Sinh hóa miễn dịch chương 7

- Bước 2: Bổ sung bố thể vào hệ thống xét nghiệm hình 7.5 a Kháng nguyên không ñặc hiệu với kháng thể có bố thể tự do bKháng nguyên ñặc hiệu với kháng thể không có bố thể tự do bố thể cố

CHƯƠNG 7 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

DỰA TRÊN MIỄN DỊCH

Trong những năm gần đây, cĩ nhiều xét nghiệm đặc hiệu và rất nhạy dựa trên kỹ thuật hố - miễn dịch đã được đưa vào trong xét nghiệm y khoa với mục đích chẩn đốn để cĩ hướng điều trị thích hợp, triển khai vacxin để phịng bệnh kịp thời, triển khai các biện pháp vệ sinh - dịch tế học để ngăn ngừa lây lan của mần bệnh Nguyên lý của chúng được dựa trên các phản ứng kháng nguyên - kháng thể Áp dụng nguyên lý này để xác định độc tố trong thực phẩm đã được thực hiện trong khoảng 20 năm trở lại đây Hai nguyên nhân thúc đẩy áp dụng rơng rãi phương pháp này là việc sản xuất được kháng thể đơn dịng và việc phát triển của phương pháp ELISA Việc phát triển được phương pháp ELISA đã gĩp phần quan trọng đưa phương pháp phân tích dựa trên miễn dịch học vào ứng dụng rộng rãi

7.1 Phản ứng kháng nguyên và kháng thể

Kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu của nĩ cĩ chứa cấu trúc tương ứng bổ sung, chính vì thế nĩ làm cho phần quyết định kháng nguyên khớp rất khít với vị trí gắn trên kháng thể Tại đĩ chứng được nối với nhau bằng những liên kết yếu giữa các phân tử

7.1.1 Phản ứng thuận nghịch và hằng số cân bằng

Một vị trí của kháng thể chỉ kết hợp với môt epitop kháng nguyên, phản ứng kháng nguyên kháng thể là phản ứng thuật nghịch và có thể biểu diễn như sau:

k

k KT

KN

KT KN

Nhận biết phản ứng KN-KT thông qua các phản ứng sau ñây

Phản ứng tối ưu khi ñủ và tương ñồng về nồng ñộ kháng nguyên , kháng thể (hinh 7.2)

6.2.3 6.66.3 Phản ứng ngưng kết

PP +P6'

'

KhikKk

Khi tỷ lệ tương ñồng sẽ tạo màng lưới tốt nhất, nếu thừa kháng thế

epitop kháng nguyên bão hoà nhưng không liên kết chéo ñược ñược với

Hình 7.2: ðồ thị biểu diễn mức kết tủa phụ thuộc vào tỷ lệ KT-KN

nhau thông qua gắn vị trí kết hợp kháng nguyên Nếu thừa kháng nguyên paratop kháng thể bão hoà, nhưng không kết hợp ñược với nhau thông qua epitop

- Pha loãng kháng thể có ñộ pha loãng : 1/20; 1/40; 1/80

- Cho kháng nguyên hữu hình vào các ống nghiệm chứa kháng thể trên

- Hiệu giá kháng thể là ñộ pha loãng cao nhất mà vẫn xảy ra ngưng kết Ví

dụ trong ống thứ 3 có ñộ pha loãng cao nhất nhưng vẫn phát hiện ñược phản ứng ngưng kết ta nói hiệu giá của hyết thanh là 80

7.1.4 Phản ứng kết hợp bố thể

Về nguyên tắc kháng nguyên hoà tan có phản ứng với kháng thể do ñó

sẽ cố ñịnh bố thể Còn ngược lại sẽ có bố thể tự do Khi hệ thống chỉ thị của các hồng càu nhậy cảm như hồng cầu cừu (SRBC) ñược thêm vào, mức ñộ phân huỷ hồng cầu nhậy cảm (tan hồng cầu nhậy cảm) sẽ tỷ lệ với bố thể tự do Dưạ vào kết quả xét nghiệm ta kết luận là mẫu âm tính hoăc dương tính

Bước 1:Chuẩn bị hai hệ thống (hinh 7.3):

