Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh học tại việt nam

Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh học tại Việt Nam Lê Thị Phương Trường Đại học

Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh

học tại Việt Nam

Lê Thị Phương

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Khoa học Môi trường; Mã số: 60 85 02

Người hướng dẫn: TS Lê Đức Minh

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nêu những nguyên nhân gây ra suy giảm đa dạng tại Việt Nam và tính cấp

thiết cần xây dựng một cơ sở dữ liệu sinh học phân tử giúp cho các nhà quản lý và nhà khoa học trong công tác bảo tồn đa dạng sinh học tại Việt Nam Tổng quan các tài liệu trên thế giới để nêu ra được tính ưu việt trong việc sử dụng ADN đặc biệt là các gen ty thể trong việc nhận biết các loài bằng phương pháp này Tổng hợp được tất cả các chuỗi ADN thuộc 2 gen được dùng phổ biến nhất hiện nay là gen cyt b và gen COI từ ngân hàng gen đối với các loài được ưu tiên bảo vệ trong Nghị định 32 của chính phủ Đánh giá được khả năng nhận dạng loài dựa vào khoảng cách di truyền gen COI và Cyt b So sánh được hiệu quả nhận dạng giữa hai kiểu gen Cyt b và COI Đánh giá được khoảng cách di truyền trong chủng loại ở cả hai kiểu gen Cyt b và COI Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho tất cả các loài ở cả hai kiểu gen COI và Cyt b, qua

đó cho thấy những dữ liệu trên ngân hàng gen còn có nhiều thiếu sót và chưa thể sử dụng ngay trong điều kiện Việt Nam Kiến nghị cần phải có thêm những nghiên cứu

về nhận dạng loài dựa vào đặc điểm di truyền để hoàn thiện hơn cơ sở dữ liệu cho

nhận dạng loài

Keywords: Khoa học môi trường; Bảo tồn sinh học; Quản lý động vật rừng

Content

1 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Việt Nam là một nước có mức độ đa dạng sinh học cao với nhiều loài đặc hữu Tuy nhiên đa dạng sinh học tại Việt Nam trong những năm gần đây đang phải đối mặt với những mối đe dọa vô cùng nghiêm trọng từ các hoạt động của con người như khai thác quá mức, phá hủy và làm xuống cấp môi trường tự nhiên, ô nhiễm môi trường, sinh vật ngoại lai và gần đây tác động của biến đổi khí hậu

Để đối phó với những mối đe dọa về đa dạng sinh học này, chúng ta cần có những công cụ hữu hiệu giúp cho những nhà khoa học và những nhà quản lý có thể kiểm soát tốt hơn những hoạt động gây ảnh hưởng tới các loài hiện đang nguy cấp Một trong những công cụ đang được các nước trên thế giới phát triển là các cơ sở dữ liệu sinh học phân tử, cụ thể là các chuỗi ADN đặc trưng cho các loài đang được quan tâm Sử dụng công cụ này cho phép tăng cường hiệu quả của công tác thực thi pháp luật, đặc biệt là kiểm soát nạn buôn bán đang diễn

ra tràn lan, cũng như giám sát các loài này trong môi trường sống của chúng giúp cho công tác bảo tồn nguyên vị

Tuy nhiên hiện nay nước ta chưa có một cơ sở dữ liệu nào có thể sử dụng vào những mục đích nói trên Chính vì vậy đề tài luận văn “Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh học tại Việt Nam” đem lại ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần bước đầu đánh giá tính khả thi cũng như những thiếu sót cần phải khắc phục trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu

2 Sự suy giảm đa dạng sinh học ở Việt Nam

Hiện nay Việt Nam đang phải đối mặt với nguy cơ suy thoái đa dạng sinh học Trong hội nghị môi trường toàn quốc đang diễn ra ở Hà Nội, các nhà khoa học cho rằng sự suy thoái

