Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men aspergillus niger trên môi trường rắn xốp với năng suất 500 lít chế phẩm enzyme kĩ thuậtca

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ NHÀ MÁY SẢN XUẤT ENZYME CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN ASPERGILLUS

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH

HỌC

ĐỀ TÀI:

THIẾT KẾ NHÀ MÁY SẢN XUẤT ENZYME CELLULASE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN ASPERGILLUS NIGER TRÊN

MÔI TRƯỜNG RẮN-XỐP VỚI NĂNG SUẤT 500 LÍT CHẾ

PHẨM ENZYME KĨ THUẬT/CA

Người hướng dẫn: TS BÙI XUÂN ĐÔNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ DUNG

Số thẻ sinh viên: 107120245 Lớp: 12SH

Đà Nẵng, 5/2017

TÓM TẮT

Tên đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên

men Aspergillus Niger trên môi trường rắn-xốp với năng suất 500 lít chế phẩm enzyme

Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong chuyển hóa chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm (rượu, bia ), bảo vệ môi trường Do có nhiều ứng dụng trong thực tế nên việc thực hiện

đề tài “thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase” là một việc cần thiết

Từ luận giải trên đây, tôi đã tiến hành “thiết kế nhà máy sản xuất enzyme

Cellulase bằng phương pháp lên men Aspergillus niger trên môi trường rắn- xốp với

năng suất 500 lít chế phẩm enzyme kỹ thuật/ca” Để đạt được sản lượng trên phải sử dụng nguyên liệu bã mía với khối lượng 483,7 kg/ca Để đảm bảo sự vận hành đã tiến hành tính toán và chọn các thiết bị: xử lý nguyên liệu (máy nghiền bã mía, phối trộn nguyên liệu, hấp thanh trùng và làm nguội), lên men (nhân giống cấp I, II, nhân giống sản xuất và lên men trên khay, thiết bị thanh trùng khay, thiết bị định lượng khay), tinh chế sản phẩm (thiết bị nghiền mịn, trích ly, ly tâm, kết tủa, cô đặc) và cuối cùng đóng

kho chứa thành phẩm, trạm biến áp, nhà hành chính, xưởng cơ điện, gara ô tô, nhà xe, nhà ăn, đài nước, khi xử lý nước, khu xử lý nước thải, phân xưởng lò hơi, kho vật tư

Nhà máy sẽ được xây dựng tại khu công nghiệp Quảng Phú – Quảng Ngãi

Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Dung Số thẻ sinh viên: 107120245

Lớp: 12SH Khoa: Hóa Ngành: Công nghệ Sinh học

1 Tên đề tài:

Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men Aspergillus niger trên môi trường rắn-xốp với năng suất 500 lít chế phẩm enzyme kĩ thuật /ca

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

2 Các số liệu ban đầu:

- Độ đường của nguyên liệu: bã mía (phế liệu nhà máy đường), hàm lượng đường

- Danh mục thuật ngữ viết tắt

- Lời mở đầu

- Chương 1: Lập luận kinh tế

- Chương 2: Tổng quan tài liệu

- Chương 3: Chọn và thuyết minh dây chuyền công nghệ

- Chương 4: Cân bằng vật chất

- Chương 5: Tính và chọn thiết bị

- Chương 6: Tổ chức

- Chương 7: Tính xây dựng

- Chương 8: Tính điện, hơi và nước

- Chương 9: Kiểm tra sản xuất và đánh giá chất lượng sản phẩm

- Chương 10: An toàn lao động và vệ sinh xí nghiệp

- Kết luận

- Tài liệu tham khảo

4 Các bản vẽ:

3 Giáo viên hướng dẫn: TS Bùi Xuân Đông

4 Ngày giao nhiệm vụ: 16/02/2017

5 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/05/2017

Tiếp theo, em xin gửi đến lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè Những người luôn động viên, cổ vũ tinh thần và vật chất trong quá trình em thực hiện đề tài Luôn tạo điều kiện tối đa để em hoàn thành mọi nhiệm vụ

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các thầy cô Bộ môn Công nghệ

Sinh học - Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã truyền đạt những kiến

thức quý báu để có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình, và quan trọng hơn những kiến thức đó sẽ theo em trong suốt quá trình làm việc sau này

Xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày tháng 05 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Dung

LỜI CAM ĐOAN LIÊM CHÍNH HỌC THUẬT

Tôi xin cam đoan đây là đồ án do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả tính

toán là trung thực, không sao chép từ các công trình khác

Người cam đoan

Nguyễn Thị Dung

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP iii

LỜI CẢM ƠN v

LỜI CAM ĐOAN LIÊM CHÍNH HỌC THUẬT vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH xiv

DANH MỤC BẢNG xvi

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT xvii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I LẬP LUÂN KINH TẾ 2

