Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào

PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO

1 ðặc ñiểm tế bào ñộng vật

1.1 Sự ñiều hòa trao ñổi chất

Quá trình trao ñổi chất của cơ thể ñược tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết ñịnh ñến sự tồn tại của cơ thể sống

Ở tế bào ñộng vật, ngoài tác ñộng của hoạt ñộng enzyme, hệ dịch quanh tế bào, chúng còn bị tác ñộng rất mạnh bởi hệ thần kinh Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú

từ bên ngoài và bên trong tế bào, ñiều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao ñổi chất

ở tế bào Sự rối loạn quá trình trao ñổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ ñến sự ñiều khiển của hệ thần kinh Do ñó, việc trao ñổi chất của tế bào ñộng vật ở cơ thể sống là hết sức phức tạp

Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao ñổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các ñặc ñiểm của một tế bào ñộc lập, giống như quá trình trao ñổi chất ở tế bào vi sinh vật Khi ñó, tế bào ñộng vật trở thành một thực thể ñộc lập không tuân theo các qui luật của mô

và qui luật của cơ thể ña bào

Việc nuôi cấy tế bào ñộng vật ñược thực hiện trên cơ sở ñiều khiển quá trình tổng hợp enzyme và ñiều khiển các hoạt ñộng của enzyme Sự hoạt ñộng của enzyme cũng như quá trình tổng hợp enzyme sẽ quyết ñịnh khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao ñổi chất của tế bào cũng như khả năng phân chia tế bào

Hai vấn ñề mang tính chất quyết ñịnh trong việc ñiều khiển quá trình tổng hợp và hoạt ñộng của tế bào:

Bản chất tự nhiên – nguồn gốc – của tế bào giúp ñịnh hướng sản phẩm cuối Yếu tố môi trường quyết ñịnh tính trạng riêng biệt của tế bào giúp tính trạng

ñó ñược biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy

Mọi tác ñộng của môi trường ñến tế bào nuôi cấy in vitro ñều là những tác ñộng trực tiếp, xảy ra rất nhanh và rất mãnh liệt; do ñó khi tiến hành kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần tạo

ra sự hài hòa trong mọi tác ñộng ñến sự trao ñổi chất của tế bào ñược nuôi cấy

1.2 Tính chất cơ học yếu

Tế bào ñộng vật không có thành tế bào, chúng chỉ ñược bao bọc bởi một màng tế bào Màng tế bào như một thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với tế bào trong mô Các tế bào ñộng vật trong mô liên kết với nhau qua gian bào Sự liên kết các tế bào trong mô này thường ở những vị trí ñặc biệt Trong những ñiểm kết nối chứa ñầy các phân tử protein có tên khoa học là glycoprotein Các protein này kết nối với sợi actin trong tế bào chất

Kích thước tế bào ñộng vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10µm, lại không có vách tế bào nên có tính chất cơ học yếu Do ñó, nên khi thiết kế các thiết bị lên men hay trong quá trình vận hành nuôi cấy cần phải sử dụng máy mắc hay cánh khuấy có tốc ñộ rất thấp ñể tránh sự phá vỡ tế bào

1.3 Khả năng phân chia và tốc ñộ tăng trưởng chậm

Ở ñộng vật, một chu trình tế bào thường kéo dài khoảng 20 – 70 giờ Thời gian phân chia của tế bào có liên quan ñến sự ñấu tranh sinh tồn và sự bảo toàn tính di truyền của một loài; do ñó nó mang tính chất loài

Các yếu tố môi trường bên ngoài thường tác ñộng gián tiếp ñến tế bào ñộng vật Sự phát triển của tế bào trong các mô của ñộng vật thường xảy ra một cách hài hòa giữa các mô trong toàn bộ cơ thể, giúp tạo ra hình thái riêng biệt cho từng loài và từng cá thể Nếu trong một ñiều kiện nào ñó, một loại tế bào trong cơ thể ña bào lại tăng số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý

Ngoài khả năng tăng chậm về số lượng tế bào, sự phát triển của tế bào ñộng vật xảy ra cũng rất chậm, gây khó khăn cho việc nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro

1.4 Nhân ñôi trong quá trình phát triển cần giá ñỡ

Trong cơ thể người và ñộng vật tồn tại hai loại tế bào:

Loại tế bào tự do: tế bào máu, tế bào sinh dục

Loại tế bào ở dạng liên kết trong các mô

Tế bào máu là loại tế bào hoàn toàn tự do, tồn tại trong hệ tuần hoàn Nhờ trạng thái

tự do này mà tế bào máu có chức năng rất riêng biệt

Tế bào sinh dục thuộc loại tế bào bán tự do Có nghĩa chỉ tồn tại tự do ở trạng thái sinh lý nhất ñịnh

Các tế bào còn lại tồn tại trong mô, chúng chỉ có thể tăng số lượng và phát triển trên một giá ñỡ nào ñó

1.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao ñổi chất của tế bào

Các nhà khoa học gọi cơ chế này là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (feed

back) Thực ra, bất kỳ tế bào sinh vật nào ñều cũng biểu hiện cơ chế này ðiểm khác biệt của

tế bào ñộng vật là ở chỗ quá trình tổng hợp thừa ít xảy ra và hiện tượng các sản phẩm trao ñổi chất từ trong tế bào thoát ra khỏi tế bào thường rất chậm

1.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ

Xét về cấu trúc tế bào, tế bào ñộng vật ñược xem như một loại tế bào trần tự nhiên Chúng ñược bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do ñó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái

tự do, khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (thông tin di truyền từ virus…) hoặc khi cho những tế bào ñộng vật có thông tin di truyền khác nhau (nhân khác nhau) ở gần nhau, sẽ xảy

ra hiện tượng trao ñổi vật chất di truyền Hiện tượng này tạo ra các tế bào lai (hybridoma)

Hiện tượng lai này có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo ra dòng lai mới

1.7 Khả năng bảo quản trong ñiều kiện nhân tạo

Tế bào ñộng vật cần phải ñược bảo quản trong những ñiều kiện hết sức ñặc biệt mới

có thể giữ ñược những ñặc tính riêng của nó

Người ta thường sử dụng nitrogen lỏng hoặc bơm những chất phụ gia vào các dòng tế bào ñộng vật và bảo quản chúng ở nhiệt ñộ - 70oC Bằng biện pháp này, tế bào ñộng vật vẫn duy trì ñược ñặc tính của chúng trong thời gian rất dài Khi sử dụng, tế bào ñộng vật ñược

tiến hành giải ñông và ñược hoạt hóa ñể phục hồi lại khả năng tăn trưởng và phân chia như trước khi ñem bảo quản

Ngoài ra, tế bào ñộng vật rất kém thích nghi với ñiều kiện môi trường, rất nhạy cảm với kim loại Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone

2 Tế bào mầm (Stem Cell)

Trong cơ thể ñộng vật có một loại tế bào luôn luôn sẵn sàng bù ñắp những mất mát, tổn thương bất kỳ nào ñó của cơ thể: sự tạo máu, liền cơ, xương, da, mọc tóc,… nhưng trước ñây người ta không chú ý ñến tiềm năng và vai trò của tế bào này

Tế bào mầm là những tế bào có khả năng phân chia ở những giai ñoạn không xác ñịnh trong quá trình nuôi cấy và có thể biệt hóa tạo ra những tế bào chuyên biệt

ðịnh nghĩa tương ñối về tế bào mầm như sau: tế bào mầm là những tế bào có khả

năng cho sự tái tạo kéo dài vô hạn, và vì vậy, có thể giúp tạo ra ít nhất là một kiểu tế bào hậu duệ có khả năng biệt hóa cao

Thông thường còn có một loại tế bào trung gian giữa tế bào mầm và tế bào ñã biệt hóa (tế bào ñích):

