Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men và PH đến quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt từ nguồn nấm men phân lập

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG PHAN THANH NHÀN KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NẤM MEN VÀ pH ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG THỐT NỐT TỪ NGUỒN NẤM MEN PHÂ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHAN THANH NHÀN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ

NẤM MEN VÀ pH ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT

RƯỢU VANG THỐT NỐT TỪ NGUỒN

NẤM MEN PHÂN LẬP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giáo viên hướng dẫn

PGs.TS Nguyễn Minh Thủy

Cần Thơ – 2010

Luận văn đính kèm theo đây, với tên đề tài “ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ

NẤM MEN VÀ pH ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG THỐT NỐT TỪ NGUỒN NẤM MEN PHÂN LẬP ”, do sinh viên Phan Thanh Nhàn thực hiện và báo cáo

đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

PGs.TS Nguyễn Minh Thủy

Cần Thơ, ngày 10 tháng 12 năm 2010

Chủ tịch hội đồng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của giáo viên hướng dẫn Cô Nguyễn Minh Thủy và chính tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong đề tài là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Cần Thơ, ngày 10 tháng 12 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Phan Thanh Nhàn

LỜI CẢM ƠN

Trãi qua gần 4 năm học tập dưới mái trường Đại Học Cần Thơ và hơn 12 tuần thực hiện đề tài tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Tất cả thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt kiến thức cho em trong thời gian em học tại trường

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Minh Thủy, đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, bổ ích cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Các anh chị quản lý phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 33 đã giúp đỡ em trong thời gian học tại trường và đóng gớp ý kiến quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng cũng là lời cảm ơn đến cha mẹ, những người đã tạo mọi điều kiện cho

em để có được thành quả này

Do thời gian thực hiện đề tài còn hạn chế, quá trình thực hiện đề tài còn gặp nhiều khó khăn do đó không thể tránh khởi thiếu sót Em xin chân thành đón nhận những

ý kiến đóng góp của thầy cô cũng như tất cả các bạn

Kính chúc quý thầy cô và các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM LƯỢC

Nhằm mục đích tận dụng nguồn nước thốt nốt thu hoạch ở Tịnh Biên, tỉnh An Giang để xây dựng quy trình sản xuất rượu vang thốt nốt chất lượng cao, các nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập (101106 CFU/ml) và chế độ pH thích hợp (3,5: 4,0: 4,5) Kết quả nghiên cứu cho thấy nước thốt nốt khi sử dụng mật số nấm men bổ sung 103 CFU/ml chế độ pH 4,0

và oBrix = 24 thì sản phẩm rượu vang có chất lượng tốt nhất (hàm lượng ethanol cao, tất cả các chỉ tiêu khác về hàm lượng đường sót, acid tổng, ester, SO2 và methanol điều đảm bảo đạt tiêu chuẩn Việt Nam) Đồng thời các mẫu rượu thốt nốt

lên men đối với dòng nấm men phân lập (Saccharomyces, Hanseniaspora và

Candida) cho loại rượu cho chất lượng tốt hơn (về tất cả các chỉ tiêu) so với dòng

nấm men thị trường (Saccharomyes cerevisiae)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

TÓM LƯỢC……… iii

MỤC LỤC……….iv

DANH SÁCH HÌNH……… vii

DANH SÁCH BẢNG……….viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về thốt nốt 2

2.1.1 Phân loại khoa học 2

2.1.2 Đặc điểm thực vật 2

2.1.3 Phương cách sử dụng 2

2.1.4 Thu hoạch và lợi ích kinh tế của thốt nốt 3

2.1.5 Thành phần hóa học của thốt nốt 4

2.2 Sơ lược về nấm men 4

2.2.1 Hình thái và kích thước tế bào nấm men 4

2.2.1.1 Hình thái tế bào nấm men 4

2.2.1.2 Kích thước tế bào nấm men 5

2.2.2 Những giống nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang 5

2.2.2.1 Saccharomyces vini 5

2.2.2.2 Saccharomyces uracum 6

2.2.2.3 Saccharomyces ovifromis 6

2.2.3 Những yêu cầu của nấm men được lựa chọn cho sản xuất 6

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men 7

2.2.4.1 Ảnh hưởng của oxy 7

2.2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 8

2.2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường 8

2.2.4.4 Ảnh hưởng của pH 8

2.2.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ rượu sinh ra 9

2.2.4.6 Ảnh hưởng của Nitơ 9

2.2.5 Các vi khuẩn có hại cho nấm men 9

2.2.5.1 Vi khuẩn lactic 10

2.2.5.2 Vi khuẩn acetic 10

2.2.5.3 Vi khuẩn butylic và các loại vi sinh vật khác 10

2.3Tóm tắt quá trình phân lập nấm men 11

2.3.1 Thu hoạch nước thốt nốt 11

2.3.2 Quá trình phân lập nấm men từ nước thốt nốt 11

2.4 Sơ lược về quá trình lên men rượu 12

2.4.1 Cơ chế của quá trình lên men rượu 12

2.4.2 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 13

2.4.2.1 Sự tạo thành acid 13

2.4.2.2 Sự tạo thành alcol cao phân tử 13

2.4.2.3 Sự tạo thành ester 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Phương tiện nghiên cứu 15

3.1.1 Nguyên vật liệu 15

3.1.2 Hóa chất sử dụng 15

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Bố trí thí nghiệm 17

3.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng của mật số nấm men từ nguồn phân lập và pH đến quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt 17

3.2.2.1 Mục Đích 17

3.2.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 17

3.2.2.3 Bố trí thí nghiệm 18

3.2.2.4 Phương pháp thực hiện 19

3.2.2.5 Các chỉ tiêu phân tích 20

3.2.2.6 Ghi nhận kết quả 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Kết quả ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng ethanol sinh ra 21