1.1 Sự cần thiết phải đầu tư 2

1.2 Vị trí xây dựng 2

1.3 Giao thông vận tải 2

1.4 Nguồn cung cấp nguyên liệu 2

1.5 Điện – Nước – Xử lý nước thải 3

1.6 Hợp tác hóa 3

1.7 Tiêu Thụ 3

1.8 Kết luận 3

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về enzyme cellulase 4

2.1.1 Cấu tạo của cellulase 4

2.1.2 Tính đặc hiệu cơ chất 4

2.1.3 Ứng dụng của enzyme cellulase 6

2.2 Công nghệ sản xuất enzyme cellulase 8

2.2.1 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam và trên Thế giới 8

2.2.2 Các phương pháp sản xuất 10

2.2.3 Các nguồn vi sinh vật sinh enzyme cellulase 13

2.2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật cellulose 15

2.3 Tổng quan về nguyên liệu bã mía 17

2.3.1 Tình hình sản xuất 17

2.3.2 Ưu nhược điểm của bã mía 18

CHƯƠNG III CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN CÔNG NGHỆ 19

3.1 Chọn dây chuyền công nghệ 19

3.2 Thuyết minh quy trình công nghệ 20

3.2.1 Nguyên liệu bã mía 20

3.2.2 Nghiền 20

3.2.3 Phối trộn 20

3.2.4 Hấp thanh trùng 20

3.2.5 Làm nguội 20

3.2.6 Nhân giống sản xuất 21

3.2.7 Gieo giống 22

3.2.8 Lên men 22

3.2.9 Thu nhận sinh khối 23

3.2.10 Nghiền mịn 23

3.2.11 Trích ly 24

3.2.12 Ly tâm 1 24

3.2.13 Kết tủa 24

3.2.14 Ly tâm 2 25

3.2.15 Cô đặc 25

3.2.16 Bao gói 25

CHƯƠNG IV TÍNH TOÁN CÂN BẰNG VẬT CHẤT 26

4.1 Kế hoạch sản xuất của nhà máy 26

4.2 Các số liệu ban đầu 26

4.3 Hao hụt các công đoạn 27

4.4 Cân bằng vật chất trong quá trình sản xuất 27

4.4.1 Năng suất dây chuyền sản xuất sản phẩm enzyme kỹ thuật 27

4.4.2 Bao gói 28

4.4.3 Cô đặc 28

4.4.4 Kết tủa enzyme và ly tâm thu kết tủa 29

4.4.5 Ly tâm 30

4.4.6 Trích ly 31

4.4.7 Nghiền mịn 31

4.4.8 Thu nhận canh trường 31

4.4.9 Lên men 32

4.4.10 Gieo giống 32

4.4.11 Làm nguội 32

4.4.12 Hấp thanh trùng 32

4.4.13 Phối trộn 32

4.4.14 Lượng nguyên liệu sản xuất cho một mẻ 33

4.4.15 Nghiền và định lượng bã mía 33

4.4.16 Khoáng chất 33

4.4.17 Lượng nước cần cho dây chuyền sản xuất 34

4.4.18 Môi trường nhân giống 35

4.5 Tổng kết 38

CHƯƠNG V: TÍNH VÀ CHỌN THIẾT BỊ 39

5.1 Công thức tính số thiết bị sử dụng 39

5.2 Tính và chọn các thiết bị chính trong phân xưởng sản xuất 39

5.2.1 Máy nghiền bã mía 39

5.2.2 Thiết bị hấp thanh trùng 40

5.2.3 Thiết bị làm nguội 41

5.2.4 Thiết bị nhân giống 42

5.2.5 Máy trộn giống 45

5.2.6 Thiết bị định lượng vào khay 46

5.2.7 Thiết bị lên men 46

5.2.8 Thiết bị tiệt trùng khay 47

5.2.9 Thiết bị nghiền búa 48

5.2.10 Thiết bị trích ly 49

5.2.11 Thiết bị ly tâm 1 50

5.2.12 Thiết bị kết tủa 50

5.2.13 Thiết bị ly tâm thu kết tủa 51

5.2.14 Thiết bị cô đặc 51

5.2.15 Thiết bị bao gói 52

5.3 Thùng chứa hình trụ đứng 53

5.3.1 Thùng pha chế môi trường 54

5.3.2 Thùng chứa canh trường enzyme sau lên men 54

5.3.3 Thùng chứa dịch enzyme thô 55

5.3.4 Thùng chứa enzyme sau kết tủa 55

5.4 Tính và chọn Bunke 55

5.4.1 Tính và chọn Bunke chứa sinh khối 56

5.5.2 Tính và chọn Bunke chứa muối (NH 4 ) 2 SO 4 56

5.6 Thiết bị vận chuyển 57

5.6.1 Chọn bơm 57

5.6.2 Chọn vít tải 58

5.7 Tổng kết thiết bị 59

CHƯƠNG VI TÍNH TỔ CHỨC 62

6.1 Sơ đồ tổ chức nhà máy 62

6.2 Tổ chức lao động của nhà máy 62

6.2.1 Tính nhân lực lao động 63

6.2.2 Nhân lực nhà máy 63

CHƯƠNG VII TÍNH XÂY DỰNG 65

7.1 Phân xưởng sản xuất chính 65

7.2 Kho chứa nguyên liệu 65

7.3 Kho thành phẩm 65

7.4 Trạm biến áp 65

7.5 Nhà hành chính 66

7.6 Xưởng cơ điện 66

7.7 Gara ô tô 67

7.8 Nhà để xe máy cho cán bộ công nhân viên 67

7.9 Nhà ăn 67

7.10 Đài chứa nước 67

7.11 Khu xử lý nước 67

7.12 Khu xử lý nước thải 67

7.13 Phân xưởng lò hơi 67

7.14 Nhà bảo vệ 68

7.15 Trạm phát điện dự phòng 68

7.16 Kho vật tư thiết bị 68

7.17 Khu đất mở rộng 68

7.18 Phòng kỹ thuật 68

7.19 Phòng KCS 68

7.20 Quy cách bố trí mặt bằng nhà máy 68

CHƯƠNG VIII: TÍNH NHIỆT – HƠI – NƯỚC 71

8.1 Tính nhiệt hơi 71

8.1.1 Công đoạn thanh trùng 72

8.1.2 Tính nhiệt - hơi dùng trong trích ly 76

8.1.3 Tính nhiệt – hơi trong quá trình cô đặc 80

8.1.4 Công đoạn thanh trùng khay 80

8.1.5 Tổng lượng hơi dùng trong nhà máy 81

8.2 Tính nước 82

8.2.1 Nước dùng cho sản xuất 82

8.2.2 Nước sử dụng phục vụ cho việc sản xuất 82

8.2.3 Nước sinh hoạt 83

CHƯƠNG IX: KIỂM TRA SẢN XUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG 85