Một số ñặc ñiểm sinh học của tế bào mầm

2 1 ðặc ñiểm chức năng

Luôn phân chia ñể tạo ra tế bào mới

Là nguồn gốc của sự gia tăng số lượng tế bào trong cơ thể

Có khả năng tạo nhiều kiểu tế bào ñích khác nhau

Có cơ chế ñiều hòa gen ñặc biệt

Dễ dàng thích nghi

2.2 ðặc ñiểm tiến hóa

Các nhà khoa học cho rằng tế bào mầm là nguồn gốc của sự tiến hóa, tuy nhiên người

ta vẫn chưa xác ñịnh ñược thời ñiểm xuất hiện của các tế bào mầm trong các tổ chức sinh học, cũng như những yếu tố ñiều khiển sự khác biệt ñó

2.3 Hai phương thức tái tạo và biệt hóa của tế bào mầm

Sự tái tạo trực tiếp xảy ra bằng cách phân chia bất ñối xứng: một tế bào gốc ra hai tế bào con, trong hai tế bào con ñó sẽ có một tế bào gốc và một tế bào tiền biệt hóa, và chỉ có tế bào tiền biệt hóa mới tiếp tục phân chia hoặc biệt hóa tiếp theo

Cơ chế ñiều hòa mức ñộ cao:

o Tế bào mầm tạo ra hai tế bào con ñều có khả năng tiền biệt hóa như nhau

o Các tế bào tiền biệt hóa ñều có khả năng biệt khóa theo các con ñường khác nhau và ở nhiều giai ñoạn khác nhau

3 Sinh học của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy

3.1 Môi trường nuôi cấy

Trạng thái của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy tương tự như một kiểu chức năng sinh lý thường xuyên tồn tại trong cơ thể ñộng vật Trong quá trình nuôi cấy, khi có sự biến ñổi ñiều kiện môi trường thì ñặc tính của tế bào sẽ thay ñổi theo Những tế bào không

tăng sinh bình thường in vivo (trong cơ thể) có thể tăng sinh trong in vitro; hơn nữa trong

ñiều kiện in vivo, những tương tác giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với chất gian bào giảm xuống vì chúng ñồng dạng với nhau và không có ñược một cấu trúc 3 chiều, ñồng thời, hormone và các chất dinh dưỡng cung cấp dễ bị biến ñổi Lý do này khiến các nhà khoa học tập trung nghiên cứu xây dựng một môi trường phù hợp cho sự tăng trưởng, chuyển ñộng ñến

vị trí cơ chất, tăng sinh của những tế bào không chuyên biệt hơn là môi trường cần thiết cho

sự biểu hiện các chứ năng khác nhau của tế bào Việc sử dụng môi trường thích hơp, cung cấp dưỡng chất, hormone và cơ chất là những vấn ñề cơ bản cho sự biểu hiện những chức năng chuyên biệt của tế bào Trước khi duy trì những ñiều kiện chuyên biệt như vậy, cần phải kiểm tra trong những trường hợp có thể xảy ra khi tiến hành nuôi cấy sơ khởi cũng như nuôi cấy dòng tế bào sau ñó

3.2 Khởi ñầu việc nuôi cấy (nuôi cấy sơ khởi)

Việc nuôi cấy ñược bắt ñầu tiến hành khi tế bào ñược tách ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp Cho dù tế bào ñược tách ra bằng bất kỳ phương pháp vào thì ñây vẫn là giai ñoạn chọn lọc ñầu tiên của quá trình nuôi cấy ñể cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tương ñối ñồng dạng

Bảng 1: Những yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của dòng tế bào

Cô lập

Tách tế bào bằng phương pháp cơ học

Tách tế bào bằng enzyme

Nuôi cấy sơ

khởi

Tăng trưởng nhanh

Bám vào cơ chất

và tăng kích thước

Cấy chuyền

Nhạy cảm với trepsin

Sự hạn chế dưỡng chất, hormone, cơ chất

ðược nhân lên

như một dòng

Tốc ñộ tăng trưởng tương ñối của các tế bào khác nhau

tế bào Ảnh hưởng của mật ñộ tế bào lên sự

vượt trội của các kiểu hình bình thường hay kiểu hình biến ñổi

Trong giai ñoạn nuôi cấy sơ khởi (primary culture) (giai ñoạn từ khi tế bào ñược tách

ra khỏi mô và ñược nuôi cấy in vitro), sự chọn lọc dựa vào ñặc tính của tế bào như tế bào có thể ñược tách ra khỏi mẫu cấy ban ñầu một cách dễ dàng ðối với những tế bào phân tán, chỉ

có những tế bào nào còn sống sau khi tách rời khỏi nhau và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại ñược trong dịch huyền phù thì sẽ trở thành ñối tượng cơ bản của quá trình nuôi cấy sơ khởi