đa dạng sinh học được thể hiện ở sự suy giảm của diện tích rừng có hệ sinh thái tự nhiên quan trọng, số lượng cá thể của các loài sinh vật biển, các loài hoang dã, các nguồn gen hoang dã Trong đó nổi bật nhất là sự suy giảm cũng như tuyệt chủng của các loài động thực vật hoang dã

Nhiều loài động vật, thực vật hoang dã của Việt Nam đang bị đe dọa nghiêm trọng, ông Đặng Huy Huỳnh, Chủ tịch Hội động vật học Việt Nam, cảnh báo Theo Sách Đỏ Việt Nam 2007, tổng số các loại động-thực vật hoang dã trong thiên nhiên đang bị de dọa hiện nay

là 882 loài (418 loài động vật và 464 loại thực vật), tăng 161 loài so với thời điểm năm 1992 Trong Sách Đỏ Việt Nam, phần động vật (1992), mức độ bị đe dọa của các loài chỉ mới dừng lại ở hạng “nguy cấp”, thì đến thời điểm này đã có tới 9 loài động vật được xem đã tuyệt chủng ngoài tự nhiên tại Việt Nam, cụ thể là: Tê giác 2 sừng (Dicerorhynus sumatrensis), Bò xám (Bos sauveli), Heo vòi (Tapirus indicus), Cầy rái cá (Cynogale lowei), cá Chép gốc (Procypris merus), cá Chình Nhật (Angilla japonica), cá Lợ thân thấp(Cyprinus multitaeniata), Hươu sao (Cervus nippon), cá Sấu hoa cà (Crocodylus porosus) Trong hệ thực vật, một số loài Lan hài Việt Nam đã tuyệt chủng ngoài thiên nhiên Số lượng các loài thuỷ sinh vật, đặc biệt các loài tôm, cá có giá trị kinh tế bị giảm sút nhanh chóng Số lượng cá thể các loài cá nước ngọt quý hiếm, có giá trị kinh tế, các loài có tập tính di cư bị giảm sút

3 Các mối đe dọa đến đa dạng sinh học của Việt Nam

*Mối đe dọa gián tiếp

Sự gia tăng dân số và nghèo đói chính là các mối đe dọa gián tiếp đến sự suy giảm đa dạng sinh học

Dân số của đất nước tăng lên rất nhanh chóng vào thế kỷ 20 từ 15,6 triệu người vào năm 1921 đến 54 triệu vào năm 1982, đến gần 80 triệu vào năm 2004; dân số có thể đạt đến con số 150 triệu vào năm 2050 Khi dân số của đất nước tăng nhu cầu đối với tài nguyên thiên nhiên cũng tăng theo Sự tiêu thụ không bền vững nguồn tài nguyên nước và trên đất liền khắp đất nước được thúc đẩy do nhu cầu của các thị trường tại địa phương, trong khu vực và quốc tế, tạo ra mối đe dọa to lớn và trực tiếp đối với đa dạng sinh học của Việt Nam Ngoài

ra, sự nghèo đói và yếu kém trong công tác quản lý nhà nước (thiếu hệ thống pháp luật, thiếu

sự điều hành và nguồn ngân sách) cũng là những mối đe dọa gián tiếp khác đến sự suy giảm

đa dạng sinh học ở nước ta.Việt Nam là một nước phụ thuộc vào nông nghiệp và tài nguyên thiên nhiên Trong các khu bảo tồn, 90% dân địa phương sống dựa vào nông nghiệp và khai thác rừng Đời sống của họ rất thấp, khoảng trên 50% thuộc diện đói nghèo Họ bắt buộc phải khai thác, bóc lột ruộng đất của mình, làm cho tài nguyên càng suy thoái một cách nhanh chóng hơn