9.1 Các quy định về an toàn trong sản xuất và sử dụng Enzyme 85

9.1.1 Ảnh hưởng bất lợi có thể trong sản xuất và sử dụng Enzyme 85

9.1.2 Nội dung cần kiễm tra về an toàn 85

9.1.3 Những quy định về an toàn thực phẩm 86

9.2 Kiễm tra nguyên liệu 86

9.2.1 Bã mía 86

9.2.2 Nguồn muối vô cơ 86

9.2.3 Nước 86

9.3 Kiễm tra trên các công đoạn sản xuất 86

9.3.1 Công đoạn làm sạch và nghiền 86

9.3.2 Kiễm tra quá trình lên men 86

9.4 Kiễm tra chất lượng bán thành phẩm 87

9.5 Kiễm tra chất lượng sản phẩm 87

9.5.1 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định tọa độ Enzyme 87

9.5.2 Các phương pháp xác định tọa độ Enzyme 87

9.5.3 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng Enzyme 88

9.6 Các phương pháp đo hoạt độ enzyme Cellulase 89

9.6.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) 89

9.6.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme Cellulase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân 91

CHƯƠNG X: AN TOÀN LAO ĐỘNG VÀ VỆ SINH XÍ NGHIỆP 92

10.1 An toàn lao động 92

10.1.1 Tai nạn lao động và các nhóm yếu tố nguy hiểm trong sản xuất 92

10.1.2 Các biện pháp dự phòng đảm bảo an toàn 92

10.1.3 An toàn lao động trong công nghiệp vi sinh 93

10.1.4 Trạm nén khí 93

10.1.5 Máy lọc để làm sạch không khí và thu hồi bụi 93

10.1.6 Máy nghiền 94

10.1.7 An toàn thiết bị vận chuyển 94

10.1.8 Kỹ thuật an toàn khi nuôi cấy trên môi trường rắn 94

10.2 Bảo vệ môi trường 95

10.2.1 Làm sạch không khí 95

10.2.2 Làm sạch nước thải 95

KẾT LUẬN 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO 98

DANH MỤC HÌNH ẢNH

28 Hình 5.17 Mô phỏng kích thước Bunke 55

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có hoạt lực cao, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng và đảm bảo phản ứng xảy ra theo chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường

Nghiên cứu, sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme được phát triển mạnh từ đầu thế kỷ XX đến này Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước, Việt Nam là một trong nhiều nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme, Tuy nhiên, nền công nghiệp của nước ta chưa thực sự phát triển

Ngành công nghệ enzyme có mối liên hệ chặt chẽ với các ngành nghề khác, do vậy để thúc đẩy sự phát triển của các ngành khác, thì ngành công nghệ enzyme nói riêng

và các ngành khác thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học phải đi trước một bước, việc sản xuất và đưa vào sử dụng các sản phẩm sinh học trong nước thay thế dần nguồn hàng ngoại nhập sẽ cải thiện đáng kể khả năng cạnh tranh của hàng hóa trong nước trước xu thế hội nhập toàn cầu như hiện nay

Lý do tôi chọn đề tài “Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương

pháp lên men Aspergillus niger trên môi trường rắn-xốp với năng suất 500 lít chế phẩm enzyme kĩ thuật /ca” cho khóa luận tốt nghiệp của mình cũng xuất phát từ những quan

điểm trên, việc hiểu rõ về các quá trình trong việc xây dựng nhà máy trên mặt lý thuyết

sẽ giúp chúng ta có thể nắm bắt nhanh công nghệ vào sản xuất khi tham gia vào xây dựng nhà máy thực tế

CHƯƠNG I LẬP LUÂN KINH TẾ

Từ hàng nghìn năm trước con người đã biết tiến hành các quá trình lên men thủ công, sử dụng men để sản xuất các loại thực phẩm, đồ uống phục vụ cho nhu cầu của mình

Ngày nay dưới sự nghiên cứu của khoa học enzyme đã đươc sử dụng phổ biến và đóng vai trò quan trọng trong: công nghiệp thực phẩm, nước giải khát, rượu, bia

Công nghiệp thực phẩm hiện đại đã thay thế dần việc sử dụng enzyme có trong nguyên liệu bằng các enzyme kỹ thuật được sản xuất từ quá trình lên men của các vi sinh vật ví dụ như trong ngành sản xuất rượu bia đã thay thế một phần hoặc hoàn toàn enzyme trong đại mạch bằng enzyme sản xuất từ nấm mốc

1.1 Sự cần thiết phải đầu tư

Enzyme cellulase đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm Nhu cầu của enzyme này ngày càng tăng cao tuy nhiên nguồn enzyme được chiết xuất từ tự nhiên ít và hoạt lực không cao Mặt khác, nguồn bã mía sau quá trình sản xuất đường rất lớn nhưng chỉ một phần được sử dụng cho chăn nuôi còn lại thường được đốt gây ô nhiễm môi trường Vì vậy việc đầu tư nhà máy sản xuất chế phẩm ezyme cellulase từ nguồn nguyên liệu bã mía vừa đáp ứng nhu cầu phát triển kinh tế vừa giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

1.2 Vị trí xây dựng

Việc chọn Quảng Ngãi làm địa điểm xây dựng nhà máy có nhiều thuận lợi đối với quá trình sản xuất của nhà máy, trong đó các yếu tố tác động tích cực đến quá trình xây dựng nhà máy bao gồm: đặc điểm tự nhiên, giao thông vận tải, nguồn nguyên liệu, các vấn đề điện nước, xử lý nước thải và đặc biệt là vấn đề tiêu thụ và nguồn nhân lực của Quảng Ngãi

Khí hậu ở Quảng Ngãi là khí hậu nhiệt đới và gió mùa, nên nhiệt độ cao và ít biến

