công nghệ sản xuất phân đạm vi sinh vật

Hầu như mọi quá trìnhxảy ra trong đất đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật mùn hóa,khoáng hóa chất hữu cơ, phân giải, giải phóng chất dinh dưỡng vô cơ từ hợp chất

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU

Hàng năm nông phẩm trên toàn thế giới lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ Bằngcách bón phân, con người mới trả lại cho đất khoảng 50% Lượng thiếu hụt còn lại cơ bảnđược bổ sung bằng nitơ do các loài vi sinh vật tổng hợp nên Vì vậy nghiên cứu, sử dụngnguồn đạm sinh học được xem là một giải pháp quan trọng trong ngành nông nghiệp Đặcbiệt điều đó càng có ý nghĩa với một nước nông nghiệp có một nền công nghiệp hóa chưaphát triển như Việt Nam

Thêm vào đó, việc sử dụng phân hóa học, thuốc hóa học bảo vệ thực vật quá nhiềudẫn đến ô nhiễm môi trường đất, khiến cho đất không còn độ tơi xốp, khả năng hấp thụ

và giữ nước kém Các nhà khoa học đã kết luận: sử dụng phân hữu cơ vi sinh làm tăngnăng suất cây trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của NO3 Điều này cũng

có nghĩa phân hữu cơ vi sinh đã góp phần quan trọng trong việc cải tạo đất, đáp ứng chomột nền nông nghiệp hữu cơ bền vững, xanh sạch và an toàn

PHẦN 2 : NỘI DUNG

CHƯƠNG I KHÁI NIỆM

Cùng với chất hữu cơ, vi sinh vật sống trong đất, nước và vùng rễ cây có ý nghĩa rấtquan trọng trong các mối quan hệ giữa đất, cây trồng và phân bón Hầu như mọi quá trìnhxảy ra trong đất đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của vi sinh vật (mùn hóa,khoáng hóa chất hữu cơ, phân giải, giải phóng chất dinh dưỡng vô cơ từ hợp chất khó tanhoặc tổng hợp chất dinh dưỡng từ môi trường, ) Vì vậy, từ lâu vi sinh vật đã được coi làmột bộ phận của hệ thống dinh dưỡng cây trồng tổng hợp

Phân bón vi sinh vật (gọi tắt là phân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng

vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành Thông quacác hoạt động của chúng sau quá trình bón vào đất tạo nên các chất dinh dưỡng mà câytrồng sử dụng được ( N, P ,K, ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năngsuất và chất lượng nông sản Phân vi sinh phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đếnngười, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

Phân vsv cố định nitơ (phân đạm vi sinh) là sản phẩm chứa các vsv sống cộng sinhvới cây họ đậu (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen, v.v ), hội sinh trong vùng rễ cây

trồng cạn hay tự do trong đất, nước có khả năng sử dụng nitơ từ không khí, tổng hợpthành đạm cung cấp cho đất và cây trồng

CHƯƠNG II NITƠ TRONG TỰ NHIÊN VÀ VAI TRÒ CỦA NITƠ

Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật vàngay cả đối với các loài vi sinh vật Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn: trong không khí,nitơ chiếm 78,16% thể tích Người ta ước tính rằng, trong bầu không khí bao trùm lênmột hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ Lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồngtới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa nó) Trong cơ thể cácloại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0,4 x 109 tấn nitơ Trong các vật trầm tích chứakhoảng 4 x 1015 tỷ tấn nitơ

Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, N có vai trò sinh lý đặc biệt quantrọng đối với sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất N có mặt trong rất nhiềuhợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và nănglượng, đến hoạt động sinh lý của cây

- N là nguyên tố đặc thù của protein mà protein lại có vai trò cực kỳ quan trọng đối vớicây

+ Protein là thành phần chủ yếu tham gia cấu trúc nên hệ thống chất nguyên sinhtrong tế bào, cấu tạo nên hệ thống màng sinh học, các bào quan trong tế bào

+ Protein là thành phần bắt buộc của các enzyme

- N có trong thành phần của acid nucleic (AND và ARN) Ngoài chức năng duytrì và truyền thông tin di truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trìnhsinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào

- N là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyếtđịnh hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vậttrên trái đất

- N là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin

Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào và củacây

- N tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có vai trò quan trọng trong trao đổi nănglượng của cây

- N tham gia vào thành phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trìnhsinh trưởng, phát triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sựnảy mầm, tính hướng quang.