*Mối đe dọa trực tiếp

Có nhiều mối đe dọa trực tiếp đến sự suy giảm đa dạng sinh học bao gồm: mất và suy thoái sinh cảnh sống, ô nhiễm môi trường, biến đổi khí hậu, sự xâm nhập của các loài ngoại

lai…nhưng sự khai thác quá mức và buôn bán động thực vật hoang dã chính là mối đe dọa nghiêm trọng nhất

Khai thác quá mức có nghĩa là khai thác đến khi số lượng của loài thấp hơn mức tối thiểu mà loài có thể phục hồi Vì thế dẫn đến sự tuyệt chủng của loài, gây suy giảm đa dạng sinh học

Các loài bị khai thác quá mức thường là những loài có giá trị kinh tế cao hoặc có giá trị sử dụng đặc biệt như giá trị về thẩm mỹ, giá trị về dinh dưỡng …Việc khai thác quá mức các nguồn tài nguyên thiên nhiên ở Việt Nam liên quan đến nhiều hoạt động trong đó có săn bắt, đánh cá, khai thác gỗ và săn bắt động vật và thu hái thực vật không bền vững Khai thác quá mức đã trở thành một mối đe dọa nghiêm trọng đối với đa dạng sinh học của Việt Nam và ngày càng mở rộng ra nhiều loài động thực vật khác trong khi đã có hàng trăm loài bị ảnh hưởng

- Khai thác và buôn bán thực vật

Khu hệ thực vật bị khai thác ở khắp nơi Quả cây, hoa, vỏ cây, rễ, nhựa, gỗ và toàn bộ cây được thu thập vì nhiều mục đích, từ làm thức ăn và thuốc cho đến làm thủ công mỹ nghệ, dệt và sản xuất đồ đạc và phục vụ việc buôn bán cây cảnh Những loài thực vật bị khai thác nhiều nhất ở Việt Nam thường là các loài có giá trị kinh tế cao như: song mây, sâm, trầm hương, các loại gỗ quý

Ngoài ra thì việc khai thác và buôn bán các loại gỗ trái phép cũng là một vấn đề nóng

ở Việt Nam Hai loài cây lá kim ở miền Bắc Việt Nam đang phải chịu sức ép ở mức độ địa phương: Bách tán Đài Loan (Taiwania cryptomerioides) và loài Bách tán vàng Việt Nam đặc hữu (Xanthocyparis vietnamensis) được mô tả vào năm 2002 Cả hai cùng có các quần thể rất nhỏ và bị đe dọa do sự xuống cấp của sinh cảnh và việc khai thác trực tiếp loại gỗ nhiều nhựa và có mùi thơm để phục vụ xây dựng, làm áo quan và đồ thủ công mỹ nghệ IUCN xếp các loài cây này vào nhóm cực kỳ nguy cấp

- Đánh bắt thủy sản quá mức

Các hình thức đánh bắt thủy sản mang tính hủy diệt như dùng chất nổ, chất độc, sốc điện, lưới mắt nhỏ dưới mức cho phép làm suy giảm đa dạng sinh học nghiêm trọng các hệ sinh thái đất ngập nước ven biển, đe dọa sự tồn tại của hơn 80% các rạn san hô ở Việt Nam,

và hủy diệt các nguồn cá giống, tôm giống trong các vùng đất ngập nước ven bờ nội địa Thậm chí ở các khu bảo tồn biển như Khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang (Khánh Hòa) là khu vực có hệ sinh thái đa dạng phong phú, được bảo vệ và cấm đánh bắt hải sản dưới mọi hình thức Tuy nhiên, vì lợi ích cá nhân, nhiều ngư dân đã khai thác trái phép hải sản ở đây, họ sử dụng cả mìn để khai thác, theo ông Eniko d’ La Mancha, chủ trung tâm lặn và văn phòng du lịch Amigos tại Nha Trang, thì họ dùng những loại mìn mà các thuyền đánh cá phi pháp thường dùng, loại mìn nổ chìm dưới nước Hay ở Vườn Quốc gia Đất mũi Cà Mau, theo ông Trần Văn Mến, Phó Ban Quản lý và bảo tồn nguồn lợi thủy sản biển: nếu trước đây những người khai thác nghêu, dùng tay cào hay te đẩy thì bây giờ họ dùng máy hút thổi nghêu vào lưới