đây phân hóa thành 2 mùa rõ rệt, gồm có mùa mưa và mùa nắng

1.3 Giao thông vận tải

Nhà máy nằm trong khu công nghiệp Quảng Phú tại thành phố Quảng Ngãi thuộc tỉnh Quảng Ngãi Nơi được quy hoạch với nhiều công ty sản xuất bia, sữa, bánh kẹo với tuyến đường gần đường quốc lộ 1A thuận lợi cho việc vận chuyển nguyên liệu và sản phẩm

1.4 Nguồn cung cấp nguyên liệu

Nằm ngay cạnh công ty sản xuất đường Quảng Phú trong khu công nghiệp sẽ là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho công ty Ngoài ra còn có các nhà máy lân cận như nhà máy đường Phổ Phong sẽ là nơi cung cấp nguyên liệu cho công ty

1.5 Điện – Nước – Xử lý nước thải

Nhà máy dự định sẽ đặt tại khu công nghiệp Quảng Phú với cơ sở hạ tần đã hoàn thiện Nguồn cung cấp điện và nước sạch cho sản xuất sẽ được lấy từ hệ thống cung cấp của khu công nghiệp kết hợp với quá trình xử lý khi tiếp nhận tại nhà máy

Toàn bộ nước thải của nhà máy sẽ được thu gom và xử lý sơ bộ đáp ứng yêu cầu

về tiêu chuẩn đầu ra theo quy định của Khu công nghiệp Quảng Phú trước khi thải ra khu xử lý nước thải tập trung của khu công nghiệp Quảng Phú

Như vậy vấn đề Điện - Nước – Xử lý nước thải rất thuận lợi khi xây dựng nhà máy tại khu công nghiệp Quảng Phú

1.6 Hợp tác hóa

Nhà máy sản xuất enzyme đặt trong khu công nghiệp Quảng Phú nên quá trình hợp tác hóa được tiến hành chặt chẽ Do đó việc sử dụng các công trình chung như: điện, nước, giao thông được tiến hành thuận lợi và giảm chi phí cho đầu tư xây dựng

1.7 Tiêu Thụ

Vấn đề tiêu thụ là một trong hai vấn đề quan trọng nhất khi quyết định xây dựng nhà máy, nguồn nguyên liệu bền vững và đầu ra thuận lợi sẽ giúp nhà máy làm việc hiệu quả với năng suất thiết kế, đảm bảo việc làm cho người lao động và doanh thu của nhà máy

Nhà máy sản xuất enzyme cellulase được xây dựng tại cụm các Khu công nghiệp tại Quảng Ngãi, với nhiều nhà máy sản xuất và chế biến thực phẩm, các xí nghiệp thủy hải sản, các nhà máy dệt,… cho thấy tìm năng tiêu thụ sản phẩm là rất lớn

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về enzyme cellulase

2.1.1 Cấu tạo của cellulase

Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men Nguồn thu enzyme cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật [25]

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác

Hình 2.1 Cấu tạo của cellulase

2.1.2 Tính đặc hiệu cơ chất

2.1.2.1 Phân loại enzyme cellulase

Enzyme cellulase tham gia phân hủy cellulose được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu:

- 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase Enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase [Nguyễn Đức Lượng, 2004]

Enzyme này có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

Hình 2.2: Cấu trúc enzyme 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase

- 1,4 D glucan 4 glucanohydrolase Enzyme này tham gia phân giải liên kết 1,4 glucosid trong cellulose, lignin và β-D glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh [Nguyễn Đức Lượng, 2004]

β-Enzyme này còn có các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 glucanase và C-cellulase

Hình 2.3: Cấu trúc enzyme 1,4 β-D glucan 4 glucanohydrolase

- β-D glucoside glucohydrolase Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose tạo

thành glucose Chúng không có khả năng phân giải cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase [Nguyễn Đức Lượng,

2004]

Hình 2.4: Cấu trúc enzyme β-D glucoside glucohydrolase

2.1.2.2 Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase

Hình 2.5 Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase [36]

Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và α-D glucan một cách ngẫu nhiên Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose [33]

Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose

Cellobiase: Phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành glucose

2.1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường đến tính chất lý hóa của enzyme cellulase

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều

nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp Hoạt tính của enzyme cellulase

từ Aspergillus niger đạt tối đa ở 550C

- Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu

cho hoạt động của cellulase từ Aspergillus niger là 4,7 - 6,0

- Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme

- Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%

2.1.3 Ứng dụng của enzyme cellulase

2.1.3.1 Enzyme cellulase với công nghiệp thực phẩm [26]

Cellulase là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của các ngành trồng trọt và lâm nghiệp Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose Nó chỉ có giá

trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa Chế phẩm cellulase thường dùng để:

- Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

- Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

- Ứng dụng đầu tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng

độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên

Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa

Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vở thành tế bào Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức

ăn gia súc và công nghệ lên men Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao

2.1.3.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy [26]

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan như lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy

2.1.3.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi [26]

Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nếu thức ăn có trộn thêm cellulose sẽ tăng

sự tiêu hóa hấp thụ thức ăn cho động vật - đặc biệt động vật còn non, do đó sẽ giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai,

bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi

2.1.3.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ [26]

Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5%

2.1.3.5 Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh [26]

Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong

xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose,chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải

ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao

2.2 Công nghệ sản xuất enzyme cellulase

2.2.1 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam và trên Thế giới

2.2.1.1 Tình hình trên Thế Giới

Enzyme cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei,

Asp.niger và gần đây là từ các chủng vi khuẩn Ở Nhật, cellulase kỹ thuật thu nhận từ T.viride bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt theo quá trình koji như sau: cám mỳ được

xử lý nhiệt, cấy bào tử vào, nuôi ủ vào khay dưới điều kiện (pH, nhiệt độ, độ ẩm…) tối