Vì vậy cây rất nhạy cảm với N N có tác dụng hai mặt đến năng suất cây trồng, nếu câytrồng thừa hay thiếu N đều có hại

- Thừa N: khác với các nguyên tố khác, việc thừa N có ảnh hưởng rất nghiêm trọng đếnsinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất ở cây trồng Cây sinh trưởng quá mạnh,thân lá tăng nhanh mà mô cơ giới kém hình thành nên cây rất yếu, dễ lốp đổ, giảm năngsuất nghiêm trọng và có trường hợp không có thu hoạch

- Thiếu N: thiếu N cây sinh trưởng kém, chlorophyl không được tổng hợp đầy đủ,

lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảmnăng suất Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít Trong trườnghợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh trưởng và pháttriển bình thường

CHƯƠNG III VÒNG TUẦN HOÀN CỦA NITƠ TRONG TỰ NHIÊN

Hình 3.1 : Vòng tuần hoàn của nitơ trong tự nhiên

3.1 Khái niệm

Chu trình nitơ là một quá trình mà theo đó nitơ bị biến đổi qua lại giữa các dạnghợp chất hóa học của nó Việc biến đổi này có thể được tiến hành bởi cả hai quá trình

sinh học và phi sinh học Quá trình quan trọng trong chu trình nitơ bao gồm sự cố địnhnitơ, khoáng hóa, nitrat hóa, và khử nitrat Thành phần chính của khí quyển (khoảng78%) là nitơ, có thể xem đó là một bể chứa nitơ lớn nhất Tuy nhiên, nitơ trong khí quyển

có những giá trị sử dụng hạn chế đối với sinh vật, dẫn đến việc khan hiếm lượng nitơ cóthể sử dụng được đối với một số kiểu hệ sinh thái Chu trình nitơ là một nhân tố đáng chú

ý của các nhà sinh thái học do chúng có thể ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của các quátrình sinh thái chính, như sản lượng thứ cấp và phân hủy Các hoạt động của con ngườinhư đốt nhiên liệu hóa học, sử dụng các loại phân bón nitơ nhân tạo và thải nitơ trongnước thải làm biến đổi đáng kể đến chu trình nitơ trên trái đất

*Vòng tuần hoàn của Nitrogen (N 2 ) gồm các nguyên tố hóa học sau:

Amoniac (NH3): là một hợp chất vô cơ Ở điều kiện tiêu chuẩn, nó là một chất khí độc, cómùi khai, tan nhiều trong nước NH3 có từ chất thải của cá, tôm, tép , và thức ăn thừa Nitrites (NO2) oxit của nitơ: Được chuyển hóa từ amonia NH3 bởi vi sinh Nitrosomonas

Bacteria, vẫn còn độc tố, khiến sinh vật sống khó thở, và chết ở nồng độ cao

Nitrates (NO3) oxit của nitơ: Được chuyển hóa từ NO2 bởi vi sinh Nitrospira Bacteria,

NO3 có độc tố nhẹ hơn NO2, dễ được hấp thụ bởi cây

Nitrogen (N2): Ở điều kiện bình thường nó là một chất khí không màu, không mùi,không vị và khá trơ và tồn tại dưới dạng phân tử N2, chiếm khoảng 78,16% khí quyểnTrái Đất và là thành phần của mọi cơ thể sống Nitơ tạo ra nhiều hợp chất quan trọng nhưcác axit amin, amoniac, nitric và các xyanua

Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại vi sinh vậtphân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng dễ tiêu (NH3 hoặc NH4+,cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ cho cây trồng, quá trình này được gọi là quá trình amônhóa

Tiếp nối quá trình amon hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ NH3 thành

NO3- được gọi là quá trình nitrat hóa

Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ NO3 - thành N2 để

bù trả nitơ cho không khí được gọi là quá trình phản nitrat hóa

Dưới tác dụng của các loại vi sinh vật, nitơ không khí được chuyển vào các hợp chấthữu cơ chứa nitơ được gọi là quá trình cố định nitơ phân tử

Tất cả các quá trình: cố định – phân hủy- chuyển hóa và phản nitrat hóa luôn xảy radưới tác dụng của các loài vi sinh vật và tạo được thế cân bằng nitơ Nhờ đó mà đã khép

kín được vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

CHƯƠNG IV QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định N2 cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ hoàntoàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng NH3 là sản phẩmđồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra giả thuyết về 2 con đường cố định N2 của vi sinhvật sống tự do trong đất như sau :

Hình 4.1 : Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định N 2

Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố định N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16-20 Kcalo/M, song lượng năng lượngvẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong tế bào visinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống enzyme hydrogenase hoạt hóa H2 và enzymenitrogenase hoạt hóa N2

Năm 1961-1962, người ta đã tách từ Clostridium asteurrianum hai tiểu phần hoạt

hóa H2 và N2 Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các tiểu phần đó.

Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe Nguồnhydro để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2) Trong trường hợp này thì dưới tác dụngcủa enzyme hydrogenase, điện tử được truyền theo hệ thống

Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic Đáng chú ý là trong quá trình truyềnđiện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd) Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzymehydrogenase và nitrogenase để cố định N2.

Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn Trong các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi

là leghemoglobin Nó dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu,

còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố

- Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )

- Có năng lượng (ATP) đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng Nhóm hoạtđộng của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họđậu thường có hiệu quả rất cao

- Tiến hành trong điều kiện yếm khí

Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp củacây chủ cung cấp Sự cố định N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N2

NH3 tạo thành trong quá trình cố định N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóacác cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổnghợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác

*Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng tới quá trình cố định nitơ phân tử:

Cường độ cố định nitơ phân tử phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố ngoại cảnh

Ngoài những đặc tính sinh học của vi khuẩn nốt sần thì những yếu tố ảnh hưởng rất lớnđến cường độ cố định nitơ phân tử đó là: khí hậu, thời tiết, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, vàcác nguyên tố dinh dưỡng trong môi trường sống, độ thoáng khí,…

Ở các vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới, cường độ cố định nitơ xảy ra mạnh hơn ở cácvùng ôn đới và hàn đới Về ánh sáng thì chỉ cần vừa đủ có tác dụng tốt cho sự hình thànhnốt sần và cố định nitơ

Điện thế OXH-K trong môi trường phù hợp là từ 10-30V, nếu lớn hơn 30V sẽ gâyảnh hưởng xấu đến sự phát triển của vi khuẩn nốt sần.

Tùy từng loại vi sinh vật cố định nitơ khác nhau mà thích ứng với môi trường của đấtkhác nhau, nhìn chung pH thích hợp là từ 6,5-7,5

Số lượng vi khuẩn cố định nitơ phân tử chuyên tính có trong đất ảnh hưởng trực tiếpđến hiệu lực của quá trình Để có thể xâm nhiễm vào rễ cây họ đậu được tốt, số lượng vikhuẩn nốt sần chuyên tính trong đất ít nhất phải đạt 104 tế bào/1g đất khô

Phương thức canh tác hợp lí, làm cho đất tơi xốp, thoáng khí, chế độ tưới tiêu phù hợp,bón phân hợp lí thì cường độ cố định nitơ phân tử cao và ngược lại

4.1 Quá trình amon hóa

Trong thiên nhiên tồn tại các dạng hợp chất Nitrogen hữu cơ, protein, acid amin,…các hợp chất này đi vào đất từ nguồn xác động, thực vật, các loại phân chuồng, phânxanh, rác thải hữu cơ Thực vật không thể đồng hóa được dạng nitrogen hữu cơ phức tạpnhư trên, nó chỉ có thể sử dụng sau quá trình amon hóa

Quá trình amon hóa là quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất nitrogen hữu

cơ (hợp chất hữu cơ có chứa N) dưới tác dụng của các loài vi sinh vật thành NH4 (NH3)cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng

4.1.1 Quá trình amon hóa ure

Đơn giản nhất đó là lượng ure chứa trong nước tiểu Người ta đã tính rằng trongnước tiểu có khoảng 2% ure Vậy nhân loại mỗi ngày thải ra hang vạn tấn ure, đó là chưa

kể lượng ure do các loài động vật thải ra Trái Đất sẽ bị hủy diệt như thế nào?

• Cơ chế của quá trình amon hóa ure

Dưới tác dụng của men ureaza do vi sinh vật tiết ra làm xúc tác cho quá trình chuyểnhóa ure:

vi sinh vật

CO(NH2)2 +2H2O → (NH4)2CO3

Ureaza(40 °C , pH 7.)