4.2 Kết quả ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng đường sót 22

4.3 Kết quả ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng acid tổng số 25

4.4 Kết quả ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng ester 26

4.5 Kết quả ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng SO2 28

4.6 Kết quả ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng methanol 30

4.7 So sánh sự khác nhau giữa hai dòng nấm men phân lập và nấm men thị trường 31

4.7.1 Kết quả nghiên cứu đối với dòng nấm men phân lập 31

4.7.2 Kết quả nghiên cứu đối với dòng nấm men thị trường 32

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

Tài liệu tiếng việt 36

Tài liệu tiếng Anh 36

Tài liệu trên internet 36

PHỤ LỤC………x

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU LÝ HÓA HỌC x

1.Phương pháp phân tích thành phần nguyên liệu x

1.1 Xác định tổng chất khô hòa tan x

1.4 Xác định pH x

2 Xác định hàm lượng đường trong thực phẩm theo phương pháp Bertrand x

3 Phương pháp xác định hàm lượng rượu xii

4 Xác định hàm lượng acid xii

5 Xác định hàm lượng ester xiii

6 Xác định hàm lượng SO2 xiii

7 Xác định hàm lượng methanol xiv

PHỤ LỤC 2: TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG VIỆT NAM (TCVN 7045:2002) xvii

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ xviii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cây thốt nốt……….2

Hình 2.2 Sản phẩm đường thốt nốt 3

Hình 2.3 Hình thái tế bào nấm men 5

Hình 3.1 Nguyên liệu nước thốt nốt 15

Hình 3.2 Thiết bị sử dụng cho quá trình nghiên cứu 16

Hình 3.3 Quy trình chế biến rượu vang thốt nốt tổng quát 17

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí khảo sát yếu tố ảnh hưởng của mật số nấm men từ nguồn phân lập và pH đến quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt 19

Hình 4.1 Hàm lượng ethanol của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH của dịch lên men………22

Hình 4.2 Hàm lượng đường sót (g/l)của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH của dịch lên men……….24

Hình 4.3 Hàm lượng acid tổng số (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH của dịch lên men 26

Hình 4.4 Hàm lượng ester (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH của dịch lên men……… 27

Hình 4.5 Hàm lượng SO2 (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pHcủa dịch lên men……… 29

Hình 4.6 Hàm lượng methanol %(v/v) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH của dịch lên men 31

Hình 4.7 So sánh sự khác nhau về hàm lượng ethanol %(v/v) sinh ra của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường 32

Hình 4.8 So sánh sự khác nhau về hàm lượng methanol %(v/v) của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường 33

Hình 4.9 So sánh sự khác nhau về các chỉ tiêu phân tích của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường 33

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của 100ml nước thốt nốt 4 Bảng 4.1 Hàm lượng ethanol %(v/v) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập

và pH……….21 Bảng 4.2 Hàm lượng đường sót (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập

và pH……….23 Bảng 4.3 Hàm lượng acid tổng số (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH……… 25 Bảng 4.4 Hàm lượng ester (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và

pH ……… 27 Bảng 4.5 Hàm lượng SO2 (g/l) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH

……… 28 Bảng 4.6 Hàm lượng methanol %(v/v) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập và pH……… 30 Bảng 4.7 So sánh sự khác nhau về các chỉ tiêu phân tích của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường 32 Bảng 1 Bảng quy đổi ra hàm lượng đường nghịch chuyển theo số ml dung dịch đường chuẩn……… xii Bảng 2 Bảng tiêu chuẩn chất lượng rượu vang Việt Nam (TCVN 7045:2002) xvii Bảng 3 LSD Phân tích phương sai ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập, pH đến hàm lượng ethanol xviiiBảng 4 LSD phân tích sự khác nhau về hàm lượng ethanol giữa các mẫu xviiiBảng 5 LSD Phân tích phương sai ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập, pH đến hàm lượng đường sót xixBảng 6.LSD phân tích sự khác nhau về hàm lượng đường sót giữa các mẫu xixBảng 7.LSD Phân tích phương sai ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập, pH đến hàm lượng acid tổng số xxBảng 8 LSD phân tích sự khác nhau về hàm lượng acid tổng số giữa các mẫu xxBảng 9 LSD Phân tích phương sai ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập, pH đến hàm lượng ester xxiBảng 10 LSD phân tích sự khác nhau về hàm lượng ester giữa các mẫu xxiBảng 11 LSD Phân tích phương sai ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập, pH đến hàm lượng SO2 xxiiBảng 12 LSD phân tích sự khác nhau về hàm lượng SO2 giữa các mẫu xxiiBảng 13 LSD Phân tích phương sai ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập, pH đến hàm lượng methanol xxiiiBảng 14 LSD phân tích sự khác nhau về hàm lượng methanol giữa các mẫu xxivBảng 15 LSD khác nhau về hàm lượng ethanol %(v/v) sinh ra của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường. xxivBảng 16 LSD khác nhau về hàm lượng đường sót (g/l) của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường. xxvBảng 17 LSD khác nhau về hàm lượng acid (g/l) của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường. xxvBảng 18 LSD khác nhau về hàm lượng ester (g/l) của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường. xxv

Bảng 19 LSD khác nhau về hàm lượng SO2 (g/l) của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường. xxvBảng 20 LSD khác nhau về hàm lượng methanol (g/l) của rượu lên men từ nấm men phân lập và nấm men thị trường. xxvi

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Rượu vang là một loại nước uống có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon,

và có lợi cho sức khỏe con người khi sử dụng một cách đều độ với liều lượng thích hợp Nguồn nguyên liệu cho chế biến rượu vang chủ yếu là các loại trái cây nhưng

