PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ SÂU TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG

Tổng quát về lên men bề sâu: Là phương pháp được sử dụng nhiều nhất. Nó có thể cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận lợi, ít tốn kém mặt bằng. Do hệ thống khuấy trộn tốt nên toàn bộ môi trường nuôi cấy là một hệ thống nhất. So với phương pháp lên men bề mặt: Ưu điểm: Ít choán bề mặt Dễ cơ giới hoá và tự động hoá trong quá trình theo dõi. Nhược điểm: Đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị. Dễ hỏng cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn. Phế liệu phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi trường. Lên men gián đoạn: Trong phương pháp nuôi gián đoạn (batch – culture) thường vi sinh vật sinh trưởng đến chừng nào 1 thành phần chủ yếu của môi trường dinh dưỡng bị giới hạn. Khi đó, culture chuyển từ pha lũy thừa sang pha cân bằng. Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của điều kiện nuôi, sự giảm chất dinh dưỡng, sự tăng khối lượng tế bào  trạng thái sinh lý của tế bào cũng thay đổi. Lên men liên tục: Nguyên tắc: nguyên liệu liên tục vào và sản phẩm lên men liên tục ra. Là quá trình nuôi cấy VSV trong thiết bị được cấu tạo đặc biệt để sao cho khi vật nuôi đã phát triển đến một giai đoạn nào đó thích hợp cho việc lấy đi một thể tích môi trường lên men cùng tế bào và các sản phẩm trao đổi chất của chúng, lại bổ sung đúng một thể tích môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy, lúc đó ta có được trạng thái cân bằng động.

Đề tài:

Nhóm 2 GVHD: TRẦN THỊ MINH HÀ

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ SÂU TRONG MÔI TRƯỜNG

LỎNG

6.Hiền

1 • Tổng quát về lên men bề sâu

NỘI DUNG

- Là phương pháp được sử dụng nhiều nhất

- Nó có thể cho phép kiểm soát được toàn bộ quá trình lên men một cách thuận lợi, ít tốn kém mặt bằng

- Do hệ thống khuấy trộn tốt nên toàn bộ môi trường nuôi cấy là một hệ thống nhất

TỔNG QUÁT

So với phương pháp lên men bề mặt:

- Đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị

- Dễ hỏng cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn

- Phế liệu phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi trường

Áp dụng : cả VSV kỵ khí và hiếu khí

-VSV kỵ khí: trong quá trình nuôi không

cần sục khí chỉ thỉnh thoảng khuấy trộn.

-VSV hiếu khí: chỉ sử dụng được oxygen

hòa tan trong môi trường nên phải sục khí liên tục.

Đặc điểm:

-Dùng môi trường dịch thể

-Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được

phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt

tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng

-Trong suốt quá trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục

Ứng dụng:

-Sản xuất men bánh mì, protein đơn bào

-Các chế phẩm vi sinh làm phân bùn, thuốc trừ sâu

-Các enzyme, các acid amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học,

Ưu điểm:

- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.

- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp.

- Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn.

- Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá

- Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường, tránh sự lãng phí chất dinh dưỡng nằm lại trong khối

môi trường chất rắn mà vi sinh vật không sử dụng được.

 Nhược điểm :

- Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao

⇒ Vì vậy, những thiết bị lên men chìm cần phải

chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

⇒ Cần phải khuấy và sục khí liên tục vì VSV chỉ

sử dụng được oxy hoà tan trong môi trường Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy

LÊN MEN GIÁN ĐOẠN

- Trong phương pháp nuôi gián đoạn

(batch – culture) thường vi sinh vật sinh trưởng đến chừng nào 1 thành phần

chủ yếu của môi trường dinh dưỡng bị giới hạn.

- Khi đó, culture chuyển từ pha lũy thừa

sang pha cân bằng.

- Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo

dài của điều kiện nuôi, sự giảm chất

dinh dưỡng, sự tăng khối lượng tế bào

⇒ trạng thái sinh lý của tế bào cũng

thay đổi.

- Thường việc tạo thành sản phẩm

mong muốn liên quan 1 trạng thái sinh

lý nhất định trong pha sinh trưởng

Không thể duy trì trạng thái này trong 1 thời gian dài.

- Phương pháp nuôi gián đoạn được sử

dụng trước hết cho sự lên men vô

trùng, vì cách nuôi nàay dễ dàng về

mặt kĩ thuật.

• Đường cong sinh trưởng:

- Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được

nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong 1 môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong 1 hệ thống kín

- Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy

số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi.

Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín.

(Theo sách của Prescott, Harley và Klein)

* Giai đoạn tiềm phát (Lag phase):

Ở giai đoạn này số lượng VSV thường

không tăng lên ngay, tế bào chưa phân

cắt nhưng thể tích và khối lượng tăng lên

rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới

của tế bào

Nguyên nhân là do tế bào ở trạng thái

già, thiếu hụt ATP, các cofactor cần thiết

và ribosome Tế bào phải tự trang bị lại các thành phần của mình, tái tạo DNA và bắt đầu tăng khối lượng

- Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường.

