ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG THUỐC KHÁNG SINH

Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử..  Đặc điểm sính lý

MỤC LỤC

I Khái quát chung về xạ khuẩn 3

1 Khái niệm xạ khuẩn 3

2 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

3 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 3

4 Cấu tạo của xạ khuẩn 4

5 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại 4

6 Một số ứng dụng của xạ khuẩn 6

II Ứng dụng của xạ khuẩn trong thuốc kháng sinh 7

1 Lịch sử hình thành chất kháng sinh 7

2 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 8

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 8

4 Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 10

III Một số nghiên cứu liên quan đến xạ khuẩn 14

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật

Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái

Chính vì vậy, với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh

ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG THUỐC

KHÁNG SINH

I Khái quát chung về xạ khuẩn

1 Khái niệm xạ khuẩn.

Xạ khuẩn (danh pháp khoa học: Actinobacteria; tiếng Anh: Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Trước

kia được xếp vào Tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi

khuẩn (Schizomycetes)

2 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố

rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV

Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng

có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn

có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm

3 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.

 Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử)

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung

tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh

Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

 Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt

thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm

vụ dinh dưỡng

4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng, lớp giữa rắn chắc, lớp trong dày

Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính:

 Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

 Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6 -diaminopimelic (m - ADP) và glyxin

 Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6 -diaminopimelic

 Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6 -diaminopimelic, arabinose và galactose

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập

5 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại

 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử

Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ

liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân

tử DNA Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử

 Đặc điểm hóa phân loại

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit

và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG

- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter Đây là đặc điểm phân loại cơ bản cho các chi đó

- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit

tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi

- Photpholipit có 5 typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào

 Đặc điểm sính lý – sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh

lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi

 Phân loại số

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số

Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ

số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng

- Công thức của Sokal và Michener (SSM )

- Công thức của Jacard (SJ)

Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ cây") của các thông số Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định

 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt tên năm 1943 Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP

đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 300C,

pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh)

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi

khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau

6 Một số ứng dụng của xạ khuẩn

Đặc tính của xạ khuẩn là khả năng tiết kháng sinh (antibiotic), dùng làm

thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và cây trồng Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid amin và các acid hữu cơ Xạ khuẩn

còn có khả năng tiết ra các enzym (proteas, amylaz ) và trong tương lai có thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm và vi khuẩn vì nấm có thể sinh ra aflatonxin độc cho người và gia súc

II Ứng dụng của xạ khuẩn trong thuốc kháng sinh

1 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh.

Theo định nghĩa của Outchinnikov Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp

Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928

Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành

"một loại thuốc thần kỳ" Năm 1945, A.Fleming, E Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một

kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh

Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene' Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm

1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952 Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới

Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn

Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312 Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết

từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP - A0356 bằng phương pháp sắc kí cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida albicans Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng

methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin.

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có

HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn

Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN, kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS

2 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn

Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và

từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường

tự nhiên Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu

kỳ sinh trưởng

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

•CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym

•CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau

•CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 300C, nhưng nhiệt

độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 280C

 pH môi trường

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS

 Độ thông khí

Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy) Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả năng hòa tan oxy Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/ 100ml môi trường lên men

 Tuổi giống

Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10%

 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng

 Nguồn cacbon

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza, mannoza, fructoza có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức

ăn cacbon trong lên men sinh CKS

 Nguồn nito

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ

và vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS[27] Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

 Nguồn photphat vô cơ

Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo

dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS

 Các yếu tố vi lượng

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng

đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

 Hình thức lên men

Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy và CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng Quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí

4 Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn

Streptomyces orientalis.

Vancomycin là chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi và có tác dụng tích cực trong chữa bệnh Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam) đang nghiên cứu điều kiện thích hợp sản xuất

vancomycin từ biến chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis nhận được từ xử lý

N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) lên tế bào trần của chủng gốc Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhóm β-lactam) gây nên Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuốc, do Bộ Y tế đề ra

Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phù hợp với điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết Cùng với nó, việc triển khai xây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

a Chủng giống vi sinh vật.

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm

định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus

209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2 (Bộ sưu tập giống của Phòng Công

nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học); các hóa chất dung để phân tích, định