để đa dạng hóa sản phẩm rượu vang trong nước, ngoài trái cây người ta đã phát hiện

ra một loại nước có giá trị dinh dưỡng cao và đủ tiêu chuẩn làm rượu vang như

nước thốt nốt

Ở nước ta, thốt nốt mọc và được trồng ở các tỉnh khu vực Nam Bộ giáp với Campuchia Riêng vùng Thất Sơn - An Giang người dân trồng và khai thác thốt nốt nhằm mang lại thu nhập hằng ngày Nước thốt nốt thì có vị chua ngọt dùng làm nước uống giải khát, dùng để nấu đường, chất lượng đường khác nhau tùy thuộc vào công nghệ chế biến của từng hộ dân

Bên cạnh đó, nước thốt nốt còn được làm rượu, loại rượu này được lên men chủ yếu theo phương pháp truyền thống, lên men tự nhiên nên chất lượng rượu rất kém và không thể bảo quản trong một thời gian dài

Các sản phẩm từ nước thốt nốt còn khá ít và phần lớn được chế biến theo phương pháp thủ công nên mất nhiều thời gian đã gây ra tổn thất rất lớn và sản phẩm làm ra vẫn chưa đáp ứng được thị hiếu của người tiêu dùng

Như vậy nghiên cứu chế biến đa dạng hóa sản phẩm từ thốt nốt là góp phần mang lại hiệu quả kinh tế cho tỉnh An Giang nói riêng và cho khu vực nói chung, làm gia tăng giá trị sử dụng và nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng thực phẩm từ thốt nốt ngày càng cao đồng thời còn có thể bảo tồn được nguồn lợi từ thiên nhiên của thốt nốt

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định mật số nấm men phân lập và pH thích hợp cho quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về thốt nốt

2.1.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Angiospermae

Lớp (class): Monocots

Bộ (ordo): Arecales

Họ (familia): Arecaceae

Chi (genus): Borassus L Hình 2.1: Cây thốt nốt

Loài (species): flabellifer

Tên hai phần: Borassus flabellifer

Thốt nốt (hình 2.1) có danh pháp khoa học là Borassus flabellifer L, thuộc họ cau (Arecaceae) - thốt nốt châu Á (miền nam châu Á) còn gọi đơn giản là thốt nốt (Ấn

Độ, Sri Lanka, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Malaysia, New Guinea)

Tên gọi thốt nốt trong tiếng Việt có nguồn gốc từ tiếng Khmer th'not Đây là loài

cây biểu tượng không chính thức của Campuchia

Hai loài thốt nốt là Borassus madagascariensis và Borassus sambiranensis được

liệt kê trong sách đỏ IUCN là dễ thương tổn và đang nguy cấp

2.1.2 Đặc điểm thực vật

Thốt nốt là các loại cây thân cau/dừa cao thẳng đứng, có thể cao tới 30m Lá dài, hình chân vịt, dài 23m Các lá chét dài 0,61,2m Cuống lá (mo) mở rộng Hoa nhỏ, mọc thành cụm dày đặc, thuộc loại đơn tính khác gốc Hoa đực nhỏ, có 3 lá đài, 3 cánh rời xếp lợp, 6 nhị ngắn, bao phấn 2 ô Hoa cái to, gốc có lá bắc, đài và tràng rời, bầu hình cầu, có 34 ô, 3 đầu nhị cong Quả lớn màu nâu hoặc nâu hạt dẻ

hình dạng hơi tròn với 3 hạch, hạt thuôn chia 3 chùy ở đỉnh

(Nguồn: http://images.google.com.vn)

Các cuống (bẹ) lá cũng có thể dùng làm hàng rào và có thể lấy ra sợi rắn chắc phù hợp cho việc làm thừng, chão hay chổi Gỗ màu đen là loại gỗ cứng, nặng và bền,

có giá trị trong xây dựng

Từ cây này người ta cũng tạo ra nhiều loại thức ăn Các cây non được đem nấu nướng như là một loại rau hoặc nghiền, giã hay nướng để làm thức ăn Quả ăn dưới dạng tươi hay nướng, người ta còn ăn cả các hạt non tựa như thạch Dịch ngọt có thể thu được từ các bông mo non (kể cả hoa đực lẫn hoa cái) Nó được dùng lên

men để làm một loại đồ uống, gọi là rượu arac, hoặc được cô đặc để sản xuất một loại đường thô gọi là đường thốt nốt Tại Indonesia người ta gọi nó là Gula Java

(đường Java) và được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực của người dân Java Ngoài ra,

nhựa từ thân cây cũng được dùng làm “một loại thuốc nhuận tràng” Các giá trị y

học cũng đã được quy cho các phần khác của cây(http://vi.wikipedia.org/wiki/)

2.1.4 Thu hoạch và lợi ích kinh tế của thốt nốt

Thốt nốt được trồng tối thiểu 1520 năm mới bắt đầu thu hoạch, khi thu hoạch thốt nốt phải dùng cây tre gai đực buộc cặp vào thân cây làm điểm tựa (cây đài) mới có thể leo lên tới ngọn (một cây thốt nốt phải sử dụng 23 cây đài nối với nhau) Dụng

cụ đựng nước thốt nốt thu hoạch được làm bằng ống tre hay ống nhựa Mỗi cây thốt nốt có thể cho từ 1015 lít nước/ngày

Ngoài thu hái trái để chế biến đường thốt nốt (hình 2.2) và thạch thốt nốt, người ta còn tận dụng các nguồn nguyên liệu từ lá, gỗ…Để sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ như làm tranh, thảm, giỏ, quạt, mũ, gỗ gia dụng

Hình 2.2 Sản phẩm đường thốt nốt

(Nguồn: http://images.google.com.vn)