(NH2)2CO3 → 2NH3 + CO2 + H2O

Vi khuẩn ure có khả năng phân giải axit uric và xianamit canxi

Axit uric cũng là một chất hữu cơ chứa nitơ có trong nước tiểu ( trong 1 lít nước tiểu

có khoảng 0,5 gam axit uric) Vi sinh vật có khả năng phân giải urê thường cũng có khảnăng phân giải axit uric Dưới tác dụng của vi sinh vật, axit uric được chuyển hoá thànhurê và axit tactronic và sau đó urê tiếp tục được phân giải như trên

Xianamit canxi được phân giải như sau:

CNNCa + H2O → CN-NH2 + Ca(OH)2

CN-NH2+ H2O → CO(NH2)2

Sau đó các sản phẩm ure lại được phân giải như phưng trình trên để giải phóng ra NH3

*Các loại sinh vật phân giải ure.

Pasteur là người đầu tiên đã phát hiện ra vi khuẩn phân giải ure (1862) Cho đến nay

người ta đã phát hiện và phân lập được rất nhiều chủng vi khuẩn : Planosarcina ureae,

Micrococcus eurae, Sarcina hansenii, Bacillus pasteurii, Bac.hesmogenes, ….

Nhiều loại nấm mốc và xạ khuẩn cũng có khả năng phân giải ure

Vi khuẩn phân giải ure thường thuộc loại hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, chúngphát triển tốt ở PH = 6,5- 8,5

4.1.2 Quá trình amon hóa protein

*Khái niệm

Protein là thành phần cơ bản của chất nguyên sinh, hàng trăm protein được đưa vào đấtvới số lượng rât lớn (cùng với xác hữu cơ, phân chuồng, phân xanh, phân rác ) Trongprotein có chứa khoảng 15-17% nitơ

Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ (protein ) để tạo ra NH3 cungcấp dinh dưỡng cho cây trồng dưới tác dụng của các loài sinh vật được gọi là quá trìnhamon hóa protein

*Cơ chế của quá trình.

Dưới tác dụng của proteaza, các protein được phân giải thành các hợp chất đơn giản hơn.(polypeptit, olygopeptit) Các chất này tiếp tục được phân giải thành axit amin nhờtác dụng của men peptidaza ngoại bào Các chất này cũng có thể trực tiếp hấp thụ vào tếbào vi sinh vật, sau đó tiếp tục chuyển hóa thành axit amin Các axit amin này sẽ được sửdụng một phần vào quá trình sinh tổng hợp protein của vi sinh vật, một phần được tiếptục phân giải để tạo thành NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác

Quá trình khử amin sẽ sảy ra theo một trong những phản ứng sau:

Khi phân giải các axit amin chứa S (như metionin, xistin, xistein) vi sinh vật giảiphóng ra H2S và nếu tích lũy nhiều trong đất sẽ làm thối rễ cây trồng

Khi phân giải tryptophan, một số vi sinh vật có thể sinh ra chất có mùi thối là indon

và scaton

Một số amin sinh ra trong quá trình khử cacboxyl của các axit amin có thể độc vớingười và gia súc, đáng chú ý là histamin, acmatin, putrexin, cadavein

*Vi sinh vật.

Vi khuẩn gồm: Bacillus mycoides, B.mesentercus, B.subtilis, ptoteus vulgaris,

Chromobacterium prodogiosum, Psedomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium sporogenes.

Xạ khuẩn gồm: Steptomyces griseus, S.rimesus.

Nấm mốc : Aspergillus oryazae, A.flavus, A.terricoda, A.niger, Penicillum camomberli,

Kitin có mặt trong thành tế bào của nhiều loại nấm (nhất là Acomycetes và

Basidimomycetes), trong vỏ nhiều loại côn trùng.

Hàng năm có tới vài triệu tấn kitin của giáp xác hình thành trong các đại đương

Kitin cũng có số lượng không nhỏ trong đất.

Với khối lượng lớn như vậy, nhờ có các vi sinh vật, kitin được phân giải và chuyểnhóa để thành các chất hữu cơ đơn giản, sau đó tiếp tục phân giải để cho ra các dinh dưỡngcung cấp cho cây trồng

*Cơ chế phân giải kitin

Dưới tác dụng của enzym kitinaza phân giải kitin thành N-acetyl-glucozamin

*Những vi sinh vật phân giải kitin.

Có rất nhiều loại vi sinh vật phân giải kitin như:

- Vi khuẩn gồm: Achoromobacter, Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga,

Pseudomonas, Nocardia, Micromonospora.