- Săn bắn và buôn bán trái phép động vật hoang dã

Theo thống kê của các cơ quan chức năng, từ năm 1996 đến 2007, cả nước đã phát hiện, xử lý 14.757 vụ việc liên quan, tịch thu 181.670 cá thể với khối lượng 635 tấn Năm

2008 và 6 tháng đầu năm 2009, lực lượng kiểm lâm đã phát hiện, xử lý 1.946 vụ vi phạm các quy định về quản lý và bảo vệ động vật hoang dã Những địa phương, khu vực “nóng” nhất là

TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tây Ninh, Lâm Đồng, Thanh Hóa, Nghệ An, Điện Biên, Bình Phước, Hà Nội Những kẻ chuyên hoạt động săn bắt, buôn bán động vật, thực vật hoang dã quý hiếm tổ chức hoạt động rất chặt chẽ, tinh vi với đường dây quy mô ngày một lớn Gần đây nhất, qua vụ bắt giữ 25 tấn tê tê đông lạnh và vẩy tê tê vào tháng 10-2008 và vụ bắt 6,2 tấn ngà voi tại Cảng Hải Phòng cho thấy Việt Nam đang trở thành nơi trung chuyển động vật hoang dã Nơi tiêu thụ những loại động vật, thực vật hoang dã quý hiếm không ở đâu xa mà

chính trong cộng đồng dân cư chúng ta, tập trung chủ yếu ở các thành phố, thị xã với nhan nhản các cửa hàng ăn “chim trời, thú rừng”, nhiều cửa hàng bày bán hàng trăm bình rượu ngâm thú rừng các loại Có “cầu” làm việc “cung” ngày càng phát triển; làm việc ngăn chặn việc săn bắt, vận chuyển động thực vật hoang dã quý hiếm như “muối bỏ biển”, rừng ngày càng bị tàn phá, môi trường tự nhiên ngày càng xấu đi từ chính bàn tay và “dạ dày” con người.[11]

Phần lớn các thành phố và thị trấn lớn ở Việt Nam có chợ buôn bán động vật hoang dã nơi có rất nhiều loài động vật sống là đại diện của tất cả các nhóm động vật có xương sống chủ yếu,

từ tắc kè, rùa và ếch đến tê tê, hươu và linh trưởng Các quán ăn đặc sản thường xuyên phục

vụ thịt động vật hoang dã, đôi khi quảng cáo các món ăn với những bảng giá được đặt cạnh áp phích được in nhằm phục vụ mục đích giáo dục bảo tồn Những người đến ăn có thể thường xuyên xem các loài động vật bị nhốt trong chuồng (trong đó có các loài bị đe dọa toàn cầu) như cầy và rắn Cùng với các loài động vật hoang dã và thịt để tiêu thụ, những người bán hàng còn tiếp thị rất nhiều loại chim sống ở các chợ lớn nhất ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh Điều này một phần cũng là do ý thức của người dân Việt Nam như lời Anh Hoàng Mạnh Cường, một chủ trang trại nuôi thú quý hiếm tại thành phố Buôn Ma Thuột cho biết:

“Người nước ngoài rất có ý thức cái điều là có sử dụng động vật hoang dã làm thực phẩm Nhưng thói quen của Việt Nam mình thì càng hoang dã thì họ càng thích dùng làm thực phẩm.”