Ở Việt Nam thốt nốt mọc và được trồng ở các tỉnh khu vực Nam Bộ giáp với Campuchia Riêng vùng núi Thất Sơn, An Giang hiện có hơn 100.000 cây thốt nốt

trồng tập trung ở các huyện Tri Tôn, Tịnh Biên, trong đó có gần 60.000 cây đang trong thời kỳ cho thu hoạch trái, nước thốt nốt Theo thống kê của ngành công nghiệp An Giang, mỗi năm rừng thốt nốt ở An Giang cung cấp khoảng 5.600 tấn đường, trị giá khoảng 56 tỉ đồng Nếu triệt hạ rừng thốt nốt đang cho thu hoạch để bán gỗ thì chỉ thu được 24 tỉ đồng (http://vietbao.vn/Phong-su/Rung-thot-not-lam-nguy)

2.1.5 Thành phần hóa học của thốt nốt

Thành phần hóa học của thốt nốt được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của 100ml nước thốt nốt

(Nguồn: Hoàng Xuân Phương, 2004)

2.2 Sơ lược về nấm men

2.2.1 Hình thái và kích thước tế bào nấm men

Nấm men (the yeast) là cơ thể đơn bào phân bố rộng ở khắp nơi, đặc biệt chúng có

mặt nhiều trong đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Ngoài ra, chúng còn hiện diện trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang

2.2.1.1 Hình thái tế bào nấm men

Nấm men thường có hình dáng khác nhau như hình cầu, hình elip, hình bầu dục và

cả hình dài Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi

gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pseudomycelium) Hiện tượng này thường thấy ở các loài Endomyces, Endomycopsis, Candida, Trichoporon Một số

hình thái của nấm men được trình bày ở hình 2.3

(a) Tế bào hình cầu (b) Tế bào hình elip

(c) Tế bào hình bầu dục (d) Tế bào hình sợi

Hình 2.3 Hình thái tế bào nấm men

(http://www.scientistlive.com/European-Food-Scientist/Ingredients)

2.2.1.2 Kích thước tế bào nấm men

Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ 510 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình của tế bào nấm men như sau:

Chiều dài từ 910m; chiều rộng từ 27m

Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện môi trường nuôi cấy, theo tuổi sinh lý của tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.2.2 Những giống nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang

2.2.2.1 Saccharomyces vini

Nấm men này phổ biến trong lên men nước quả, chiếm 80% tổng số có trong nước quả lên men, khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng chủng: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông

Nguồn carbon của nấm men này là đường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, acid biotin, mezoinozit, thiamin

Đa số các tế bào loại này hình oval, có kích thức từ 312µm, sinh sản theo lối nẩy

chồi và tạo bào tử Saccharomyces vini sinh ra enzyme invertase có khả năng khử

đường saccharose thành fructose và glucose Chủng này lên men chỉ đạt 8 đến 10%

hàm lượng rượu theo thể tích Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces vini kết

lắng nhanh và làm trong rượu (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.2.2 Saccharomyces uracum

Men này được tách ra từ nước nho, rượu và nước quả lên men tự nhiên, về hình thái

nó không khác với các loại men khác Khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch malt Các chủng của loại có thể lên men đến 1213 độ cồn (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.2.3 Saccharomyces ovifromis

Được tách ra từ nước quả nho lên men tự niên, những loại nấm men này ít hơn so

với Saccharomyces vini Giống này có khả năng chịu được cồn cao, lên men và có

thể tạo thành 18 độ cồn

Trong quá trình lên men Giống này tạo thành trong dịch quả

Saccharomyces ovifromis lên men được glucose, saccharose, maltose và 1/3

raffinose, không lên men được lactose và pentose Nhìn chung, hai giống men rượu

vang Saccharomyces ovifromis và Saccharomyces vini, được dùng nhiều trong sản

xuất Nhiệt độ thích hợp 1215oC, ở 35oC sự sinh sản của nó bị ức chế, ở 40oC sự sinh sản của nó dừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16oC sinh sản và lên men bị kéo dài Các điều khiện hóa lý, thành phần chất lượng dịch quả cũng như pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm men (Lương Đức Phẩm, 2006)

Nhiều nghiên cứu cho thấy các chi, giống, loài của nấm men khác nhau thì khác nhau về: tốc độ sinh trưởng, hoạt lực lên men, khả năng tạo cồn, chịu nóng, chịu lạnh, khả năng chịu cồn cao cũng như khả năng sinh các sản phẩm lên men thứ cấp ảnh hưởng đến hương vị của rượu vang

2.2.3 Những yêu cầu của nấm men được lựa chọn cho sản xuất

Hương vị đặc trưng của từng loại rượu sẽ phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính của nguyên liệu và quy mô công nghệ đồng thời nó còn phụ thuộc vào chủng nấm men được sử dụng cho lên men Nấm men được phân lập và sử dụng cho sản xuất phải đạt một số yêu cầu sau:

 Có hoạt lực lên men cao đối với nước quả

 Sử dụng đường cho lên men gần như hoàn toàn

 Khả năng kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh

 Chịu được độ cồn cao, acid của môi trường cũng như các chất sát trùng

 Tạo được rượu thơm ngon tinh khiết

Hiện nay phương pháp lên men rượu vang tự nhiên không còn được ưa chuộng nữa

vì quá trình lên men tự nhiên khó kiểm soát và hiệu suất rượu thường không cao Phổ biến hiện nay trong lên men vang thường sử dụng các giống thuần chủng để tiến hành lên men Nước quả sau khi điều chỉnh pH, độ đường thường được xử lý bằng SO2 để tiêu diệt các vi sinh vật tồn tại trong nó và sau đó tiến hành bổ sung các giống nấm men đã được phân lập thành giống thuần chủng để lên men

Phương pháp sản xuất rượu vang từ những chủng men thuần khiết đang có nhiều triển vọng vì:

 Thời gian lên men nhanh

 Quá trình lên men không bị ngừng lại giữa chừng

 Hàm lượng đường trong dịch quả được lên men triệt để

 Nồng độ cồn thu được trong lên men từ các giống thuần chủng thường cao hơn lên men tự nhiên từ 0,11o