+ Nếu tính chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài

+ Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào môi trường có thành phần tương tự thì giai đoạn này sẽ rút ngắn lại

+ Nếu cấy VSV từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài

Giai đoạn Logarit hay Pha chỉ số

• Quần thể VSV phân chia theo

lũy thừa thường xuyên và tốc

độ không đổi

• Đường cong sinh trưởng là một

đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc

• Kích thước, thành phần hóa

học, trạng thái sinh lý tế bào không thay đổi theo thời gian

Giai đoạn Logarit hay Pha chỉ số

• Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh

trưởng không đồng đều

• Sự sinh trưởng sẽ biến đổi cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới

 VSV khi chuyển sang môi trường nghèo cần có thời gian để tạo ra các enzim cần thiết.

 Việc tổng hợp protein và RNA là chậm cho nên tế bào nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi chúng có thể sinh trưởng tiếp.

 Sau đó sự sinh trưởng cân bằng sẽ được hồi phục và trở về lại giai đoạn logarit.

 Tế bào trước hết phải tạo nên

các ribosome mới có thể nâng

dưỡng sang một môi trườn

g giàu hơ n

Chuyển tế bào từ

một môi trường giàu dinh dưỡng t ới một môi

trường nghèo

Sự sinh trưởng của vi sinh vật được kiểm soát một cách

chính xác, phối hợp và phản ứng nhanh chóng với những

sự biến đổi của môi trường

Giai đoạn ổn định hay Pha cân bằng

• Số lượng tế bào sống không thay đổi, có thể do

số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số

lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất.

• Có nhiều nguyên nhân làm cho quần thể VSV

chuyển sang giai đoạn ổn định Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng

• Quần thể vi sinh vật cũng có thể bị đình chỉ sinh trưởng khi gặp sự tích lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại.

Giai đoạn ổn định hay Pha cân bằng

• Vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn

ổn định khi thiếu thức ăn Đối với vi khuẩn việc chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt

• Các tế bào đói có thể khó bị chết đi và đề kháng được với tình trạng bị đói, với sự biến hóa của nhiệt độ, sự

tổn thương về ôxy hóa và sự thẩm thấu, cũng như tăng sức đề kháng với các hóa chất có hại

• Những cải biến này rất có hiệu quả và làm cho một số

vi khuẩn có thể sống lại sau vài năm bị đói

Giai đoạn tử vong (Death phase)

- số lượng tế bào sống giảm xuống do các chất dinh dưỡng

bị tiêu hao, chất thải độc hại tích lũy môi trường sống của vsv bị tổn thất.

- Sự tử vong của quần thể vsv cũng có tính logarit

- Tổng số tế bào sống và tế bào chết không đổi

- Sau khi số lượng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ

chết của tế bào chậm lại do 1 số cá thể sống lại nhờ có tính

đề kháng đặc biệt mạnh

Tính toán về quá trình sinh trưởng

• Trong giai đoạn logarit mỗi cá thể vsv tiến hành phân cắt trong một thời gian hằng định, số lượng tế bào tăng theo phương thức 2n

• Thời gian giữa 2 lần phân cắt liên tiếp

được gọi là thời gian thế hệ

Một số công thức

• Công thức tính số lượng tế bào:

N1 = N0 2n

N0:số lượng tế bào ban đầu

N1: số lượng tế bào theo thời gian tN: số thế hệ

Tốc độ sinh trưởng bình quân k:

Thời gian thế hệ bình quân là đảo số của tốc độ tăng trưởng bình quân

K= n/t =

g = 1/k

XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI

SINH VẬT

o Xác định số lượng tế bào:

• Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi

• Thường dùng phòng đếm Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh

Petroff-• Phòng đếm hồng cầu có thể đếm được các tế bào nhân nguyên thủy và tế bào nhân thực

Phòng đếm Petroff-Hausser

XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

 Với động vật nguyên sinh, vi tảo và

nấm men có thể dùng máy đếm điện tử như Coulter Counter để xác định số lượng

 Kết quả máy này khá chính xác, có thể

dùng xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu, nhưng không thích hợp xác định số lượng vi khuẩn .

 Các phương pháp trên không phân biệt tế bào

sống và tế bào chết.

 Xác định tế bào sống: dùng phương pháp cấy

dịch pha trên môi trường đĩa.

 PP cho biết số lượng tế bào sống của VSV

⇒ đơn giản, nhạy cảm, được sử dụng rộng rãi

 Nên sử dụng độ pha loãng trong phạm vi 30 –

300

 Cấy dịch pha loãng trên bề mặt dàn đều bằng

que gạt thủy tinh cho kết quả cao về số lượng VSV so với pp trộn với môi trường thạch chưa đông

(a),(b): cách ri cấy tách khuẩn lạc riêng lẻ.