- Nấm gồm: Aspergillus, Mortierella.

- Xạ khuẩn gồm: Steptomyces gricecus.

4.2 Quá trình nitrat hoá

*Khái niệm:

Quá trình nitrat hóa là quá trình oxy hoá sinh học NH3 và các muối amon thành NO3¯.

Vi sinh vật nhận được năng lượng cho hoạt động sống của mình thông qua quá trình này.Việc oxy hoá đi kèm với việc đồng hoá CO2.

*Cơ chế của quá trình nitrat hoá: Gồm hai giai đoạn

a Giai đoạn 1: giai đoạn oxy hoá amoniac, các muối amon thành acid nitrit, được xúc tác

bởi enzyme nitratereductase

2NH3 + 3O2 →2H+ + 2NO2¯+ 2H2O + 158cal

Thực chất của quá trình này còn xảy ra các giai đoạn trung gian tạo các sản phẩmtrung gian khác nhau:

NH3 → NH2OH→ HNO → HN(OH)2 → HNO2

Trong mỗi giai đoạn đều tạo ra một lượng năng lượng nhất định Năng lượng nàyđược vi khuẩn sử dụng trong quá trình phát triển của chúng

b Giai đoạn 2: giai đoạn oxy hoá nitrit thành nitrat

2NO2¯+O2 → 2NO3¯ + 48cal

Quá trình này cũng qua các giai đoạn trung gian khác nhau

HNO2 → N(OH)3→ HNO3

*Các nhóm vi sinh vật tham gia quá trình nitrat hoá: là vi sinh vật tự dưỡng hoá

năng vô cơ và thuộc loại hiếu khí bắt buộc:

+Nhóm thứ nhất (vi khuẩn nitrit hoá) thuộc các chi: Nitrosomonas, Nitrosolobus,

Nitrocystic, Nitrosospira…

Nitrosomonas

- Ở giai đoạn này thì pH thích hợp là 8,5 Nhiệt độ thích hợp từ 30-37oC

- Loài vi khuẩn nitrit hóa này thường có hình bầu dục, hình cầu, hình que

Điển hình là vi khuẩn Nitrosomonas: Có hình cầu hoặc hình bầu dục ngắn, thuộc vi

khuẩn Gram(-), không sinh bào tử, có thể chuyển động nhờ có tiên mao dài Vi khuẩnthuộc loại này thường hiếu động và có râu dài

+ Nhóm thứ hai (vi khuẩn nitrat hoá) thuộc các chi : Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus

- Ở giai đoạn này thì pH thích hợp từ 8,3-9,3 Nhiệt độ thích hợp từ 30-37oC

Nitrospira: có hai nhánh đều có hình xoắn và tế bào dài ngắn khác nhau Ngoài hình xoắn

ra cũng có loại trực khuẩn, không sinh bào tử, thuộc Gram(-)

Nitrobacter: chúng gồm nhiều vi khuẩn hợp thành là những trực khuẩn nhỏ, không có

bào tử, Gram(-) Các nhóm vi khuẩn thuộc nhóm nitrobacter phát triển chủ yếu trên môitrường có chất khoáng và có thể sử dụng khí CO2 để tự tổng hợp những chất hữu cơ của

cơ thể, kém nhạy bén với chất hữu cơ nhưng rất nhạy bén với các muối amoium

Trong số vi sinh vật thực hiện quá trình nitrat hoá ngoài nhóm tự dưỡng còn có

nhóm dị dưỡng bao gồm một số loại vi khuẩn và xạ khuẩn thuộc các chi Pseudomonas,

Streptomyces, Alcaligenes, Anthrobacter, Corynebacterium, Achromobacter, Nocardia…

*Tác hại và các biện pháp khắc phục:

a Tác hại:

Trước đây người ta cứ nghĩ rằng quá trình nitrat hoá là một quá trình có lợi cho nôngnghiệp vì cây trồng hấp thụ nitơ dạng NO3¯ nhanh hơn dạng NH4 Mặt khác quá trìnhchuyển hoá này làm tăng tính acid cho môi trường, vì vậy làm tăng quá trình khoáng hoámột số muối khó tan như phospho, cali, canxi hay magie

Ngày nay thì có quan niệm ngược lại: quá trình nitrat hoá là một quá trình có hại chonông nghiệp vì qua nhiều thí nghiệm cho thấy cây trồng hấp thụ dạng NH3 (NH4+) khôngthua kém NO3¯ Quá trình chuyển từ NH4+→NO3¯ làm tiền đề cho quá trình mất đạmtrong đất qua con đường thấm sâu, rửa trôi, đặc biệt là phản nitrat hoá Hơn nữa, dinh

dưỡng nitơ ở dạng NH+ đựoc giữ trong keo đất bền hơn ở dạng NO3¯.Quá trình chuyểnhoá này làm cho đất chua đi, ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển củacây trồng và làm ảnh hưởng đến hoạt động sống của khu hệ vi sinh vật đất.