 Vang sáng màu nhanh hơn và có thể cho hương vị thanh khiết hơn

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men

2.2.4.1 Ảnh hưởng của oxy

Các nấm men dùng trong sản xuất rượu vang thuộc giống Saccharomyces chúng là

nhóm những vi sinh vậy kỵ khí tùy tiện Trong điều kiện môi trường đủ oxy, nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng phát triển tế bào và tăng sinh khối Ngược lại trong điều kiện môi trường thiếu oxy hoặc không có mặt oxy (kỵ khí) thì chúng sẽ sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng nhưng chủ yếu là sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí và sản phẩm tạo thành sẽ là ethanol và CO2

Vì vậy trong giai đoạn đầu của quá trình lên men lượng oxy được yêu cầu rất cao để cho nấm men phát triển sinh khối tăng mật số lên đủ lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men yếm khí ở giai đoạn sau Do đó giai đoạn nhân giống (làm nước cái men) để cấy vào dịch quả phải cung cấp đủ oxy bằng cách lắc đều hoặc sục khí

Oxy rất cần thiết cho quá trình lên men, nhưng việc tăng oxy chỉ có ích ở giai đoạn đầu của quá trình lên men Khi nấm men đã hoạt động yếu, lượng cồn ethylic sinh

ra đã nhiều, một số chất vi lượng đã sử dụng hết thì dù có cung cấp thêm oxy nấm men cũng không thể tái sinh sản mạnh và quá trình lên men cũng không thể nhanh hơn được

2.2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ lên men ảnh hưởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm Nấm men khá bền ở nhiệt độ thấp nhưng rất nhạy cảm với nhiệt độ cao Trong môi trường lỏng nhiệt độ 4050oC nấm men ngừng họat động

và sẽ bị chết ở nhiệt độ 6065oC trong 5 phút Trong môi trường khô khả năng chịu nhiệt của chúng tốt hơn

Khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 1525oC, ở nhiệt độ thấp hơn hoạt động của nấm men chậm hơn và yếu hơn, lượng đường còn lại sau lên men nhiều Nhiệt độ lên men cao thì thời gian lên men ngắn độ cồn sinh ra thấp, hương

vị sản phẩm không tốt do có quá nhiều sản phẩm bậc hai sinh ra Khi nhiệt độ trên

36oC thì nấm men bắt đầu bị ức chế và đến 40oC thì nấm men ngừng hoạt động Do

đó cần kiểm soát nhiệt độ trong suốt quá trình lên men không để vượt quá 36oC

(Bùi Ái, 2003)

2.2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đồng đều và ít cho quá trình lên men, do đó người ta thường bổ sung thêm đường saccharose vào dịch quả trước khi tiến hành lên men Đường cung cấp năng lượng và carbon cho nấm men hoạt động Đường saccharose là thích hợp nhất vì tất cả các loại nấm men đều đồng hóa được Mật số đường cao thì độ cồn trong rượu vang càng cao do đó bổ sung đường vào dịch quả lên men trong sản xuất rượu vang là biện pháp phổ biến nhất Nhưng cần chú ý lượng đường bổ sung phải nằm trong giới hạn cho phép thích hợp cho sự hoạt động của nấm men:

+ Dịch lên men có hàm lượng đường từ 1025% thì quá trình lên men vẫn diễn

vùng pH tối thích cho nấm men hoạt động nhưng nó vẫn có thể hoạt động tốt còn vi khuẩn trong khoảng pH này đã bị ức chế Do đó trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả từ 34,2 ở khoảng pH này vừa ức chế được

vi khuẩn có hại vừa không cản trở hoạt động của nấm men Hoặc nếu vì nhiều điều kiện khác không thuận lợi như thiếu oxy hoặc nhiệt độ quá cao làm nấm men ngừng hoạt động thì rượu cũng không bị vi khuẩn gây hại (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.2.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ rượu sinh ra

Quá trình nuôi cấy nấm men chủ yếu là tạo điều kiện thích hợp cho nấm men phát triển sinh khối, đạt số lượng theo yêu cầu Song nấm men cũng thực hiện một quá trình lên men rượu đáng kể Thường trong dịch nấm men có 46% rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng xấu đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men Điều này còn phụ thuộc vào thời gian, môi trường nuôi cấy, số lượng tế bào nấm men và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy

2.2.4.6 Ảnh hưởng của Nitơ

Đa số nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men nhưng cũng tùy thuộc vào loại quả và thời gian thu hoạch là đầu vụ hay cuối vụ mà trong nước quả

có thể cung cấp không đủ nguồn nitơ cho nấm men sinh trưởng Do đó cần bổ sung thêm nguồn nitơ cho nước quả Trong trường hợp này người ta thường bổ sung amon sulfat (NH4)2SO4, cũng có thể dùng dịch lên men tự phân cho thêm vào môi trường Nếu dịch lên men quá chua có thể thêm tartrat amon kali hay amon hydroxit trung hòa bớt acid (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.2.5 Các vi khuẩn có hại cho nấm men

Ngoài nấm men trong nước quả còn có nhiều loại vi khuẩn Với nấm men chúng sẽ tạo sự chuyển hóa có ích cho nước quả và quá trình làm rượu, còn vi khuẩn thường tác động đến các thành phần của nước quả hoặc của rượu sinh ra và chuyển thành các chất có hại cho rượu vang Chẳng hạn vi khuẩn lactic phân hủy acid malic, acid tartric, đường và glycerin làm cho rượu có vị chua, vị đắng, mùi hôi… Hay vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic và biến rượu thành giấm Tuy nhiên vi khuẩn lactic cũng có điểm có lợi đó là chúng lên men malolactic để làm giảm độ chua của rượu giúp rượu dịu bớt đi