ưu Sau 3÷5 ngày, môi trường lên men được chiết với nước, dịch chiết được cô đặc và enzyme được tủa bằng alcohol Thậm chí ngày nay, một vài công ty còn sản xuất enzyme

cellulase từ Trichoderma theo quá trình koji Tương tự, có thể áp dụng quá trình này để

sản xuất enzyme từ Asp.niger Theo Yamada (1977), khoảng 45 tấn cellulase được sản xuất từ T.viride và Asp.niger vào năm 1976

Việc sản xuất cellulase bằng phương pháp chìm được mô tả đầu tiên trong các patent của Nhật

Ở Mỹ, phòng thí nghiệm của quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers lần

đầu tiên sử dụng chủng T.viride QM 6 hoang dại để sản xuất enzyme cellulase

Sau đó gây đột biến và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao

Ở Pháp hãng Ly Ven sản xuất enzyme cellulase từ T.reesei và từ Asp.niger sử

dụng trong công nghiệp thực phẩm

Ở Canada, hãng Logene sản xuất enzyme cellulase sử dụng trong thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol

Loại chế phẩm được sản xuất ở Liên Xô sử dụng trong chăn nuôi có tên gọi là

“cellolignorin” Đây là sản phẩm nuôi cấy T Lignorum đã sấy khô đến chỉ còn 13% độ

ẩm, chứa 1 ÷ 50 đơn vị cellulase/g Ngoài các endoglucanase và exoglucanase còn có hemicellulase, pectinase và xylanase, pH thích hợp nhất cho chế phẩm này hoạt động từ 4,0 ÷ 4,5

Ở Nhật Bản Hãng Nagaze, Amano, dsiva kasei – zenibon sejkage hằng năm đã sản xuất đến 8000 tấn chế phẩm enzyme các loại để dùng trong nông nghiệp

Enzyme “penxenlase” chứa enzyme cellulase, hemicellulase, protease, và amylase Hoạt tính có các loại 500, 1000 và 1500 đơn vị/ gam, pH thích hợp từ 4,0 ÷ 5,5, nhiệt độ thích hợp là 600C

Chế phẩm cellulase “Onozyka” chứa cellulase và hemicellulase Chế phẩm này

thu được từ các dịch nuôi cấy bề mặt nấm T.viride Các điều kiện thích hợp như pH,

nhiệt độ cũng tương tự Pancellase

Chế phẩm enzyme “Celluzin” thu được từ nuôi cấy chìm nấm Asp.niger Hoạt

tính cellulase khoảng 450000 đơn vị/ gam

Ở Mỹ, chế phẩm “Biozim” được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt nấm

Asp.Oryzae Chế phẩm này chứa 26 loại enzyme khác nhau, trong số này có cellulase,

amylase…

Ở Bugari có loại chế phẩm “Xeaza T” chứa hoạt tín exoglucanase 268 đơn vị/gam

và endoglucanase 92 đơn vị/ gam, pH thích hợp từ 4,0 ÷ 5,5

2.2.1.2 Tình hình ở Việt Nam

Ở Việt Nam chưa có một chế phẩm enzyme cellulase nào được sản xuất chủ động

từ những nguồn nguyên liệu trong nước Việc sản xuất chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu nên nhu cầu enzyme chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài

Năm 1999, Nguyễn Đức Lượng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

cellulase từ Astinomyces griseus

Năm 1999, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 để bổ sung vào bể ủ rác thải

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

và đặc điểm cellulase từ chủng Aspergillus niger

2.2.2 Các phương pháp sản xuất

2.2.2.1 Nguyên liệu sản xuất

Loài người đã biết sử dụng và sản xuất một số chế phẩm enzyme từ cổ xưa như lợi dụng enzyme trong nấm men để lên men rượu và làm bánh mỳ, các enzyme của nấm mốc làm tương, xì dầu, các enzyme của đu đủ, phủ tạng làm nước nắm… Hồi xa xưa thường dùng enzyme ở dạng thô, có nghĩa là chỉ sử dụng enzyme ban đầu chưa được xử

lý Ngày nay, việc sản xuất enzyme đã trở thành một ngành công nghiệp với các dạng sản phẩm có độ tinh khiết khác nhau, từ dạng thô bao gồm cả nguyên liệu ban đầu với nhiều phức hệ enzyme đến những chế phẩm có độ tinh khiết cao hơn, rồi những enzyme hoàn toàn tinh khiết

Như chúng ta đã biết, enzyme có mặt ở khắp các mô, tế bào trong mọi sinh vật,

từ vi sinh vật cộng sinh đến động vật bậc cao Enzyme gắn liền với mọi quá trình sống của tế bào và toàn cơ thể sinh vật Khi cơ thể chết, các enzyme tiếp tục hoạt động trong một thời gian nữa, nếu kịp thời tách ra thì enzyme đó vẫn bảo toàn được hoạt tính Vì vậy, người ta dùng mô, các bộ phận thực vật, động vật và các tế bào vi sinh vật làm nguyên liệu để sản xuất enzyme

- Các nguồn enzyme thực vật thường là: hạt nẩy mầm, nhựa đu đủ, lá vả, dứa

- Các nguồn enzyme động vật thường là: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm Nhiều nước trên thế giới hàng năm đã sản xuất được một khối lượng lớn các enzyme từ động vật và thực vật Nguồn nguyên liệu này rất bị hạn chế vì chính việc sản xuất enzyme từ động vật và thực vật khó khăn và để sản xuất enzyme là không phải dùng toàn bộ mà chỉ dùng một vài bộ phận nào đó của vi sinh vật mà thôi Chính vì vậy, toàn bộ ngành công nghiệp sản xuất enzyme từ động vật và thực vật không thể phát triển

Ngày nay, ngành công nghiệp này chủ yếu được sản xuất từ vi sinh vật Các chủng

vi sinh vật thường sử dụng: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus,