Nếu giai ñoạn nuôi cấy sơ khởi kéo dài ñược hơn vài giờ ñồng hồ thì bước chọn lọc tiếp theo sẽ xảy ra Những tế bào có khả năng tăng sinh sẽ tăng lên, một vài loại tế bào sẽ sống nhưng không tăng sinh, một số khác sẽ không sống ñược trong ñiều kiện nuôi cấy này

Vì lý do này, sự phân bố của các loai tế bào sẽ tiếp tục thay ñổi cho ñến khi bề mặt của cơ chất hoàn toàn ñược bao phủ bởi tế bào (trong trường hợp tế bào nuôi cấy tạo thành từng lớp ñơn) Khi ñó, tỷ lệ tế bào nhạy cảm với mật ñộ tới hạn sẽ từ từ giảm xuống, còn tỷ lệ những

tế bào không nhạy cảm với mật ñộ tới hạn sẽ tăng lên Việc giữa cho mật ñộ tế bào thấp, ví

dụ như cấy chuyền thường xuyên, sẽ giúp duy trì kiểu hình bình thường của tế bào trong quá trình nuôi cấy như trường hợp nguyên bào sợi của chuột, và những tế bào biến ñổi tự phát có khuynh hướng tăng trưởng mạnh khi mật ñộ tế bào cao (Tadaro và Green, 1963; Brouty – Boyé và cộng sự, 1979)

Một vài khía cạnh của các chức năng chuyên biệt của tế bào có thể có biểu hiện mạnh hơn trong giai ñoạn nuôi cấy sơ khởi, ñặc biệt là khi tất cả các bề mặt của cơ chất ñều ñược tế bào bám vào và các tế bào tạo ra môi quan hệ gần với nhau Tế bào thu ñược trong giai ñoạn

này ñược gọi là tế bào sơ khởi (primary cell) Các tế bào sơ khởi không ñồng nhất với nhau

do chúng là các thế hệ con cháu của nhiều loại tế bào ban ñầu khác nhau Ở giai ñoạn này, tế bào nuôi cấy có hình thái gần giống với mô cha mẹ nhất

3.3 Sự phát triển của dòng tế bào

Sau lần cấy chuyền ñầu tiên các tế bào sơ khởi ñược thu nhận ổn ñịnh và trở thành

dòng tế bào (cell line), lúc này tế bào có thể ñược nhân lên và cấy chuyền vài lần Qua mỗi

lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ bị phân tán ðây là ñiểm nổi bật nhất sau lần cấy chuyền ñầu tiên khi có sự khác nhau về khả năng tăng sinh cùng với khả năng biến ñổi ñể chịu ñựng ñược những tác ñộng của trypsin và sự cấy chuyền tế bào

Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và sự tiến triển về hình thái, nhưng lần cấy chuyền thứ ba trở nên ổn ñịnh hơn, ñiển hình là tế bào có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ Những tế bào này thường có nguồn gốc từ trung mô, xuất phát từ những mô liên kết với

nguyên bào sợi và các yếu tố mạch Hiện tượng ựược biết ựến là sự tăng trưởng mạnh của nguyên bào sợi và trở thành những dòng tế bào hữu dụng vắ dụ như W138 Ờ nguyên bào sợi của phôi phổi người, BHK21 Ờ nguyên bào sợi của thận chuột ựồng con và có lẽ nổi bật hơn hết là tế bào L Ờ nguyên bào sợi dưới dạng da ựược xử lý với methylcholanthrene đó là một trong những thách thức chủ yếu của lĩnh vực nuôi cấy mô từ khi lĩnh vực này mới ựược khởi ựầu: làm cách nào ựể ngăn cản sự tăng trưởng quá mức của những tế bào yếu hoặc sự tăng trưởng quá chậm của những tế bào như tế bào nhu mô gan hoặc những tế bào biểu bì hóa sừng Nguyên nhân là do ựiều kiện môi trường không phù hợp và vấn ựề ựáng chú ý hiện nay

là xây dựng ựược môi trường và chọn lọc ựược cơ chất thắch hợp ựể có thể duy trì ựược nhiều dòng tế bào chuyên biệt