Ngoài ra NO3¯ tích luỹ ở một mức độ quá mức cho phép sẽ làm cho đất bị ô nhiễmnitrat Cây trồng hấp thu một lượng nitrát quá nhiều, khi dùng làm lương thực thực phẩmcho người sẽ gây nên bệnh hiểm nghèo Ví dụ như khi có mặt Nitrat trong máu sẽ chuyểnhoá Hemoglobin thành Metheglobin, kết quả khi hàm lượng Hemoglobin giảm sẽ làmgiảm quá trình vận chuyển oxi trong máu Trong thời gian gần đây người ta cũng đãchứng minh được rằng Nitrat là tác nhân cho quá trình Nitro hoá một số hợp chất hữu cơtrong động thực vật gây nên quá trình đột biến dẫn đến gây ung thư Chúng còn có tácdụng phân huỷ một phần tường gạch làm phá huỷ các công trình xây dựng

b Các biện pháp khắc phục:

Ngoài các biện pháp như tưới tiêu, chủ động tránh các điều kiện ngập nước, yếmkhí, tránh khô hạn, áp dụng các công thức luân canh hợp lý ra, hiện nay người ta dùngcác biện pháp hoá học như: các dạng phân đạm bọc S, dùng thuốc ức chế nitrificid bónvào đất để ức chế hoạt động của nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình nitrat hoá

4.3 Quá trình phản nitrat hoá

*Khái niệm

Quá trình phản nitrat hoá là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrat thànhnitrogen phân tử đồng thời với việc oxy hoá các hợp chất hữu cơ như đường, rượu, acidhữu cơ thành CO2 và H2O.Chất nhận hydrogen cuối cùng là NO3¯ Năng lượng sinh ra khi oxy hoá cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình Quá trình phản nitrat hoá có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn trong điều kiện kịkhí nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện kị khí vì oxy có tác dụng ức chế quá trình phảnnitrat hoá

*Cơ chế quá trình phản nitrat hoá

-5S + 6KNO3 + 2CaCO3 → 3K2SO4 + 2CaSO4 + 2CO2 +3N2

Thiobacillus dentrificans là vi sinh vật dị dưỡng hoá năng oxy hoá phân tử lưu huỳnh lấy

năng lượng để tiến hành quá trình tổng hợp chất hữu cơ cho cơ thể

*Môt số vi sinh vật tham gia vào quá trình phản nitrat hoá: Pseudomonas

denitrificans, Achromobacter, P.stutzeri, P.fluorescens, Mierococcus denitrificant, Hidrogenomonas agilis.

Pseudomonas.

+ B.denitrificans: thuộc chu tiên mao trực khuẩn nhỏ, không tạo thành nha bào thuộc loại

yếm khí không hoàn toàn và khử nitrát thành nitơ

+A.stutzeri: Hình que không lớn, cấu tạo thành chuỗi Gram(-), trong điều kiện kị khí khử

Ngoài các biện pháp phòng trừ, người ta còn tiến hành làm cỏ, sục bùn, tiêu úng cho cácvùng bị úng lụt, tưới nước cho các vùng bị hạn, bón phân đạm vào lúc trời ít nắng cholúa.

4.4 Quá trình nitrit hoá

*Vi sinh vật tham gia vào quá trình nitrit hóa.