Actinomyces, Streptomyces reticuli, Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis

2.2.2.2 Các phương pháp sản xuất enzyme cellulose

a Phương pháp nuôi cấy bề mặt [Bùi Xuân Đông, 2015]

Là phương pháp tạo môi trường để vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường

Về cơ bản, các nguyên liệu của môi trường dinh dưỡng như: nitơ, cacbon, vitamin, muối khoáng cho vi sinh vật phát triển Tuy nhiên muốn có môi trường dinh dưỡng tốt hơn có thể bổ sung thêm nitơ vô cơ hoặc hữu cơ và các chất cảm ứng khác tùy từng loại enzyme Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng và môi trường đặc

Quy trình sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Hình 2.6: Quy trình sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp

nuôi cấy bề mặt

b Phương pháp nuôi cấy chìm [Bùi Xuân Đông, 2015]

Trong nuôi cấy bằng phương pháp chìm, người ta thường sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men Trong các thiết bị lên men, thường lắp đặt các hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh

pH và nồng độ các chất dinh dưỡng Phương pháp này đòi hỏi phải vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng thiết bị, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao

Nuôi cấy, theo dõi, xử lý

Gieo giống

tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy

Quy trình công nghệ sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp nuôi cấy chìm

Hình 2.7: Quy trình công nghệ sản xuất enzyme cellulase bằng

phương pháp nuôi cấy chìm

2.2.2.3 Ưu nhược điểm của các quy trình

a Phương pháp nuôi cấy bề mặt [Bùi Xuân Đông, 2015]

- Ưu điểm

+ Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi

đã tách tế bào vi sinh vật Trong công nghiệp rượu muốn đường hóa 100kg tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng cần phải đến 100 lít nấm mốc chìm đã lọc bã

và tế bào vi sinh vật

+ Chế phẩm dể dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, dể bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme

+ Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện ở quy

mô nuôi cấy gia đình, trang trại cũng như ở quy mô lớn đến 20T/ngày

+ Nuôi cấy trong điều kiện không cần vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó

- Nhược điểm: Phương pháp này cho năng suất thấp, khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi cấy lớn, chất lượng chế phẩm các mẻ không đồng đều

b Phương pháp nuôi cấy chìm [Bùi Xuân Đông, 2015]

chức sản xuất tiết kiệm diện tích sản xuất

+ Có thể nuôi cấy dể dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện nuôi cấy vệ sinh, vô trùng

- Nhược điểm: tuy nhiên do enzyme thu được có nồng độ canh trường thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thất lớn

2.2.3 Các nguồn vi sinh vật sinh enzyme cellulase

2.2.3.1 Vi Khuẩn [Trần Hữu Uyển Hoàng Kim Cơ, 2001]

Trong điều kiện hiếu khí, có rất nhiều vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose nhờ vào hệ enzyme cellulase của chúng Cellulase là một phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào vi khuẩn Ở một số vi khuẩn, enzyme oxy hóa khử và enzyme phân hủy protein cũng tham gia vào quá trình trên Một

số loài vi khuẩn tiêu biểu có khả năng phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí:

Acetobacter xilinum, Achromabacter, Bacillus subtilis, Celvibrio fulvus, Cytophaga, Cellulomonas biazotea

2.2.3.2 Niêm vi khuẩn [27]

Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào việc phân hủy cellulose gồm niêm vi khuẩn, một số đại diện của các vi khuẩn sinh bào tử và không sinh bào tử,

xạ khuẩn, nấm Trong số này thì các loại niêm vi khuẩn là quan trọng hơn cả

Niêm vi khuẩn phân hủy cellulose chủ yếu được tìm thấy trong các giống

Cytophaga, Sporocytophaga và Soran – gium Chúng sống trong các loại đất ít acid,

Cytophaga, Sporocytophaga ưa thích cellulose hơn cả Nitrat là nguồn nitrogen tốt đối

với niêm vi khuẩn Niêm vi khuẩn nhận được năng lượng khi oxy hóa các sản phẩm của

2.2.3.3 Xạ khuẩn [Nguyễn Lân Dũng, 1979]

Là nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cellulose, lignin…Có trong bã thực vật để tạo thành các hợp chất trung gian, tổng hợp các chất mùn

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thậm chí trên những cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ trong tự nhiên Chúng sinh sản ra chất kháng sinh từ acid amin tạo thành trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn quang hợp và các chất hữu cơ Các chất kháng sinh này tiêu diệt vi khuẩn và nấm mốc gây hại

Khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn đã được nghiên cứu nhiều Harmsen (1964) chia xạ khuẩn phân hủy cellulose ra lam ba nhóm A, B, C Nhóm B và C phân hủy cellulose rất mạnh

Theo Krasilnikov (1949) thì các loài xạ khuẩn phân giải cellulose có thể xếp hạng theo mức độ phân giải từ mạnh xuống yếu như sau

+ Loài 1: Act Coelicolor, Act Sulfureus, Act Aureus, Act Cellulose

+ Loài 2: Act Hydroscopicus, Act Griseoflavus, Act Ochroleucus, Act

Loidensis, Act Viridans, Act Griseolus

+ Loài 3: Act Themofuscus, Act Xanthostromus

+ Loài 4: Act Flavochromogenes, Act Bovis, Act Sampsonii

2.2.3.4 Nấm sợi

Có nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra 1 lượng lớn cellulase thuộc giống

Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus…Trong đó có 2 giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất

cellulase

Nấm sợi Aps.niger [Nguyễn Lân Dũng, 1979] Vị trí phân loại và các đặc điểm

sinh lý, sinh hóa và sinh thái

Vị trí phân loại của Asp.niger được xếp như sau:

