn này chịu được môi trường axit và nhiệt độ lạnh tốt hơn hẳn các vi khuẩn khác

- Vi khuẩn này tồn tại rất lâu trong môi trường và nhạy cảm với việc thanh trùng

Tiêu chuẩn chọn giống:

- Khả năng sinh tổng hợp threonine càng cao càng tốt

- Khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng: dễ nuôi cấy, thích nghi tốt với môi trường, tốc độ sinh sản nhanh

- Điều kiện nuôi cấy: môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền

- Khả năng sinh độc tố: không có

- Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản

3 Quy trình công nghệ:

Hình 3.1 Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất L – Threonine

4 Giải thích quy trình công nghệ:

4.1 Xử lý rỉ đường:

4.1.1 Pha loãng sơ bộ:

4.1.1.1 Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình acid hóa

Trao đổi ion

Cô đặc chân không

- Vật lý: giảm độ nhớt

- Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất

4.1.1.3 Phương pháp thực hiện: pha loãng với nước theo tỉ lệ Vmật rỉ : Vnước = 1 : 1

có áo hơi

Bên trong thiết bị có cơ cấu đảo trộn dạng tuabin hở

Nồi phản ứng - máy trộn có thể tháo rời hay hàn cố định với các bộ phận đáy elip và nắp Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm, để nối ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để nạp và thải chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế Sau khi nạp vào thiết bị một lượng nước nhất định.Tiến hành đun nóng môi trường đến một nhiệt độ đã cho bằng phương tiện điều

6- Cửa thoát chất tải nhiệt;

7- Cửa vào của chất tải nhiệt;

- Dẫn động máy trộn được thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc

4.1.2 Xử lý dịch pha loãng: Acid hóa

4.1.2.1 Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật 4.1.2.2 Các biến đổi:

- Hóa học: đường saccharose chuyển thành glucose và fructose dưới sự xúc tác của acid; pH giảm về 2.8-3.0

4.1.2.3 Thiết bị : (hình 4.1.1.1)

4.1.3 Ly tâm thu dịch trong:

4.1.3.1 Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men

4.1.3.2 Các biến đổi:

- Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan

- Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng

- Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lượng riêng dung dịch

4.1.3.3 Thiết bị và thông số công nghệ:

Hình 4.1.3.1 Thiết bị ly tâm lọc

4.2 Chuẩn bị môi trường :

4.2.1 Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men

4.2.2 Các biến đổi:

- Hóa học: nồng độ đường đạt 15-22% khối lượng dung dịch, pH tăng

- Vật lý: nhiệt độ giảm

4.2.3 Thực hiện:

- Tiếp tục thêm nước để đạt được dung dịch có nồng độ đường từ 15-22% Đây là nồng

độ đường thích hợp cho quá trình lên men

- Thêm dung dịch NaHCO3 đến khi dung dịch đạt pH = 6.8 -7.2

4.3 Nhân giống và cấy giống:

4.3.1 Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men

4.3.2 Các biến đổi:

- Sinh học: số lượng tế bào tăng lên nhanh chóng

- Hoá sinh: xảy ra các phản ứng trao đổi chất

4.4 Lên men :

4.4.1 Bản chất : Nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các sản phẩm trao đổi chất là threonine

Trong đó treonine là chất trao đổi bậc 1

4.4.2 Mục đích công nghệ : Khai thác

Quá trình lên men nhằm thu nhận threonine từ nguồn nguyên liệu và vi sinh vật ban đầu

4.4.3 Các biến đổi:

- Vật lý:

+ Xuất hiện gradient nhiệt độ trong dung dịch

+ Khối lượng dung dịch bị thay đổi

+ Tỷ trọng dung dịch bị thay đổi

+ pH thay đổi

- Hóa sinh: Các phản ứng trong con đường tổng hợp Threonine

Hình 4.4.3.1 Con đường tổng hợp threonine

Để tạo ra lượng Threonine nhiều , ta nên ức chế con đường L – aspartate – β seminal dehyde tạo ra Lysine

+ Liên tục kiểm tra các thông số công nghệ trong suốt quá trình lên men để tạo ra

là tối đa Luôn giữ các điều kiện tối ưu cho vi khuẩn phát triển như: pH = 6.8 – 7.2, nhiệt độ từ 30– 320C