Những đại diện của chủng vi sinh vật Nitrosomonas có thể biến đổi amoniac thành nitrit,

một chất độc thậm chí với hàm lượng rất nhỏ Những vi sinh vật nitrit hoá đều là nhữngsinh vật tự dưỡng hoá tổng hợp, lấy năng lượng từ quá trình oxy hoá Nitrosomonas khichuyển hóa amoniac thành NO2- sinh ra năng lượng 65 Cal/mol

CHƯƠNG V CÁC VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM

5.1.Vi sinh vật cố định đạm tự do

5.1.1.Vi khuẩn Azotobacter

Đặc điểm:

Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, gram âm nhạy cảm với độ ẩm của đất và

hàm lượng các nguyên tố khoáng trong đất; P, K, Mo, B Nếu đảm bảo điều kiện hiếu khítốt thì chủng Azotobacter có thể cố định đạm từ 10- 30mg N, khi sử dụng 4g đường, ởnhiệt độ, thích hợp 25- 30oc, pH 7,2-8,2 Trong môi trường axit không có hoặc có ít

Azotobacter.

Phân loại:

Azotobacter phổ biến nhất là ba loài dưới đây:

Azo.chroococum: khi tế bào còn non có hình que, chuyển động được, kích thướt tế bào từ

3-7micromet Khi tế bào già thì có hình cầu, tế bào xếp thành từng đôi hay hình khối có

vỏ nhày Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn lạc nhày không có màu hoặc màu nâu

Azo.agile: dạng hình cầu hoặc oval có kích thướt từ 3- 5 micromet đứng riêng lẻ hoặc kết

đôi, khuẩn lạc nhẵn, tiết sắc tố vàng hay lục vào môi trường

Azo.vinelandii: trong môi trường mới cấy có hình que, kích thướt tế bào từ 2-3 micromet.

vvvvKhi tế bào già thì có hình cầu, bào tương rất đậm khuẩn lạc nhẵn, trong suốt thườngkhông có màng nhày Chúng thường tiết sắc tố huỳnh quang vào môi trường

Do Azotobacter có màng lipoprotein bên ngoài là những emzym hô hấp hoạt động

sử dụng oxi để hình thành ATP và làm cho oxi không thấm vào trong màng, nơi cónitrogennase tiến hành cố định đạm ở điều kiện kỵ khí NH3 được hình thành đến mộtmức độ nào đó sẽ kiềm hãm nitrogenase, nó chính là hoạt tính điều hòa nitrogenase Định tính và khả năng cố định đạm

Định tính: khuẩn lạc Azotobacter lồi, đàn hồi, hơi nhày, khi còn non có màu trắng

dần về già có màu nâu sẫm

Quan sát thấy những khuẩn lạc có đặc tính như trên đem nhuộm nang bằng cáchnuôi trên môi trường Ashby Sau 2 tuần tiến hành nhuộm nang, nhuộm đơn để quan sát

sự tạo nang

Sau khi xác định được sơ bộ những khuẩn lạc Azotobacter đem xác định hoạt tính

cố định đạm

Xác định khả năng cố định đạm bằng phương pháp đạm tổng số Các chủng vikhuẩn được nuôi cấy trong các bình chứa 100 ml môi trường Ashby vô đạm Sau 7 ngàylấy 10 ml dịch nuôi cấy đem vô cơ hoá và xác định đạm tổng -> xác định được lượngđạm cố định được trong 7 ngày nuôi cấy ở Azotobacter Chọn chủng vi khuẩn có khảnăng cố định đạm mạnh mẽ nhất

5.1.2.Vi khuẩn Azospirillum

Hiện nay chủng này đang được chú ý nhiều vì chúng có những đặc điểm sau:

Ngoài khả năng cố định đạm khi ở trạng thái cộng sinh thì còn tồn ở trạng thái tự do

Có thể cộng sinh với nhiều loài thực vật khác nhau không chỉ riêng ở cây họ đậu

Kích thích hấp thu dinh dưỡng khoáng của thực vật như NO3-, PO43-, K,Fe…

Sản sinh một số hormone ngoại tiết có khả năng điều hoà sinh trưởng thực vật như IAA(Indole-3-acetic acid), ILA (Indole-lactic acid)…

Đặc điểm:

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Spirillaceae, di chuyển mạnh Tế bào

có dạng xoắn từ nữa vòng đến vài vòng Khuẩn lạc phát triển một loại sắc tố màu hồng

trên môi trường có bổ sung đỏ cong-go còn các vi sinh vật đất khác không có khả năngnày

Bề mặt khuẩn lạc rắn và khô sau vài ngày trong tủ ấm Trong môi trường bán lỏng,Azospirillum hình thành một lớp váng mỏng màu trắng bên dưới bề mặt thoáng của môitrường 2-4mm (đây là đặc điểm đặc trưng nhất của loài này)