Sinh giới: Eukaryote

Khuẩn lạc Asp.niger trên môi trường Czapek với pH = 5,5 có dạng lông nhung,

khi còn non có màu trắng, khi sinh bào tử màu đen, mặt trái của peptri thường có màu vàng nhạt đến vàng sáng Hình 2.8 là một đĩa petri chứa Asp.niger nuôi cấy trên môi trường Czapek Hình bên trái là mặt phải của còn hình bên trái là mặt sau của đĩa thạch

Cuống sinh bào tử được sinh ra từ

khuẩn ty khí sinh có chiều dài 1 ÷ 3 mm, có

vách tế bào trơn bóng và trong suốt Đỉnh

cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi là

bọng, có đường kính từ 50 ÷ 75 µm, sinh ra

2 lớp thể bình, lớp thứ nhất hình tam giác

cân ngược, lớp thứ hai hình chai, sinh ra bào

tử đính hình cầu, bào tử đính có đường kính

4 ÷ 5 µm, có màu nâu đen, vách bào tử đính

có dạng xù xì

Hình 2.9: Sợi nấm Asp.niger dưới kính hiển vi

Đặc tính sinh lý: Asp.niger sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 6 ÷ 80C, tối đa 45 ÷

cho biết bào tử đính có thể nẩy mầm trong môi trường có thế nước 0,77 ở 370C

Asp.Niger có thể sinh trưởng ở pH = 2 trong điều kiện có thế nước cao (pitt, 1981) [1]

Độc tố: Asp.niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng

rãi trong chế biến thực phẩm Các enzym thủy phân thu nhận được từ chủng này không gây đột biến vi khuẩn và các mô của chuột Tuy nhiên, theo thống tin gần đây có 2 trong

số 19 chủng Asp.niger phân lập được sinh ra Ochratoxin A (Abarca, 1994)

Sinh thái: Asp.niger chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới Bào tử đính màu đen

nên không bị ảnh hưởng bởi tia mặt trời và tia UV Asp.niger thường được phân lập từ

các sản phẩm phơi nắng: cá, cây gia vị

Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Asp.niger

Theo Hurst (1977), endoglucanase từ Asp.niger có trọng lượng phân tử là 26000

cho biết β – glucosidase từ Asp.niger có trọng lượng phân tử khoảng 200 kDa, điểm

đẳng điện là 4,05 và chứa 33% carbohydrate Enzym này thủy phân cellobiose ở pH và

2.2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật cellulose

2.2.4.1 Nguồn carbon [Lương Đức Phẩm, 2004]

Theo lý thuyết sinh tổng hợp của enzym cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và là nguồn carbon

Những nguồn cellulose có thể là vỏ sắn, giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô,

cám, mùn cưa, bã củ cải, rơm, than bùn…Trichoderma lignorum và Tr.koningi nuôi trên

môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất Kết quả cũng

tương tự như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi

ngô, bã củ cải

Chất cảm ứng của enzym cellulase còn là cellobiosooctacetat, cám mì, lactose

salicyl Đối với Stachybotrit atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là

tinh bột 1%

Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalat, xuccinat và những sản phẩm trung gian của vòng Krebs) có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp cellulase Song, trong môi trường với nồng độ glucose rất ít tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển tạo thành enzyme Glycerin chỉ có tác dụng kích thích vi sinh vật sinh trưởng phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme

2.2.4.2 Nguồn Nitơ [Lương Đức Phẩm, 2004]

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các sinh vật cellulase là muối nitrat

các muối amon ít tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì rằng môi trong các muối này làm cho môi trường acid hóa Điều này không những ức chế trong quá trình sinh tổng hợp enzyme mà còn có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lý của từng chủng giống Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật nhưng với cao ngô khả năng

2.2.4.3 Nguồn khoáng chất [Lương Đức Phẩm, 2004]

Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu…) có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích của Zn: 0,11 ÷ 22 mg/l, Fe: 2 ÷ 10 mg/l, Mn: 3,4 ÷ 27,2 mg/l

2.2.4.4 Chất kích thích sinh trưởng [Lương Đức Phẩm, 2004]

Biotin và tiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme này

2.2.5.5 Phương pháp nuôi cấy [Lương Đức Phẩm, 2004]

Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường rắn, đôi khi dùng môi trường lỏng

Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: Cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương…Môi trường lỏng thường là các dịch rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có thêm muối khoáng Môi trường lỏng ít dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này

– Ưu điểm của phương pháp này

+ Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, qui trình công nghệ không phức tạp

+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm vì nuôi cấy bề mặt tạo các điều kiện giống điều kiện tự nhiên thực tế cho nấm mốc phát triển

+ Chế phẩm enzyme sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém

+ Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý

– Tuy nhiên phương pháp này có những nhược điểm:

+ Chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn

2.3 Tổng quan về nguyên liệu bã mía

2.3.1 Tình hình sản xuất

Cùng với sự phát triển chung của đất nước, ngành mía đường Việt Nam đang nỗ lực phấn đấu để đạt chỉ tiêu sản xuất một triệu tấn đường vào năm 2000, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và tiến tới xuất khẩu Song song với quá trình sản xuất đường

từ mía, ngành mía đường cũng thải ra một lượng bã mía khổng lồ (lượng bã mía thường chiếm 25 – 26% lượng mía tươi) Việc sử dụng bã mía ở các nhà máy đường đưa vào đốt lò hơi, làm giấy hay phân bón cũng chỉ hết 60%, còn lại 40% thải ra môi trường gây

ra ô nhiễm Nhiều nhà máy đường ở Việt Nam hiện nay chưa có biện pháp thích hợp để

xử lý chất thải trước khi đưa vào môi trường Các biện pháp như chôn lấp, đổ chất thải vào sông, hồ đều trực tiếp gây nên hậu quả ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới sinh thái Theo báo cáo của công ty đường 333 Dăk Lăk, việc đốt bã mía của nhà máy đường đã

quanh nhà máy Bụi vào phổi gây kích thích cơ học, xơ hoá phổi dẫn đến các bệnh hô

nhiễm không khí được xem là nguy hiểm nhất đối với sức khoẻ con người, động vật và khí quyển, gây ra các bệnh về đường hô hấp cho con người và có thể gây tử vong ở nồng