(c),(d): pha loãng trộn với MT thạch chưa đông.

(e),(f): cách dàn dịch pha loãng bằng que gạt.

 Ngoài ra, xác định số lượng VSV bằng

nuôi cấy giấy lọc đã lọc dịch pha loãng

(membrane filter)

 Sử dụng phân tích VSV trong nước

Phương pháp lọc màng để xác định số

lượng vsv

 Phương pháp màng lọc còn dùng để đếm

trực tiếp vi khuẩn

 Hiện nay, đã có những bộ kit thương mại

cho phép phân biệt tế bào sống và tế bào chết khi kiểm tra

 Xác định khối lượng tế bào:

• Phương pháp trực tiếp là xác định trọng lượng khô của tế bào

• PP này thích hợp xác định sự sinh trưởng của nấm

Thu nhận

sinh khối

tế bào

Rửa tế bào, làm khô

Cân trọng lượng khô

PP xác định trọng lượng khô của tế bào

có nhược điểm là tốn thời gian và không thật mẫn cảm

PP nhanh hơn mẫn cảm hơn là PP đo độ đục của ánh sáng

Lên men liên tục

• Nguyên tắc: nguyên liệu liên tục vào và sản

phẩm lên men liên tục ra

• Là quá trình nuôi cấy VSV trong thiết bị được cấu tạo đặc biệt để sao cho khi vật nuôi đã

phát triển đến một giai đoạn nào đó thích hợp cho việc lấy đi một thể tích môi trường lên

men cùng tế bào và các sản phẩm trao đổi

chất của chúng, lại bổ sung đúng một thể tích môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi

cấy, lúc đó ta có được trạng thái cân bằng

động

• Vi sinh vật trong bình nuôi luôn luôn ở pha logarit.

• Được ứng dụng để sản xuất protein đơn

bào( nấm men ), acid acetic, ethanol, và xữ lý nước thải của một số nhà máy

Phân loại

• Các phương pháp nuôi cấy liên tục là:

- Phương pháp đơn cấp

- Phương pháp nhiều cấp

Phương pháp đơn cấp

• Nuôi vi sinh vật trong một nồi lên men, môi

trường dinh dưỡng được bổ sung cũng như môi trường đã lên men rút ra khỏi nồi lên men một cách liên tục với cùng một tốc độ.

• Phương pháp này đơn giản, dễ ứng dụng vào sản xuất đối với tế bào nấm men để thu sinh khối

hoặc sản phẩm là các chất chuyển hoá gắn trực tiếp với sự phát triển của tế bào

• Vi sinh vật được nuôi ở hệ thống nồi lên men đặt làm nhiều cấp Nồi thứ nhất được dùng cho vi sinh vật phát triển tốt nhất, các nồi sau

để các tế bào tiết ra chất chuyển hoá

• Môi trường dinh dưỡng mới được bổ sung

vào nồi thứ nhất và từ đó lần lượt chảy vào nồi tiếp theo

 Nhược điểm:

• Đòi hỏi cán bộ và công nhân thành thạo chuyên môn Khi hoạt động, cùng một lúc phải có đủ các dạng năng lượng cần thiết, giá thành cao đối với tự động hoá và dụng cụ đo lường hiện đại.

• Trong quá trình nuôi cấy tế bào vi sinh vật có thể có

những đột biến bất ngờ xảy ra ⇒ hỏng cả quá trình.

• Phải vô khuẩn tuyệt đối trong toàn bộ thời gian thao tác

• Đối với các VSV sinh hệ sợi như nấm mốc và xạ khuẩn rất khó tách hệ sợi một cách vô khuẩn và đặc biệt là hiệu suất chuyển hoá thường thấp.

Chemostat và Turbidostat

Chemostat

• Khi sử dụng Chemostat để nuôi cấy vi sinh vật người

ta đưa môi trường vô khuẩn vào bình nuôi cấy với

lượng tương đương với tốc độ đưa môi trường chứa

vi khuẩn ra khỏi bình nuôi cấy

• Trong môi trường một số chất dinh dưỡng thiết yếu cần khống chế nồng độ trong một phạm vi nhất định

Vì vậy tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ

thống quyết định bởi tốc độ môi trường mới được đưa vào hệ thống và nồng độ tế bào phụ thuộc vào nồng độ các chất dinh dưỡng được hạn chế Nhịp độ đổi mới chất dinh dưỡng biểu thị bởi nhịp độ pha

loãng D (dilution rate)

• Tốc độ lưu thông của chất dinh dưỡng (ml/h) được biểu thị bằng f và thể tích bình nuôi cấy

là V (ml):

D= f/V

chemostat

CẢM ƠN CÔ VÀ