Tế bào khuẩn Azospirillum thuộc loại đơn mao và cũng có chủng thuộc đa mao

Phân loại:

Đến nay chưa có sự phân loại nào rõ ràng đối với Azospirillum

Theo Sampaio và cộng sự của ông (1978), dựa theo các đặc điểm sinh lý đã chi thành 3nhóm:

- Nhóm 1:

Có khả năng khử nitrat và tạo ra thể khí từ nitrat amon, không cần Biotin trong sinhtrưởng và cố định đạm, không sử dụng được glucose Hoạt tính Catalase dương Chịuđược các loại kháng sinh như: streptomicine, Tetraciline, Genlamicine,Cloramphenicol…

- Nhóm 2:

Bao gồm những chủng không cần nitrat nhưng cần Biotin để phát triển trên môi trường

có N2 và NH4 Phát triển trên môi trường có Glucose Hoạt tính Catalase dương Mẫn cảmvới các lại kháng sinh ở nhóm 1

- Nhóm 3:

Giống nhóm 1 nhưng có khả năng khử Nitrat cao hơn và rất nhạy với Tetraciline

Theo bảng phân loại của Bergey, Azospirillum được chia thành 5 nhóm:

Azospirillum lipoferum:

Được mô tả chi tiết đầu tiên bởi Tarrand Khuẩn lạc màu hồng, gồ cao, có rìa Khinuôi cấy trên môi trường khoai tây, tế bào có kích thước trung bình 1.3-5 µm

Azospirillum lipoferum có hình xoắn, di động bằng đơn mao, có khả năng sử dụng

glucose, a-cetoglutamate, citrate làm nguồn C khi nuôi cấy trên môi trường vô đạm,không sử dung được nguồn C là saccharose, cần Biotin cho sự phát triển

Tế bào trở nên dạng đa hình khi ở môi trường kiềm

· Azospirillum brasilense:

Có đặc điểm hình thái giống Azospirillum lipoferum, không có khả năng sử dụngglucose, saccharose, a-cetoglutamate, có khả năng sử dụng nguồn C từ citrate trên môitrường vô đạm

Tế bào không hình thành dạng đa hình trên môi trường kiềm

· Azospirillum irakense:

Tế bào có chiều rộng 0.6-0.9µm có khả năng sử dụng glucose, saccharose

Trên môi trường dịch thể không sử dụng được myo-inosytol, có khả năng phân giảipectin, phát triển trên môi trường có áp suất thẩm thấu cao

· Azospirillum halopraeferense:

Tế bào có chiều rộng 0.7-1.4µm, có khả năng sử dụng a-cetoglutamate làm nguồn C.Trên môi trường vô đạm không sử dụng được glucose, saccharose, cần biotin cho sự pháttriển trên môi trường có áp suất thẩm thấu cao

· Azospirillum amzonense:

Khuẩn lạc màu trắng, lớn 5µm, gồ cao, nhẵn Tế bào có chiều rộng 0.8-1µm, có khả năng

sử dụng glucose saccharose trên môi trường vô đạm

Định hoạt tính và khả năng cố định đạm:

Ta có thể tính và định lượng enzyme Nitrogenase thông qua sắc ký với enzyme chuẩn cóhàm lượng nhất định Nếu thấy xuất hiện những vạch tương đương với enzyme chuẩn thìxác định chúng có enzyme Nitrogenase hay có khả năng cố định đạm

Nuôi cấy Azospirillum trên môi trường Dobereiner và sử dụng để định đạm tổng số

với đối chứng (môi trường không nuôi cấy) nếu có sự gia tăng hàm lượng đạm chứng tỏchúng có khả năng cố định đạm

5.2 Vi sinh vật cố định Nitơ cộng sinh Rhizobium

Đặc điểm:

Rhizobium là một chi vi khuẩn Gram âm, sống trong đất có vai trò cố định đạm.

Rhizobium hình thành một nhóm vi khuẩn cộng sinh cố định đạm sống trong rễ của cáccây họ Đậu và Parasponia

Vi khuẩn này xâm chiếm tế bào rễ của cây tạo thành các nốt rễ; ở đây chúng biến đổinitơ trong khí quyển thành ammoniac và sau đó cung cấp các hợp chất nitơ hữu cơ nhưglutamin hoặc ureide cho cây Còn cây thì cung cấp các hợp chất hữu cơ cho vi khuẩn từquá trình quang hợp