4 Tổng quan về phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nhận dạng loài

Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ việc nhận dạng các loài phục vụ nghiên cứu đa dạng sinh học và ngăn chặn buôn bán trái phép động vật hoang dã các nhà khoa học thuộc nhóm nghiên cứu của dự án Mã vạch sự sống quốc tế (iBOL) đã thiết lập một thư viện các loài sinh vật có nhân chuẩn dựa trên một dạng phân tích mới gọi là mã vạch ADN Công nghệ mã vạch ADN ra đời sẽ hứa hẹn một tương lai mới, nơi mà con người có thể cập nhật nhanh chóng các thông tin như tên, thuộc tính sinh học… của bất cứ loài sinh vật nào trên trái đất Phương pháp phân tích mã vạch ADN cũng sẽ là một công cụ quan trọng trong việc bảo tồn và theo dõi các loài có tác động xấu đến sức khỏe của con người cũng như lợi ích kinh tế từ chúng Hiện tại, các nhà nghiên cứu đã thu thập được mã ADN của hơn 80.000 loài Dự kiến đến năm 2015, thư viện sẽ có được danh mục ADN của khoảng năm triệu mẫu sự sống, đại diện cho 500.000 loài trên trái đất Đây chỉ là một nhóm đáng kể trong tổng số 1,7 triệu loài mà con người biết đến hiện nay Hy vọng công nghệ này sẽ thúc đẩy việc khám phá ra rất nhiều loài còn chưa được biết đến trên trái đất

Phương pháp mã vạch phân tử là một kỹ thuật dùng để xác định đặc điểm của các loài sinh vật bằng cách sử dụng một trình tự ADN ngắn từ một vị trí gen tiêu chuẩn đã được kiểm chứng Cũng giống như mô hình độc đáo của mã vạch trong nhận dạng sản phẩm, một mã vạch ADN là một mô hình duy nhất của trình tự ADN có thể sử dụng để nhận diện một thực thể sống Mã vạch ADN ngắn, khoảng 700 nucleotit, có thể được sản xuất nhanh từ hàng nghìn mẫu vật và được phân tích rõ ràng trên các phần mềm máy tính Mã vạch ADN cho phép những người không phải chuyên gia nhận dạng các loài một cách khách quan, thậm chí

từ những vật liệu nhỏ, bị hư hỏng và đã được chế biến công nghiệp

Ứng dụng công nghệ dựa trên ADN vào việc điều tra tội phạm buôn bán và tiêu thụ động vật hoang dã đã mở ra khả năng tăng cường hiệu quả thực thi pháp luật Ví dụ trong trường hợp sử dụng kính kiển vi để xác định loài được cho là Linh dương Tây Tạng từ những chiếc khăn quàng được dệt, việc xác định tới cấp độ loài có thể được thực hiện bằng cách sử dụng việc xác định kiểu ADN nơi mà kết quả không dựa vào phán đoán chủ quan của người kiểm tra

*Các bước thực hiện:

- Thu thập mẫu vật động vật hoang dã trong khu vực hoặc vùng lân cận

- Chiết xuất và tinh chế ADN từ mẫu mô hoặc vật liệu được chế biến

- Khuếch đại một khu vực cụ thể của gen lục lạp hoặc ty lạp thể bằng cách PCR và phân tích sản phẩm PCR bằng phản ứng điện li keo

- Sử dụng Blast (Basic Local Alignment Search Tool ) để nhận diện các trình tự trong

cơ sở dữ liệu

- Sử dụng các công cụ sắp xếp nhiều trình tự và xây dựng cây để phân tích các mối quan hệ phát sinh loài

* Vai trò của ADN

Bộ gen ty thể ở tế bào nhân chuẩn có 37 gen, 22 gen mã hóa ARN vận chuyển (tARN), 2 gen mã hóa ARN ribosomal (rARN) và 13 gen khác mã hóa protein chủ yếu liên quan đến quá trình hô hấp oxi hóa Số lượng gen trên hệ gen ty thể phần lớn là bất biến cho tất cả các hệ gen ty thể của các loài động vật có xương sống nhưng thứ tự của các gen có thể thay đổi Thứ tự của các vị trí trên hệ gen ty thể thì tương tự nhau trong các loài động vật có

vú nhưng có thể khác nhau giữa các bậc phân loại: ví dụ thứ tự khác nhau giữa gen ty thể của gia cầm và động vật có vú