3.4 Sự phát triển của những dòng tế bào liên tục

Hầu hết các dòng tế bào ựều có thể sinh sản theo một kiểu không ựổi trong một số thế

hệ giới hạn, ngoài ra chúng có thể chết hoặc chuyển thành dòng tế bào liên tục (continuous

cell line) đó là một số dòng tế bào có khả năng thắch ưng với môi trường nuôi cấy, giữa

ựược khả năng phân chia tốt và có thể cấy chuyền vĩnh viễn Khả năng dòng tế bào tăng trưởng liên tục có lẽ phản ánh sự thay ựổi kiểu di truyền cho phép sự chọn lọc xảy ra sau ựó Nguyên bào sợi của người có tắnh ưu thế, có số lượng bội thể không bị thay ựổi trong suốt thời gian sống của chúng và không tạo thành dòng tế bào liên tục, trong khi ựó các nguyên bào sợi của chuột và các tế bào ựược tách ra từ các khối u của người và ựộng vật thường bị thay ựồi số lượng bội thể trong quá trình nuôi cấy và trở thành dòng tế bào liên tục với tần số cao Những biến ựổi trong quá trình nuôi cấy làm tăng sự biến ựổi dòng tế bào thành dòng tế bào liên tục ựược gọi là Ộsự biến ựổi in vitroỢ và có thể tự xảy ra hoặc do sự cảm ứng của hóa chất và virus

Các dòng tế bào liên tục thường có số lượng bội thể thay ựổi và số bội thể ở giữa mức nhị bội và tứ bội Cũng chưa rõ ràng hoặc những tế bào có khả năng trở thành các dòng tế bào liên tục hiện diện sẵn trong mô nuôi cấy với số lượng rất nhỏ hoặc sau ựó những tế bào này ựược tạo ra do sự biến ựổi của một hay nhiều tế bào Lý do thứ hai có khả năng xảy ra cao hơn, do các dòng tế bào liên tục thường xuất hiện rất trễ trong quá trình nuôi cấy, sau giai ựoạn tăng trưởng mạnh của các tế bào có trước Tuy nhiên, khả năng còn lại có thể là do có một quần thể tế bào thứ cấp có khuynh hướng biến ựổi không giống với các tế bào còn lại

Thuật ngữ Ộbiến ựổiỢ (transformation) ựược sử dụng cho quá trình hình thành dòng tế

bào liên tục bởi vì các tế bào nuôi cấy phải trải qua những sự biến ựổi về hình thái và vận ựộng Sự hình thành dòng tế bào liên tục thường diễn ra cùng với sự gia tăng phát sinh các khối u Một số dòng tế bào liên tục hình thành cùng những biến ựổi theo các hướng không tốt như giảm nhu cầu về huyết thanh, giảm mật ựộ giới hạn của sự tăng trưởng, tăng trưởng trong môi trường bán lỏng, và bộ nhiễm sắc thể có số lượng bội thể biến ựổiẦ Những thay ựổi về hình thái và bản chất tương tự có thể quan sát thấy ở các tế bào biến ựổi do sự cảm ứng của hóa chất hoặc virus

Nhiều tế bào bình thường không thể biến ựổi thành dòng tế bào liên tục Nguyên bào sợi của người có số lượng nhiễm sắc thể ổn ựịnh trong suốt ựời sống cảu nó và khi gặp một biến ựổi lớn nào ựó thì sẽ ngừng phân chia, mặc dù vẫn có thể tiếp tục sống thêm 18 tháng