độ cao

Bã mía chiếm 25 – 30% trọng lượng mía đem ép Trong bã mía chứa trung bình 49% là nước, 48% là xơ (trong đó chứa 45 – 55% cellulose) 2.5% là chất hoà tan

(đường).Đây là nguồn cacbon quá giá để sản xuất enzyme cellulose từ vi sinh vật

2.3.2 Ưu nhược điểm của bã mía

2.3.2.1 Ưu điểm của bã mía

Cùng với sự phát triển của nền công nghiệp đường, thì lượng bã mía thải ra càng ngày càng nhiều cũng là một vấn đề lớn đối với môi trường Với lượng bã mía thải ra nhiều như vậy chúng ta có thể tận dụng để làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme Mặt khác trong bã mía sau khi thải ra còn chứa một hàm lượng đường cao đó là nguồn nguyên liệu tốt cho vi sinh vật phát triển Vì vậy sử dụng bã mía là một phương pháp tốt

để giải quyết vấn đề môi trường và nguồn nguyên liệu hiện nay

2.3.2.2 Nhược điểm của bã mía

Có hàm lượng đường khá cao dẫn đến dể bị các vi sinh vật và các loại côn trùng khác xâm nhập làm hư hại bã mía

CHƯƠNG III CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN

CÔNG NGHỆ 3.1 Chọn dây chuyền công nghệ

Bã mía Nghiền

Nhân giống sản xuất

Thu nhận sinh khối

Nghiền mịn

Trích ly

Ly tâm 1 Kết tủa enzyme

Ly tâm 2

Cô đặc Chế phẩm enzyme kỹ thuật

3.2 Thuyết minh quy trình công nghệ

3.2.1 Nguyên liệu bã mía

Nguyên liệu bã mía được thu gom và vận chuyển từ các nhà máy đường đến kho

dự trử để bảo quản tại kho và chuẩn bị nguyên liệu cho sản xuất Trong kho bã mía được chất đống và bảo quản với nhiệt độ và độ ẩm của phòng

– Mục đích: Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men sau này

– Cách tiến hành: Hỗn hợp bã mía, nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cần thiết khác được định lượng và trộn đều theo tỉ lệ tính toán

Nước làm ẩm, phục vụ trực tiếp cho tiệt trùng, đảm bảo chế độ làm ẩm cho quá trình nuôi cấy, độ ẩm tối ưu là 58 ÷ 60%

Thành phần môi trường nuôi cấy:

thành phần quá nhảo hoặc quá khô so với yêu cầu

3.2.6 Nhân giống sản xuất

3.2.6.1 Hoạt hóa giống

Giống trong ống nghiệm được giữ ở trạng thái hoạt động bằng cách cấy chuyền mỗi tháng một lần trong các môi trường thạch Sapek [28]

Thành phần môi trường thạch Sapek:

Nước 1000ml Saccroza 30g NaNO3 3g

KH2PO2 1g MgSO4.7H2O 0.5g KCl 0.5g FeSO4 0.01g Dung dịch tự phân nấm men 10ml pH = 4 ÷ 5

– Mục đích: Hoạt hóa giống gốc và cho giống vi sinh vật làm quen với môi trường lên men sẽ sản xuất trên quy mô công nghiệp

– Cách tiến hành:

Nhân giống trên máy lắc Môi trường trong giai đoạn này cũng là môi trường trên mốc giống được nuôi trong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc

3.2.6.2 Nhân giống cấp 1

Nhân giống trên máy lắc

Thành phần môi trường Czapek:

3.2.6.4 Nhân giống sản xuất

Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 7% chuyển qua phòng nhân giống để nhân giống sản xuất Quá trình nhân giống sản xuất cũng được thực hiện trên khay và được thực hiện trong phòng nhân giống

3.2.7 Gieo giống

– Mục đích: Phân bố giống đều trên môi trường nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho giống phát triển tốt

hành gieo giống theo tỉ lệ là 7%

3.2.8 Lên men

– Mục đích: Đây là giai đoạn quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình, giai đoạn này cần được giám sát chặt chẽ Những thay đổi của các thông số sinh lý trong giai đoạn này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng enzyme thành phẩm

– Cách tiến hành: Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được vít tải chuyển lên thiết bị định lượng khay Từ thiết bị đinh lượng này canh trường được đưa vào khay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy và tiến hành nuôi

Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường Đây là môi trường bán rắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môi trường Độ

ẩm 96 ÷ 98%

Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36 ÷ 60 giờ, trung bình thường là 42 giờ Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1:

Thường kéo dài từ 10 ÷ 14 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy Trong giai đoạn này có

những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc

+ Enzyme mới bắt đầu hình thành

+ Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt Tuyệt đối không được để

+ Môi trường được kết lại khá chặt

+ Độ ẩm của môi trường giảm dần

+ Các loại enzyme được hình thành, trong đó cellulase hình thành nhiều nhất

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 20 giờ tiếp theo Ở giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó quá trình giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

+ Nhiệt độ khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường

Cần dùng quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này, vì trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều và giảm hoạt lực enzyme

3.2.9 Thu nhận sinh khối

– Mục đích: Tập trung lượng canh trường có thể thu nhận enzyme để thuận lợi cho quá trình tiếp theo

– Cách tiến hành: Canh trường nấm mốc sau khi nuôi cấy đạt yêu cầu được đưa lên các thùng chứa sau đó đi vào quá trình nghiền

3.2.10 Nghiền mịn

– Mục đích: Vừa phá vỡ tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của canh trường nấm mốc sau nuôi cấy