Một lý do chính cho việc sử dụng ADN ty thể (mtADN) là không có một sự tái tổ hợp của mtADN Với tất cả các thành phần mã hóa của hệ gen ty thể mã hóa cho protein hoặc phân tử ARN liên quan đến hô hấp, người ta hi vọng rằng sẽ có một sự bảo vệ các trình tự khi bất kỳ một sự thay đổi nào ở protein hoặc phân tử ARN có thể tác động tiêu cực đến sinh vật Không giống như hạt nhân, không có lỗi xảy ra trong việc đọc enzyme tồn tại trong ty thể để sữa chữa những gốc ADN được thêm vào một cách không chính xác trong suốt quá trình sao chép Do vậy, sự tích tụ của những thay đổi cơ sở riêng lẻ trong ty thể là cao hơn gấp 5 lần so với những lỗi do sự sao chép trong hạt nhân Ngoài ra có nhiều bản sao của ADN ty thể trên 1

tế bào so với 2 bản sao của ADN hạt nhân Trong mỗi tế bào có nhiều ty thể phụ thuộc vào loại tế bào và trong mỗi ty thể có nhiều ADN ty thể Các ty thể có một lớp protein để bảo vệ các mtADN khỏi sự phân hủy Các vật liệu sinh học đã bị phân hủy cao , do đó, có khả năng tuân theo việc xác định kiểu mtADN nhiều hơn là sự cần thiết sinh ra một hồ sơ di truyền từ ADN hạt nhân khi xác định kiểu răng, xương hoặc tóc

*Vị trí gen được sử dụng trong phân loại

Các vị trí gen của sự lựa chọn cho nhận dạng pháp y các loài được dựa vào các nghiên cứu có nguồn gốc từ phân loại và cây phát sinh loài và chủ yếu được tìm thấy ở bộ gen ty thể Trong phạm vi mtADN một số trình tự gen được cho là thể hiện ít sự biến đổi trong cùng chủng loại (trong các thành viên của cùng một loài) nhưng lại thể hiện đầy đủ sự biến đổi không trong chủng loại (giữa các loài khác nhau) để cho phép ước lượng về mức độ liên quan

và số lần sai khác qua đồng hồ phân tử được hiệu chỉnh Vị trí chính được sử dụng trong các nghiên cứu về phân loại và phát sinh chủng loại cho đến gần đây là gen cytocrome b (cyt b) cái mà xuất hiện giữa hai bazo 14747 và 15887 trong mtADN của người và mã hóa 1 protein

có chiều dài 380 amino axit Vị trí cyt b đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại và pháp y, bao gồm các bộ phận cơ thể của hổ, trứng rùa, vỏ và da cá sấu, sừng tê giác, ngà voi, con công trống , mật gấu Gần đây hơn, việc sử dụng gen cytochrome c oxidase I (COI) đã tăng lên chủ yếu do sự thông qua của tổ chức mã vạch của sự sống (Barcod of life consortium- CBOL) COI được tìm thấy giữa các bazo 5904 và 7945 ở mtADN người COI ban đầu được sử dụng để nhận dạng các loài động vật không xương sống Chẳng bao lâu sau

nó đã trở thành vị trí lựa chọn trong côn trùng học pháp y để nhận dạng ấu trùng bọ cánh cứng trên xác chết Vì đây là một vị trí có thể nhận dạng những loài này, nó đã được sử dụng nhiều hơn với mục tiêu trở thành vị trí được lựa chọn cho nhận dạng tất cả các loài động vật