Tế bào thần kinh ựệm của người và nguyên bào sợi của gà con cũng có ựặc ựiểm tương tự

như vậy Mặt khác, tế bào biểu bì sẽ từ từ tăng thêm thời gian sống nếu như kỹ thuật nuôi cấy ựược cải tiến và còn có thể tăng khả năng tăng trưởng liên tục điều này có lẽ liên quan ựến khả năng tự ựổi mới của mô in vitro Việc nuôi cấy liên tục các nguyên bào bạch huyết cũng ựược tiến hành, mặc dù trong trường hợp này có thể sử dụng virus Epstein Barr ựể cảm ứng

sự biến ựổi

Có thể ựiều kiện mở ựường cho sự phát triển của một dòng tế bào liên tục là sự thay ựổi kiểu gen vốn có của tế bào, vì vậy không có gì ngạc nhiên khi kiểu gen trong dòng tế bào liên tục khôn ổn ựịnh

Bảng 2: Những ựặc tắnh của dòng tế bào giới hạn và dòng tế bào liên tục

Dòng tế bào giới hạn Dòng tế bào liên tục

Thuận

lợi

Kiểu gen và kiểu hình ựiển hình gần

với loại in vivo

Thường có số bội thể ổn ựịnh

Tăng trưởng nhanh

Thời gian sống không bị hạn chế

Dễ nhân dòng

Có thể nhân lên trong dịch huyền phù

Tế bào chắc

đòi hỏi môi trường ựơn giản

đòi hỏi lượng huyết thanh thấp

Bất lợi

Thời gian sống bị hạn chế

Tăng trưởng chậm

Hiệu quả bám trên cơ chất thấp

Kiểu gen không ổn ựịnh

Có một sự khác biệt quan trọng giữa phản phân hóa, mất khả năng thắch nghi và sự chọn lọc

Ớ Sự phản phân hóa ựược cho là bản chất chuyên biệt của các tế bào ựã phân hóa bị mất

ựi và không thể ựảo ngược ựược, vắ dụ như tế bào gan sẽ mất enzyme của nó

(arginase, aminotransferase,Ầ), không thể dự trữ glycogen hoặc tạo ra protein huyết

thanh, và những ựặc tắnh này không thể ựược cảm ứng trở lại một khi ựã bị mất ựi

Ớ Sự mất khả năng thắch nghi là sự tổng hợp các sản phẩm chuyên biệt hoặc một chức năng chuyên biệt dưới sự ựiều hòa của những hormone (hormone: tương tác giữa tế bào với tế bào, tương tác giữa tế bào và chất gian bào,Ầ) có thể ựược tái cảm ứng khi ựiều kiện nuôi cấy thắch hợp; vắ dụ như cảm ứng enzyme tyrosine aminotransferase trong gan chuột bình thường ựòi hỏi phải có hormone (insulin, hydrocortisone) và sự

tương tác chắnh xác của các chất cơ bản, khi ựiều kiện nuôi cấy thắch hợp các chức năng của tế bào ựã phân hóa có thể ựược biểu hiện ở một số dòng tế bào khác

Ớ Sự phản phân hóa là sự mất ựi chức năng chuyên biệt ựược xem như là một sự giải thắch không hoàn toàn chắnh xác

để ựiều kiện cảm ứng chắnh xác có hiệu lực, cần phải có ựược những tế bào thắch hợp Trong những thắ nghiệm nuôi cấy tế bào gan trước ựây, sự biểu hiện các ựặc tắnh của tế bào gan không xảy ra, phần nào là do sự tăng trưởng quá mức của các nguyên bào sợi của mô liên kết hoặc nội mô của mạch máu hoặc các thể xoang Bằng cách sử dụng kỹ thuật tách tế bào

và ựiều kiện nuôi cấy thắch hợp các tế bào gan có thể ựược chọn lọc một cách phù hợp hơn Tương tự, các tế bào biểu bì có thể tăng trưởng nhờ sử dụng phương pháp lớp nuôi hoặc môi trường chọn lọc phù hợp