- Hệ thống xét nghiệm bao gồm: Kháng nguyên, kháng thể

- Hệ thống chỉ thị gồm: Hông cầu cừu và kháng thể kháng hồng cầu cừu

- Bố thể

-

Bước 2: Bổ sung bố thể vào hệ thống xét nghiệm (hình 7.5)

a) Kháng nguyên không ñặc hiệu với kháng thể có bố thể tự do

b)Kháng nguyên ñặc hiệu với kháng thể không có bố thể tự do (bố thể cố ñịnh)

Kh¸ng nguyªn

Kh¸ng nguyªn

Kh¸ng

thÓ

Kh¸ng nguyªn

Hình 7.4: Hệ thống xét nghiệm và hệ thống chỉ thi

Hình 7.5: Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có bổ sung bố thể

Bước 3: Bổ sung hệ thống chỉ thi

a) Bố thể tự do có phản ứng với chỉ thị (tạo phức kháng thể hồng cầu cừu- kháng nguyên kháng hồng cầu cừu- bố thể) (hình 7.6a)

b) Bố thể cố ñịnh không có phản ứng với chỉ thị (do tạo phức hệ KT-BT) ( 7.6 b)

Bước 4: Kết quả xét nghiệm

a) Ân tính: do không có kháng thể cần xét nghiệm, nên không có phức KT-BT Do ñó bố thể tự do kết hợp với hồng cầu nhạy cảm và xảy ra hiện

KN-tượng tan máu (hình 7.7a)

b) Dương tính: Có kháng thể cần xét nghiệm, nên tồn tại phức KN-KT-BT

Do ñó bố thể cố ñịnh sẽ không có sự kết hợp với hồng cầu nhạy cảm, kết quả

là không có hiện tượng tan máu (hình 7.7b)

Ứng dụng của phương pháp:

Phương pháp này ñược ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc lâm sàng ðặc biệt là trong phép thử ñối với xoán khuẩn trong bênh giang mai

7.1.5 Các yếu tố ảnh hưởn ñến phản ứng kháng nguyên kháng thể

- Ảnh hưởng của kích thước, nồng ñộ của kháng thể

- Ảnh hưởng của lực ñẩy giữa các kháng nguyên

- Tác dụng của enzyme

- Tác dụng của các chất keo

- Ảnh hưởng ñặc tính kháng nguyên

- Ảnh hưởng của pH, nhiệt ñộ, thời gian phản ứng

7.2 Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch

7.2.1 Cơ sở của phương pháp

Trong kỹ thuật này kháng thể hoặc kháng nguyên ñược ñánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Về nguyên tắc: kỹ thuật ñược dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi ñược kích thích bởi bức xạ có bước sóng thích hợp sẽ phát sáng:

- Fluorescein phát quang màu vàng lục

- Rodamin phát quang cho màu ñỏ da cam

a b

Hình 7.7: Kết quả xét nghiệm

Kháng thể có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là gọi là kháng thể huỳnh quang hay kháng thể ñánh dấu

7.2.2 Hai phương pháp kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch

Phương pháp huỳnh quang MD trực tiếp (hình 7.8)

Mục ñích của phương pháp: Xác ñịnh vi sinh vật gây bệnh trên bênh phẩm,

Ví dụ như xác ñịnh Streptococcus pyrogenes từ họng bệnh nhân

Các bước tiến hành

- Cố ñịnh tiêu bản trên phiến kính

- Phủ kháng thể huỳnh quang kháng thể lên

- Cho kháng thể huỳnh quang gắn với tế bào

- Rửa loại kháng thể không gắn với tế bào

- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, chỉ có vi khuẩn gắn ñặc hiệu với kháng thể huỳnh quang mới phát sáng và quan sát ñược

Phương pháp huỳnh quang MD gián tiếp

Mục ñích

Phương pháp này thường dùng xác ñịnh kháng thể trong thể dịch của bệnh nhân Ví dụ xác ñịnh IgG kháng spirochet có trong huyết thanh hoặc nước bọt bệnh nhân viêm lợi Phương pháp này nhạy hơn phương pháp trực tiếp Các bước tiến hành