Các vị trí gen khác trên hệ gen ty thể cũng đã được sử dụng trong nhận dạng một số loài Chúng bao gồm các vị trí rARN 12s và 16s và họ gen NDH D- loop (Displacement- loop) được sử dụng ít trong nhận dạng các loài nhưng nhiều hơn trong nhận dạng các loài trong cùng chủng loại Bởi vì sự biến đổi lớn hơn ở các trình tự không được mã hóa, nó bây

giờ đang được sử dụng như một công cụ để nhận dạng sự có mặt của một loài đặc biệt trong hỗn hợp nhiều loài khác nhau

*Sự biến đổi trong loài và khác loài gen Cyt b và COI

Bằng cách sử dụng mô hình2 tham số Kimura (K2P- Kimura 2-parameter model), nhìn chung các tác giả nhận định rằng sự thay đổi trong cùng loài nằm trong phạm vi < 2-3% (giữa 7.93% và 0.43% với loài chim cho COI; giữa 5.7% và 1.5% với loài Stenella cho Cyt b) Khi những bất thường nảy sinh, điều này được hiểu là các loài ẩn sinh mặc dù các loài ẩn sinh này có thể được dựa vào biến đổi trong loài từ chỉ 2 cá thể

5 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

*Đối tượng nghiên cứu

Các loài động vật được nghiên cứu trong đề tài nằm trong nghị định 32/2006/ND-CP

về quản lý động vật rừng, thực vật rừng nguy cấp, quí hiếm tại Việt Nam, gồm 62 loài động vật nghiêm cấm khai thác sử dụng và 89 loài hạn chế khai thác sử dụng (xem phần Phụ lục) Xác định được trình tự gen từ Ngân hàng gen (gen bank) của : 112 loài, 106 loài có trình tự gen Cyt b và 42 loài có trình tự gen COI

- 222 trình tự gen Cytb

- 83 trình tự gen COI

*Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng phần mềm Mega để ước tính sự sai khác dựa vào khoảng cách các trình tự ADN của các loài

Tất cả các trình tự sau khi tải từ ngân hàng gen (Genbank) về sẽ được sắp xếp ở dạng matrix bằng cách sử dụng phần mềm Paup 4.0 beta 10 win Trước khi được sắp xếp thành dạng ma trận chúng sẽ được sắp xếp đúng thứ tự trong phần mềm Bioedit để có độ dài đoạn gen bằng nhau Sau khi đưa dữ liệu trình tự vào phần mềm Mega5.05 các trình tự sẽ được cắt tỉa ở vị trí có chiều dài 650 nucleotit Thành phần trình tự và mô hình thay thế cho toàn bộ bộ

dữ liệu, số lượng của nucleotit và các vị trí amino axit có thể thay đổi và sự sai lệch của cặp trình tự 2 thông số Kimura (K2P) trong phạm vi nhóm ở nhiều mức độ phân loại (trong cùng loài, giữa các loài cùng chi và giữa các loài ở các chi khác nhau trong cùng một họ) đã được tính toán trong Mega5.05 Các loài được sắp xếp vào một trong bốn loại sau dựa vào khoảng cách cặp K2P: loại I (khoảng cách trong loài lớn nhất <2%, khoảng cách giữa các loài bé nhất

<2%); loại II (khoảng cách trong loài lớn nhất = 2%, khoảng cách giữa các chủng loại bé nhất

<2%); loại III (khoảng cách trong loài lớn nhất <2% và khoảng cách giữa các loài bé nhất

£2%); loại IV (khoảng cách trong loài lớn nhất = 2% và khoảng cách giữa các loài bé nhất

£2%) Ở những loài mà chỉ có một cá thể được lấy mẫu thì các loại I, II, III và IV được bỏ qua

vì chỉ có khoảng cách giữa các loài khác nhau được ước lượng

- Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài

Hai cây phát sinh loài theo phương pháp p- distance được xây dựng cho tất cả các trình tự gen Cyt b và COI trong Mega5 để có thể hình dung được nguồn gốc phát sinh của các loài cũng như kiểm tra được liệu có loài nào bị xác định nhầm kiểu gen hay không