4 Nuôi cấy tế bào ựộng vật

4.1 điều kiện nuôi cấy

4.1.1 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy

Máy ựo mật ựộ quang

Bơm chân không

Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh Nồi hấp vô trùng môi trường nuôi cấy

pH kế

Cân phân tắch Máy cất nước hai lần

Tủ cấy vô trùng

4.1.1.2 Dụng cụ

Hộp plastic nuôi cấy loại giếng

Bình nuôi cấy

đĩa petri plastic

Hộp plastic nuôi cấy hình chữ nhật

Bình nuôi cấy bằng thủy tinh

Ống nghiệm có nắp ựậy Ống làm lạnh + hộp ựựng

Dụng cụ thủy tinh ựể pha môi trường Màng lọc ựã khử trùng

4.1.2 Môi trường nuôi cấy

Từ khi khám phá ra các tế bào từ các mô có thể nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học cố gắng tìm ra những môi trường xác ựịnh từ môi trường cơ bản ựơn giản của Eagle (1955; 1959)

ựể duy trì sự tăng trưởng liên tục của tế bào đó là những môi trường có thành phần phức tạp hơn như môi trường 199 của Morgan, môi trường CMRL 1066 của Parker Mặc dù hầu hết các môi trường hiện nay ựã ựược xác ựịnh thành phần nhưng chúng vẫn cần phải bổ sung 5 Ờ 20% huyết thanh Người ta muốn không lệ thuộc vào huyết thanh trong quá trình nuôi cấy tế bào nên ựã xây dựng những môi trường phức tạp hơn ựể thay thế cho huyết thanh như trong môi trường NCTC 109, WaymouthỖs MB, HamỖs F12, Birch & Pirt, MCDB

Một phương pháp ựể tạo ra môi trường mới là bắt ựầu từ một môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường HamỖs F12 hoặc môi trường 199 có bổ sung huyết thanh với

nồng ñộ cao (20%), cố gắng từ từ giảm nồng ñộ huyết thanh bằng cách tăng nồng ñộ các chất

ñã có trong môi trường và thêm vào những chất mới ðây là một phương pháp khó, nhưng kết quả là tạo ra ñược những mội trường khác nhau ñể nuôi cấy tế bào cơ của người và các loại tế bào khác mà không cần huyết thanh hoặc chỉ cần ñến huyết thanh với nồng ñộ thấp

Bảng 3: Môi trường cơ bản ñơn giản của Eagle’MEM (1956, 1959)

D – panthothenate calcium 1 L – methionine 50

Acid folic 0,4 L Ờ proline 50

4.1.2.1 Các yếu tố vật lý tác ựộng ựến môi trường

a pH: hầu hết các dòng tế bào tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4 độ pH tối thắch ựối với

mỗi dòng tế bào sẽ khác nhau Một số dòng tế bào như nguyên bào sợi tăng trưởng tốt nhất ở

pH 7,4 Ờ 7,7 và những dòng tế bào biến ựổi sẽ tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,2 Ờ 7,4 (Eagle, 1973) Theo Eisinger và cộng sự (1979), tế bào biểu bì có thể sống ở pH 5,5 Sự thay ựổi pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn ựến sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào

đánh giá pH môi trường thông qua ựỏ phenol thường mang tắnh chủ quan, do ựó cần

phải làm một thang chuẩn mới với muối cân bằng (Balanced Salt Solution Ờ BBS) và ựỏ

phenol với nồng ựộ chắnh xác

b đệm: môi trường nuôi cấy cần phải có dung dịch ựệm trong hai trường hợp:

♣ Khi mở ựĩa nuôi cấy tế bào, CO2 khắ quyển sẽ làm tăng pH

♣ Lượng CO2 và acid lactic ựược sinh ra quá mức từ các dòng tế bào biến ựổi (khi mật

ựộ tế bào cao) làm pH môi trường giảm

Dung dịch ựệm bổ sung vào môi trường giúp ổn ựịnh ựộ pH trong những trường hợp sau:

♠ Một số dòng tế bào ựòi hỏi phải có CO2 dạng khắ, ựặc biệt là khi mật ựộ tế bào thấp Dung dịch ựệm ngăn cản sự thất thoát CO2 và từ môi trường nuôi cấy

♠ Khi không ựậy chặt nắp bình nuôi cấy (nắp bình ựược cuốn bằng giấy nhôm) hoặc sử dụng những bình nuôi cấy mà CO2 có thể xuyên qua nắp bình vào môi trường nuôi cấy thì dung dịch ựệm sẽ thúc ựẩy sự giải phóng CO2