Dịch lên men không chỉ là một môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men mà còn thuận lợi cho các vi sinh vật khác Trong nước, trong không khí cũng như trong các nguyên liệu tham gia vào thành phần môi trường luôn chứa một lượng vi sinh vật có hại cho lên men rượu (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000) Trong điều kiện lên men thường gặp nhất các loại vi sinh vật sau đây:

2.2.5.1 Vi khuẩn lactic

Đây là loài vi khuẩn yếm khí, chúng gồm hay loại: lactic điển hình và lactic không

điển hình Lactic điển hình sẽ chuyển hóa đường thành sản phẩm duy nhất là acid

lactic

C6H12O6 2CH3CH(OH) +18 kcal

Vi khuẩn lactic không điển hình sẽ sử dụng đường để chuyển thành acid lactic một

lượng đáng kể các chất khác như: alcol, acid acetic, carbonic, diacetyl và ceton Các

sản phẩm phụ được tạo ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, độ pH, mức độ yếm

khí… nên sản phẩm tạo thành không ổn định

Lactic điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 4951oC còn lactic không điển

hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 3738oC

2.2.5.2 Vi khuẩn acetic

Đây là loại vi khuẩn háo khí không tạo thành bào tử, có nhiệt độ tối ưu trong

khoảng 2035oC, tối đa 42oC chúng phát triển tốt trong môi trường có alcol thấp,

oxy hóa alcol thành acid acetic

C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 116 kcal

Trong môi trường không có alcol, vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa đường thành acid

gluconic Ngoài ra chúng còn oxy hóa các alcol khác, ví dụ vi khuẩn lactic có thể

oxy hóa rượu butylic thành acid butyric

CH3-CH2-CH2-CH2OH CH3-CH2-CH2-COOH

Hay chuyển acol propylic thành acid propylic

CH3-CH2-CH2OH CH3-CH2-CH2OH

Vi khuẩn acetic thường hoạt động trên bề mặt dịch lên men để lâu ngày, trong điều

kiện lên men rượu chúng ít có điều kiện phát triển vì vi khuẩn này rất hiếu khí

2.2.5.3 Vi khuẩn butylic và các loại vi sinh vật khác

Nếu lấy dịch quả chưa lên men đem cấy trên các hộp đĩa petri, trong môi trường

thích hợp sẽ phát triển nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo bào tử Chúng gồm vi

khuẩn butylic, aceton butylic, subtilis… Nhưng trong điều kiện lên men rượu tất cả

các loại vi khuẩn này đều không phát triển do pH tối thích của chúng đều nằm trong

môi trường trung tính hoặc kiềm yếu Vì vậy nhiễm khuẩn chủ yếu trong lên men

rượu là vi khuẩn lactic

Nhìn chung, các loại vi khuẩn thường là có hại cho quá trình lên men rượu do đó

khi lên men rượu vang (nhất là lên men không xác quả) không có nhiều chất tanin

thì người ta thường tìm cách tiêu diệt vi khuẩn đi Những biện pháp có thể là: điều chỉnh pH thấp, sử dụng SO2 thanh trùng… nhằm mục đích tránh gây hư hỏng cho rượu vang trong giai đoạn sau này

2.3 Tóm tắt quá trình phân lập nấm men

2.3.1 Thu hoạch nước thốt nốt

Nước thốt nốt thu hoạch vào buổi sáng và buổi chiều với 3 điều kiện xử lý (không

xử lý, xử lý gỗ sến, xử lý metabisulfite sodium) ở huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Sau khi thu hoạch, mẫu nước thốt nốt được tiến hành kiểm tra đánh giá chất lượng tại ruộng, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập Điều kiện tồn trữ mẫu trong quá trình vận chuyển là 05oC, đảm bảo nguyên liệu khi về đến phòng thí nghiệm không bị biến đổi chất lượng

2.3.2 Quá trình phân lập nấm men từ nước thốt nốt

Trước khi thực hiện phân lập nấm men tự nhiên từ nước thốt nốt, nguyên liệu sẽ được kiểm tra lại lần nữa, thông qua các giá trị đo được như pH, hàm lượng chất khô hòa tan trong nguyên liệu ta có thể xác định được sự biến đổi chất lượng của nước thốt nốt trong quá trình vận chuyển

Nguyên liệu có chất lượng tốt được tiến hành phân lập để tuyển chọn những dòng nấm men tự nhiên có trong nguyên liệu này Tại đây, các công đoạn ban đầu như chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men, dụng cụ phải được thanh trùng và chuẩn bị

kỹ càng, đảm bảo cho quá trình nuôi cấy và tuyển chọn các dòng nấm men được thực hiện trong điều kiện thích hợp tối ưu nhất

Sau 3 ngày nuôi cấy mẫu ở nhiệt độ 30oC có thể quan sát hình dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa, lấy những khuẩn lạc khác nhau làm tiêu bản giọt ép trên lam kính để quan sát tế bào nấm men và ghi nhận hình dạng bằng kính hiển vi Thông thường mẫu nước thốt nốt mới phân lập có các khuẩn lạc khác nhau trên môi trường thạch đĩa và nhiều hình dạng tế bào nấm men Do đó, phải tiếp tục cấy chuyền những khuẩn lạc khác nhau trên đĩa môi trường, cho đến khi tạo được các khuẩn lạc giống nhau trên cùng 1 đĩa (tạo được giống nấm men đồng nhất)

Sau thời gian phân lập thu được 21 dòng nấm men từ nước thốt nốt, cấy chuyền 21 dòng này vào 2 môi trường tổng hợp Sabouraud và MEA, theo dõi khả năng phát triển của khuẩn lạc bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa khi nuôi cấy cùng một lượng mẫu ban đầu (số lượng khuẩn lạc dao động 30÷300/đĩa), và số lượng nấm men/ml mẫu bằng buồng đếm thoma khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể

Kết quả 21 dòng nấm men phát triển tốt trong môi trường Sabouraud, với số lượng khuẩn lạc và số lượng nấm men phát triển vượt trội Sử dụng môi trường Sabouraud

để phân lập và bảo quản các giống nấm men trong môi trường ống thạch nghiêng, nhiệt độ bảo quản 410oC, định kỳ cấy chuyền 2 tháng/lần

Dựa vào khóa phân loại các giống nấm men, chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái nấm men, quan sát tế bào nẩy chồi khi nuôi cấy trong môi trường lỏng cao mạch nha – cao nấm men – glucose – pepton, quan sát sự hình thành bào tử nấm men khi nuôi cấy trên môi trường nghèo dinh dưỡng thạch – agar, các đặc điểm sinh

lý như khả năng lên men đường và khả năng đồng hóa urea Bước đầu xác định 21

dòng nấm men phân lập thuộc 3 giống nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora và

Candida (Bùi Thị Thúy Ngân, 2010)

2.4 Sơ lược về quá trình lên men rượu

Lên men là quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí (kỵ khí) và lên men hiếu khí

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2

2.4.1 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt lớn hơn một trăm triệu tế bào trong một

ml dịch lên men Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng mạnh Đường và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó được khuếch tán vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất mạnh vào trong môi trường CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn Ở áp suất 800 mmHg, nhiệt độ 2530oC thu được khoảng 0,8370,856 lít CO2/lít nước

Vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa Khi bão hòa CO2 bám xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi trên bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 phóng thích ra ngoài Lúc này do khối lượng của tế bào nấm men

đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Quá trình diễn ra liên tục nên tế bào nấm

men chuyển từ trạng thái tĩnh sang trạng thái chuyển động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa các tế bào nấm men và môi trường điều này càng làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm gia tăng quá trình lên men

Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men Kích thước vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men khi lên men đều ảnh hưởng đến quá trình thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.4.2 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu

CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH

* Acid lactic được tạo bởi pyruvate dehydronase theo phản ứng:

CH3CO COOH + NADH2 = CH3CHOHCOOH + NAD

* Acid citric theo Lapphon được tạo từ aldehyde acetic phản ứng này được biểu diễn tổng quát như sau:

9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6C2H5OH

* Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một aldehyde acetic:

2CH 3 -COOH + CH 3 CHO COOHCH 2 COOH + C 2 H 5 OH

2.4.2.2 Sự tạo thành alcol cao phân tử

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai (gọi chung là alcol cao phân tử) Các alcol này tuy ít nhưng lẫn vào cồn ethylic sẽ gây ảnh hưởng xấu tới chất lượng sản phẩm Đó là các alcol propylic, izoamylic, amylic,… hàm lượng của chúng chỉ vào khoảng 0,40,5% so với cồn ethylic nhưng gây cho sản phẩm mùi hôi khó chịu Các alcol này có tên chung là dầu fusel và có mùi hôi khó chịu nên gọi là dầu khét

2.4.2.3 Sự tạo thành ester

Song song với quá trình tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzym esterase của

nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng

Có thể viết dưới dạng tổng quát sau:

R1CH2OH + R2COOH R2COO-CH2R1 + H2O

Khi alcol ethylic kết hợp với acid acetic là sẽ nhận được ester ethylic hay acetate ethyl:

C2H5OH + CH3COOH CH2COOC2H5 + H2O

Sự tạo thành ester sẽ dễ dàng hơn khi các cấu tử tham gia phản ứng là các aldehyde:

R1CHO + R2CHO R1COOCH2R2

Khi đó tất cả biến đổi của aldehyde sẽ được thực hiện mà không cần tiêu tốn năng lượng

Các aldehyde cũng có thể ngưng tụ với nhau để tạo ra chất mới, vừa chứa nhóm CHO vừa chứa nhóm -OH

-CH3CHO + CH3CHO = CH3CHOHCH2CHO

Khi tác dụng với alcol ethylic, aldehyde acetic sẽ biến thành dietylacetate:

CH3CHO + 2C2H5OH CH3CH (OC2H5)2 + H2O

Dựa vào các kết quả thu được trong phòng thí nghiệm cũng như trên thực tế sản xuất, người ta nhận thấy rằng, lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong các quá trình lên men phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu (Nguyễn Đình Thưởng, 2000)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

Thực hiện nghiên cứu, thu thập số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.1 Nguyên vật liệu

Nước thốt nốt (hình 3.1): thu được trực tiếp trên cây (bông cho trái) tại Tịnh Biên thuộc tỉnh An Giang vào buổi sáng (được quy ước buổi chiều đặt ống sáng hôm sau lấy mẫu)

Hình 3.1 Nguyên liệu nước thốt nốt

- Nấm men phân lập: Có hoạt lực lên men cao, sử dụng đường lên men gần như hoàn toàn, khả năng kết lắng tốt và chịu được cồn cao

- Đường saccharose sử dụng là đường tinh luyện

+ Dung dịch Fehling A: CuSO4 tinh thể (69,28 g) + nước cất (vừa đủ 1 lít)

+ Dung dịch Fehling B: Kalinatritactrate (34,6 g) + NaOH (100 g) + Nước cất (vừa đủ 1 lít)

+ Dung dịch Iot 0,1N, 0,01N

+ Hồ tinh bột 1%

Những hóa chất này pha theo yêu cầu sử dụng cho các phân tích và được sản xuất bởi Guangdong Guanghua Chemical Factory Co Ltd (Trung Quốc)

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị

Các thiết bị sử dụng cho quá trình nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.2

Hình 3.2 Thiết bị sử dụng cho quá trình nghiên cứu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên quy trình chế biến rượu vang thốt nốt tổng quát (hình 3.3)

Hình 3.3 Quy trình chế biến rượu vang thốt nốt tổng quát

3.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng của mật số nấm men từ nguồn phân lập và pH đến quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt

3.2.2.1 Mục đích

Thí nghiệm tiến hành ở các mật số nấm men, chế độ pH và cố định nồng độ đường tối ưu, qua đó sẽ chọn ra mẫu thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm men cũng như độ cồn sinh ra kèm theo mùi vị của sản phẩm tốt

3.2.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu

Nước thốt nốt sau khi thu hoạch được kiểm tra chất lượng sơ bộ (đo oBrix, pH) và chuẩn hóa bằng cách đưa về oBrix = 24; pH = 3,5: 4,0 : 4,5 tỷ lệ NaHSO3 sử dụng

Chiết chai

Phân lập nấm men

(Nguồn: Bùi Thị Thúy Ngân, 2010)

để thanh trùng nước thốt nốt trước khi lên men là 140 mg/lít, thời gian thanh trùng 2 giờ và lên men ở nhiệt độ phòng

Phương pháp tính và chuyển oBrix về giá trị 24 có thể được thực hiện theo công thức:

24/100 = (a + x)/(100 + x) Trong đó: a là độ oBrix của dịch quả sau khi lọc và pha loãng

x là hàm lượng đường cần thiết bổ sung

Phương pháp điều chỉnh pH: đo pH nước thốt nốt sau khi thu nhận Sau đó điều chỉnh pH của nước thốt nốt bằng cách giảm 0,1 mức pH thì sử dụng 1,8 g acid citric cho 1 lít nước thốt nốt được chuẩn bị sẵn

Nấm men: được tính toán hàm lượng theo bố trí thí nghiệm và được hoạt hóa trước khi sử dụng

Bình lên men: các bình thủy tinh có dung tích 5 lít được rửa sạch và xử lý cồn để chuẩn bị sẵn sàng cho quá trình lên men

3.2.2.3 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố (mật số nấm men, chế

độ pH và cố định oBrix =24) Sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở (hình 3.4)

- Nhân tố A: Mật số nấm men CFU/ml

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí khảo sát yếu tố ảnh hưởng của mật số nấm men từ nguồn phân lập và

pH đến quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt

3.2.2.4 Phương pháp thực hiện

Các mẫu lên men được chuẩn bị (khoảng 3 lít cho mỗi mẻ) và bố trí lên men trong bình thủy tinh 5 lít được đậy kín

Bố trí 6 bình lên men cho một nghiệm thức với tất cả các điều kiện đã được chuẩn

bị sẵn với điều kiện thích hợp và thực hiện quá trình lên men trong bình kín (yếm khí)

Kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng sau 12 ngày lên men

Các chỉ tiêu được phân tích bắt đầu từ ngày 13 của quá trình lên men và phân tích cách 3 ngày/lần (ngày thứ 13 và ngày thứ 16)

Phân lập

nấm men

3.2.2.5 Các chỉ tiêu phân tích

Lượng đường còn lại trong quá trình lên men, hàm lượng rượu ethanol (% v/v), pH, o

Brix (xem phương pháp phân tích ở phần phụ lục)

Các chỉ tiêu hóa học: Hàm lượng acid (g/l), aldehyde (g/l), SO2 (g/l), methanol (g/l), ester (g/l) (xem phương pháp phân tích ở phần phụ lục)

3.2.2.6 Ghi nhận kết quả

Hàm lượng rượu sinh ra (% v/v)

Hàm lượng đường còn lại (g/l)

Hàm lượng acid tổng số (g/l)

Hàm lượng ester (g/l)

Hàm lượng SO2 (g/l)

Hàm lượng methanol (% v/v)

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của mật số nấm men phân lập và pH đến hàm lượng ethanol

sinh ra

Kết quả phân tích (bảng 4.1 và hình 4.1) cho thấy mật số nấm men phân lập và pH của dịch lên men có ảnh hưởng đến chất lượng của rượu vang thốt nốt Với mẫu rượu lên men từ nước thốt nốt có mật số nấm men phân lập sử dụng là 103 CFU/ml thì hàm lượng ethanol là cao nhất [trung bình 13% (v/v)] và khác biệt với các mẫu rượu có mật số nấm men phân lập khác (mức độ ý nghĩa 5%) Ở pH = 4,0 rượu sau khi lên men có hàm lượng ethanol tối ưu (103 CFU/ml, pH = 4,0) cao hơn các mẫu rượu lên men ở pH = 3,5 và pH = 4,5 Kết quả phân tích cũng cho thấy có sự tương tác giữa mật số nấm men phân lập sử dụng và pH (P=0,028<0,05) Mẫu rượu lên men sử dụng mật số nấm men phân lập 103 CFU/ml và pH = 4,0 của dịch lên men

có khác biệt so với các mẫu rượu vang có mật số nấm men và pH khác Sau 12 ngày kết thúc quá trình lên men của các mẫu rượu thì hàm lượng ethanol cao nhất là 13,13 %(v/v) (mẫu rượu lên men từ nước thốt nốt có mật số nấm men sử dụng là

103CFU/ml và pH = 4,0 của dịch lên men) Trong thời gian đầu của quá trình lên men, chất dinh dưỡng, hàm lượng đường còn nhiều, hàm lượng rượu sinh ra còn thấp nên nấm men còn phát triển tốt, ít chịu sự ức chế của môi trường sống Khi lượng rượu đã sinh ra nhiều và chất dinh dưỡng trong môi trường sống trở nên khan hiếm thì men bắt đầu chết dần và tốc độ lên men nhanh chóng giảm xuống và dừng hẳn ở các ngày cuối của quá trình lên men

Bảng 4.1 Hàm lượng ethanol %(v/v) của sản phẩm ở các mật số nấm men phân lập

và pH của dịch lên men

Ghi chú: Các trung bình nghiệm thức đi kèm với các chữ giống nhau thể hiện sự khác biệt không ý

nghĩa trên cùng một cột hoặc một hàng với mức ý nghĩa 5%