-Phương pháp đánh giá mức độ hiệu quả trong nhận dạng loài dựa vào khoảng cách

Bằng cách thống kê các số liệu và tính toán tỷ lệ % thông thường để đưa ra những kết quả cần thiết và đánh giá kết quả đó thông qua sự so sánh

6 Các kết quả đạt được

*Khoảng cách di truyền gen Cyt b

Bảng 1: Khoảng cách di truyền trung bình gen Cyt b

bình gen Cytb

1 Mustelidae (họ Chồn) 35.3%

Khoảng cách trung bình tối đa 43.3%

*Khoảng cách di truyền gen COI

Bảng 2: Khoảng cách di truyền trung bình gen COI

bình gen COI

20 Papilionidae (họ Bướm phượng) 31.4%

Khoảng cách trung bình tối đa 53%

Khoảng cách trung bình chung 33.6%

* So sánh khoảng cách di truyền trung bình giữa hai gen Cyt b và COI

Bảng 3: So sánh khoảng cách di truyền trung bình ở một số họ giữa kiểu gen Cyt b và

COI Khoảng cách trung bình chung 40.3%

- Nhậ

n xét:

Tron

g số

12

họ nêu trên thì: +Có

1 họ là: Accitripidae có khoảng cách di truyền trung bình bằng nhau và bằng 0% ở cả 2 kiểu gen COI

và Cyt b

+Có 5 họ (Moschidae,Sciuridae,Elapidae,Testudinidae,Geoemydidae) mà ở đó khoảng cách

di truyền trung bình theo kiểu gen Cyt b lớn hơn COI, nằm từ 14.6%- 43.3%

+Có 6 họ (Pteropodidae,Psitacidae,Sturnidae,Chelydridae,Cadinae,Crocodylidae) mà ở đó khoảng cách di truyền trung bình theo kiểu gen COI lớn hơn theo kiểu gen Cyt b, nằm từ 0.1%- 53%

+Khoảng cách di truyền trung bình lớn nhất với kiểu gen Cyt b là 43.3% ở họ Moschidae (họ Hươu xạ), với kiểu gen COI là 53% ở họ Crocodylidae (họ Cá sấu)

+ Khoảng cách di truyền trung bình cho toàn bộ các loài trong 13 họ nêu trên là: 36.5% với Cyt b và 32.5% với COI

*Khoảng cách di truyền trong loài

Khoảng cách trung bình lớn

nhất

Khoảng cách trung bình

chung

Bảng 4: Thống kê các thông số về khoảng cách trong loài theo tỷ lệ %

Kiểu gen

Các

Thông số

Tổng số loài có khoảng cách di

truyền trong loài

Số loài có k/c di truyền trong

loài từ trung bình đến cao

(>2%)

Số loài có k/c di truyền trong

loài biến đổi từ thấp đến cao

Số loài có k/c di truyền trong

loài nằm ở mức thấp (0- 2%)

*Nhận xét:

+Với cả 2 kiểu gen thì chiếm một tỷ lệ lớn vẫn là số loài có khoảng cách di truyền trong loài

ở mức thấp: 53% ở Cyt b và 64% ở COI

+ Với số loài có khoảng cách di truyền ở mức trung bình đến cao thì gen Cyt b chiếm tỷ lệ cao hơn Cyt b một chút (25% so với 18%) Tương tự về tỷ lệ như thế là số loài có khoảng cách biến thiên từ thấp đến cao

* So sánh khoảng cách di truyền trong loài giữa hai kiểu gen COI và Cyt b

Bảng 5: So sánh khoảng cách trong loài ở một số loài

trong loài gen Cyt

b

Khoảng cách trong loài gen COI Tên tiếng Việt Tên khoa học