- Cố ñịnh tiêu bản (kháng nguyên) trên phiến kính

- Cho kháng thể huyết thanh bệnh nhân phản ứng với kháng nguyên (vi khuẩn gây bệnh)

- Cho kháng thể có ñánh dấu huỳnh quang ñể kháng thể phản ứng ñặc hiệu với phức hợp kháng nguyên-kháng thể

- Rửa những phần không phản ứng ñặc hiệu giữa kháng thể huỳnh quang với phức hợp kháng nguyên- kháng thể

- Soi ñọc kết quả bằng ñèn huỳnh quang (ñèn UV)

Mô phỏng phương pháp huỳnh quang gián tiếp

Bước 1:Cố ñịnh tiêu bản trên phiến kính

Bước 2: Tráng kính vơí kháng thể ñặc hiệu ñể tạo phức hợp KN-KT

Hình 6.8 Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch trực tiếp

Bước 3:Tráng kháng thể ñặc hiệu với kháng thể có gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang

Bước 4:Soi ñọc kết quả bằng ñèn hyùnh quang (ñèn UV)

7.3 Thí nghiệm miễn dịch phóng xạ

Nguyên tắc:

Về nguyên tắc tương tự như huỳnh quang miễn dịch, nhưng khác là kháng nguyên hoặc kháng thể ñựơc ñánh dấu bằng chất phóng xạ (126I ) Thí nghiệm này do Rosalyn Yalow ñề nghị năm 1960 ñể xác ñịnh nồng ñộ insulin trong huyết tương Nhờ phát minh này mà bà ñã nhận giải thưởng Noben năm

1977 Ngày nay phương pháp này ñược sử dung ñể xác ñịnh hoocmon, globulin miễn dịch, kháng nguyên của virus

- Rửa sạch kháng ngyuyên ñánh dấu không bắt cặp với kháng thể

- ðo ñộ phóng xạ của phức chất kháng nguyên ñánh dấu - kháng thể (A)

- Cũng thí nghiệm như trên nhưng ở ñây ta thêm một lượng kháng nguyên huyết thanh có những ñặc tính tương tự như kháng nguyên ñánh dấu Do cạnh tranh mà kháng nguyên này kết hợp ñặc hiệu với kháng thể, sau ñó lượng kháng thể dư mới kết hợp với kháng nguyên ñánh dấu

- Rửa những kháng nguyên ñánh dấu không bắt cặp với kháng thể

- ðo ñộ phóng xạ của phức kháng nguyên ñánh dấu với kháng thể còn lại (B)

- Từ giá trị A&B ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên huyết thanh cần nghiên cứu

7.4 Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA Enzyme Linker Immunosorbent Assay)

-Những xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme là kỹ thuật khá nhạy và ñơn giản, cho phép xác ñịnh kháng nguyên hoặc kháng thểầm có nồng ñộ rất thấp (khoảng 0,1 mg/ml) So với phương pháp miễn dịch phóng xạ thì phương pháp này ñơn giản rẻ tiền an toàn mà vẫn ñảm bảo ñộ chính xác Các xét nghiệm ñược tiến hành trên bản nhựa polystyren có 96 giếng ñáy bằng, thể tích mỗi giếng khoảng 200 µl

Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA:

Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là tạo liên kết ñặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

Sự liên kết ñó cho phép xác ñịnh sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên Người ta sử dụng kháng thể gắn cộng hợp enzym sau ñó bổ sung cơ chất, enzym thủy phân cơ chất tạo thành chất làm thay ñổi màu dung dịch Tùy thuộc vào cường ñộ màu dung dịch ta suy ra nồng ñộ kháng nguyên hoặc kháng thể cần nghiêm cứu

Các enzyme thường dùng là: (galactosidase; glucoxydase; akanline phosphotasen, )

Ngoài ra ñể tăng ñộ nhạy của phương pháp người ta sử dụng hệ thống công hợp biotin -avidin, biotin -sprept

Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - avadin

Biotin ( vitaminH) ñược tổng hợp từ sinh vật hoặc thực vật có trọng lượng phân tử khoảng 244Da Biotin có ái lực với avidin (là chất có nhiều trong lòng trắng trứng) Avidin có 4 vị trí trên phân tử liên kết với biotin, và như thế biotin dễ dàng kết hợp với protein: kháng thể, enzyme và các loại kháng nguyên khác Phương pháp này nó sẽ nâng cao ñộ nhạy của xét nghiệm ñặc biệt là các xét nghiệm miễn dịch mà kháng nguyên ở trong pha rắn

Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept

Người ta cũng tìm thấy chất hoạt tính tương tự như avidin từ xạ khuẩn và như vậy ta có hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept trong xét nghiệm

miễn dịch Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept (avidin) dùng trong xét nghiệm miễn dịch ñặc biệt vai trò của avidin và strept avidin có thể thay ñổi cho nhau Ngày nay bộ kít này ñã ñược chế tạo từ các hãng nổi tiếng trên thế giới

Các kháng nguyên hoặc kháng thể cần xác ñịnh ñược hấp phụ trực tiếp hoặc gián tiếp lên bề mặt của giếng nhựa Sau ñó mặt phẳng của giếng ñược bao phủ bằng một loại ñệm chứa protein, thường là gelatin hoặc BSA ñể ngăn ngừa sự liên kết không ñặc hiệu ñối với bản nhựa

Có nhiều kỹ thuật ELISA , dưói ñây sẽ trình bày kỹ thuật ELI AE tóm bắt kháng ngyuên và ELISE cạnh tranh (hình 7.9)

7.5.1 Phương pháp ELI SA tóm bắt khánh nguyên (bánh kẹp)

Phương pháp này dùng ñể xác ñịnh những chất có phân tử lượng lớn về nguyên tác kháng thể gắn lên chất mang (thành giếng) Người ta bổ sung

KN, kháng thể thứ 2 ñể KT2 kết hợp với KN (cần phân tích) ở dạng bánh kẹp Sau ñó rửa trôi phần không bắt cặp và bổ sung kháng thể cộng hợp

Hình 7.9: Kỹ thuật ELI SA

enzyme, cơ chất Enzyme chuyển cơ chất thành hợp chất màu ñược xác ñịnh bằng phổ kế Từ nồng ñộ chất màu ta tính ñược nồng ñộ chất cần phân tích Bước 1: Nhỏ KT1 vào giếng ñể cho KT1 bám vào thành giếng (antitoxin)

Bước 2: Che bản bằng protein

Bước 3: Nhỏ kháng nguyên ñặc hiệu (toxin) ñể KN bắt cặp với KT1

Protein

Kháng nguyên

KT 1

Bước 4: Bổ sung KT2 ñể tạo phức hợp KT1-KN-KT2

-

Bước 7: Enzym chuyển cơ chất thành hợp chất màu xanh

Màu của dung dịch có thể phát hiện bằng mắt hoặc phổ kế, từ mật ñộ quang

ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên ( nồng ñộ ñộc tố)

7.4.2 Phương pháp ELISA cạnh tranh

Nguyên tắc:

Cộng hợp kháng nguyên và protein (hepten) ñược cố ñịnh trên bề mặt chất rắn Cho một lượng kháng nguyên tự do và kháng thể cộng hợp enzyme vào Kháng nguyên cố ñịnh và kháng nguyên tự do cạnh tranh nhau bám vào

Cơ chất

Cơ chất

kháng thể Lượng kháng nguyên tự do càng nhiều thì kháng thể bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại càng ít Sau khi rửa trôi các chất còn dư, bổ sung cơ chất ñể enzyme phân huỷ thành các hợp chất màu Màu của dung dịch có thể phát hiện bằng phổ kế, từ mật ñộ quang A1, A2 của mẫu chứng và mẫu nghiên cứu ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên (nồng ñộ ñộc tố) theo công thức

100 ;%

1

2 1

A

A A

C = −

Trong ñó: A1 là mật ñộ quang của mẫu chứng

A2 Mật ñộ quang của mẫu nghiên cứu

Nếu C ≥ 50% thì ñược coi là dương tính

Những test thường sử dụng:

Các enzyme ñược dùng ñặc biệt nhiều trong những test nhanh như spot test , dip test Ưu ñiểm của test là ñễ sử dụng, rẻ tiền nhanh và ñộ nhạy cao Tuy nhiên sử dụng test thì người nghiên cứu cần phải hiểu rõ nghiên cứu cử mình ñể sử dụng test cho thích hợp

A

AFB1 BSA

AFB1 BSA

AFB1

BSA

Cộng hợp protein (BSA) và kháng nguyên (AFB)

Bước 2: Tráng giếng bằng protein

Bước 3: Cho tiếp cộng hợp kháng thể gắn enzyme vào mẫu xét nghiệm và

mẫu chứng ñể tạo phức hợp KN-.KT.E,KN cố ñịnh - KT

Trong mẫu xét nghiệm, nếu kháng nguyên tự do càng nhiều thì kháng thể gắn với kháng nguyên cố ñịnh càng ít

Protein tráng giếng AFB

1 BS

A

AFB

1 BS

A

AFB

1 BS

A

AFB

1 BS

A

Kháng thể cộng hợp enzyme

Mẫu chứng không có A FB

Bước 4: Rửa trôi những kháng thể không bắt cặp với kháng nguyên cố ñịnh

của mẫu chứng và mẫu nghiên cứu

Như vậy mẫu chứng không có kháng nguyên tự do nên kháng thể cộng hợp

bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại nhiều hơn

AFB

1 BS

Mẫu nghiên cứu có có A FB tự do

Mẫu ñối chứng và mẫu nghiên cứu sau khi rủa trôi

AF BS

AF BS

AF BS

AF BS

Bước 5: Bổ sung cơ chất

Bước 6:Cơ chất bị enzyme phân huỷ thành hợp chất có màu xanh

Mẫu chứng có màu ñậm hơn mẫu nghiên cứu

AF BS

AF BS

AF BS

Cơ chất

AF BS

AF BS

AF BS

AF BS

Kỹ thuật gồm nhiều bước ñược tổng hợp của 3 phương pháp chính (ñiện di SDS- Page, wethern bot, ELISE)

- ðiện di protein trên gel acrylamit ñể tách protein

- Chuyển protein từ bảng gel lên màng lai (nitroxenlulose)

- Phủ huyết thanh chứa kháng thể lên màng lai và tiến hành lai

- Rửa những kháng thể không bắt cặp kháng nguyên trên màng lai ( proten)

- Thêm kháng kháng thể cộng hợp enzym ñể kháng thể phản ứng với phức hợp (kháng nguyên - kháng thể)

- Bổ sung cơ chất ñể enzyme thủy phân cơ chất thành dung dịch màu

- Xác ñịnh nồng ñộ kháng thể trong huyết thanh thông qua việc ño màu dung dịch bằng phổ kế

7.6 Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch

Thông thường các ñộc tố nấm mốc (AFB1) trong nông sản thực phẩm rất thấp (ở dạng lượng vết) ðể ñịnh lượng với ñộ chính xác AFB1 ta cần phải làm giàu mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch Sắc ký ái lực miễn dịch ñược dựa trên phản ứng ñặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên (AFB1) Phương pháp này không những chỉ ñặc hiệu mà còn ñơn giản, dễ thực hiện và không ñộc hại cho người sử dụng

Nguyên lý của sắc ký ái lực miễn dịch

Cột sắc ký ái lực miễn dịch ñược minh hoạ trên hình 7.10 Trên những hạt gel kháng thể ñặc hiệu với chất cần phân tích ñược gắn một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính Các hạt gel này ñược nhồi trong một cột nhỏ (cột sắc ký) Khi cho dịch chiết mẫu qua các cột này các chất cần phân tích (kháng nguyên) sẽ bị kháng thể giữ lại Sau khi toàn bộ mẫu ñã qua cột,

ta rửa cột ñể loại bỏ những phần không bắt cặp ñặc hiệu với kháng thể Sau

ñó sử dụng dung môi ñể kéo kháng nguyên ra khỏi kháng thể Dung dịch thu ñược, xác ñịnh bằng phương pháp ELISA hoặc một số phương pháp phân tích khác