4.4.4 Thiết bị:

1- Động cơ; 2- Hộp giảm tốc; 3- Khớp nối; 4- Ổ bi; 5- Vòng bít kín; 6- Trục; 7- Thành thiết bị ; 8- Máy khuấy trộn tuabin; 9- Bộ trao đổi nhiệt kiểu ống xoắn; 10- Khớp nối; 11- Ống nạp không khí; 12- Máy trộn kiểu cánh quạt; 13- Bộ sủi bọt; 14- Máy khuấy dạng vít; 15- Ổ đỡ; 16- Khớp để tháo; 17- Ao; 18- Khớp nạp liệu; 19- Khớp nạp không khí

Hình 4.4.4.1 Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học

4.4.5 Thông số công nghệ:

Cấy giống vi sinh vật vào thiết bị lên men có đảo trộn cơ học, tiến hành lên men

bề sâu trong điều kiện yếm khí

- Nhiệt độ lên men: 30 - 32oC

- pH = 7

- Thời gian lên men: 2 ngày

- Lượng giống cấy : 5% thể tích dung dịch

- Lượng threonine tạo thành: 27g/L

- Vật lý: giảm thể tích và khối lượng của bán thành phẩm

- Hóa lý: thay đổi trạng thái từ dạng huyền phù sang dung dịch

- Hóa học: tổn thất một số chất theo bã

4.5.3 Phương pháp thực hiện:

Quá trình ly tâm có thể dùng máy ly tâm lọc ( Hình 4.1.3.1)

4.6 Trao đổi ion:

4.6.1 Nguyên lý :

Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự tương tác giữa điện tích của các acid amine trong mẫu và các nhóm tích điện được cố định trên bề mặt trao đổi Acid amine được gắn vào các bề mặt nhờ các liên kết tĩnh điện Sự bền vững của liên kết được xác định bởi trị số điện tích của acid amine, mà trị số này lại phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ muối (của dung dịch đệm)

Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các acid amine đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định,

ta có thể phân tách acid amine

Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương

Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm

Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột

Để phóng thích những acid amine này, có thể dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ

có pH khác hoặc thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn Khi đó, phân tử acid amine sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion

Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient

Các phân tử acid amine nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu Còn những acid amine nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại acid amine Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra

từ cột các loại acid amine khác nhau Có thể thu nhận dịch chiết acid amine sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động Ngoài việc dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người

ta có thể dùng các loại muối khác như KCl, Na3PO4, ta tăng nồng độ ion của pha động (dung dịch rửa giải) (sử dụng gradient, những ion này sẽ thay thế phân tử acid amine tương tác với các hạt mang điện tích

Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion âm, ta thêm muối natri clorua trong dung dịch tách giải bởi vì ion Cl- sẽ tranh bám vào cột với các acid amine có điện tích âm, do đó, những acid amine mang điện tích âm được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích Điện tích của acid amine phụ thuộc vào pH của môi trường:

- Nếu pH lớn hơn pI thì acid amine tích điện âm

- Nếu pH nhỏ hơn pI thì acid amine tích điện dương

- Nếu pH bằng pI thì acid amine không tích điện

Trong trường hợp threonine có pI = 5,64 nên nếu pH của dung dịch đệm lớn hơn 5,64 thì acid amine sẽ tích điện âm

Độ mạnh của tương tác tĩnh điện giữa acid amine và chất trao đổi phụ thuộc vào sự hác biệt giữa pI của và pH của dung dịch đệm Vì thế, threonine có pI = 5,64 sẽ được gắn chặt hơn trên cột trao đổi anion nếu acid amine ở trong dung dịch đệm có pH bằng 8 hơn tại

pH bằng 7 Để acid amine có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là

1 đơn vị so với pI của nó (cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit) pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp

4.6.2 Mục đích công nghệ: Khai thác

Bằng phương pháp trao đổi ion, ta thu được threonine tinh khiết hơn, nên mục đích của quá trình trao đổi ion là khai thác

4.6.3 Các biến đổi của nguyên liệu:

- Vật lý: khi ta cho các hạt nhựa trao đổi ion vào trong một dung dịch, chúng sẽ trương nở và gia tăng thể tích Kèm theo đó là sự solvate hóa xảy ra Các cấu tử tích điện trong mẫu lỏng

sẽ thế chỗ cho các ion trên pha rắn, ngược lại các ion trên pha rắn sẽ dịch chuyển vào mẫu lỏng Đồng thời các phân tử dung môi và chất tan sẽ dịch chuyển vào bên trong cấu trúc xốp của các hạt nhựa theo nguyên tắc thẩm thấu

- Hóa học: làm thay đổi thành phần hóa học trước và sau xử lý

- Hóa lý: một số cấu tử không tích điện sẽ bị hấp phụ trong mao dẫn của các hạt nhựa

- Hóa sinh và sinh học: trao đổi ion không làm biến đổi các quá trình hóa sinh và sinh học