♠ Dung dịch ựệm thường ựược sử dụng hơn các dung dịch ựệm khác, mặc dù khả năng ựệm tương ựối yếu ở pH sinh lý, bởi vì nó ắt ựộc với mẫu nuôi cấy, giá thành

thấp và thành phần khoáng thắch hợp với thành phần môi trường HEPES (Hydroxy Ờ

Ethyl Ờ Piperazine Ờ Ethane Ờ Sulfonic Acid) có tác dụng ựệm mạnh hơn ở pH 7,2 Ờ

7,6 và nó thường ựược sử dụng vớ nồng ựộ 10 hoặc 20mM Khi HEPES ựược sử dụng với CO2 ngoại sinh thì nồng ựộ của HEPES phải tăng lên gấp 2 lần so với ựệm

thông thường

c Áp suất thẩm thấu

Hầu hết các tế bào nuôi cấy ñều có thể chịu ñược biên ñộ áp suất thẩm thấu tương ñối rộng Áp suất thẩm thấu thích hợp cho sự tăng trưởng của tế bào những loài ñộng vật khác nhau sẽ khác nhau Trong trường hợp nuôi cấy tế bào trong môi trường nhược trương thì nên nuôi trong ñĩa petri ñể cho có sự thoát bớt hơi nước trong quá trình nuôi

Việc ño áp suất thẩm thấu rất cần thiết trong quá trình pha môi trường ñể tránh không xảy ra sai sót trong lúc cân hóa chất và pha loãng

d Nhiệt ñộ

Ngoại trừ những ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào, nhiệt ñộ còn ảnh hưởng ñến pH của môi trường: nhiệt ñộ thấp sẽ làm tăng sự hòa tan CO2 vào môi trường, do

sự thay ñổi khả năng ion hóa và pK2 của dung dịch ñệm

e ðộ nhớt của môi trường

ðộ nhớt của môi trường chủ yếu bị ảnh hưởng bởi thành phần của huyết thanh, và trong hầu hết các trường hợp, sự thay ñổi ñộ nhớt môi trường sẽ ảnh hưởng trên sự tăng trưởng của tế bào Nếu huyền phù tế bào bị lay ñộng khi ñược khuấy hoặc khi tế bào tách khỏi nhau sau khi ñược trypsin hóa mà có tế bào bị tổn thương thì số lượng tế bị tổn thương

sẽ giảm xuống khi tăng ñộ nhớt môi trường với carboxy methyl cellulose hoặc polyvinyl pyrrolidone

f Sức căng bề mặt và sự tạo bọt

Sức căng bề mặt của môi trường có thể ñược lợi dụng ñể cho mẫu cấy sơ khởi bám vào bề mặt cơ chất nhưng hiếm khi thực hiện ñược Trong huyền phù tế bào, nếu 5% CO2 trong không khí ñược sục vào môi trường có huyết thanh thì có thể sẽ tạo ra bọt Silicon ñược

bổ sung vào môi trường ñể chống tạo bọt do làm giảm sức căng bề mặt

Tốc ñộ biến tính protein có thể tăng lên, và mức ñộ nhiễm cũng gia tăng nếu như bọt khí chạm vào cổ bình nuôi cấy

4.1.2.2 Thành phần môi trường

a Dung dịch muối cân bằng

Dung dịch muối cân bằng (Balanced Salt Solution – BBS) là một hỗn hợp muôi vô cơ,

trong ñó thường có bicarbonate sodium và glucose, mặc dù khi sử dụng người ta thường bò bớt bicarbonate và glucose ðệm HEPES (5 – 20mM) có thể ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy nếu cần thiết và NaCl với một lượng tương ñương có thể ñược bỏ ñi ñể duy trì áp suất thẩm thấu chính xác của môi trường

BBS ñược sử dụng như một dung dịch pha loãng những môi trường phức tạp, môi trường dùng ñể rửa mẫu, môi trường phân chia hoặc dùng trong những mục ñích khác nhau

và không cần ñến một môi trường nhược trương không nhất thiết phải có ñầy ñủ các khoáng chất

Sự chọn lựa dung dịch muối cân bằng phụ thuộc vào:

♥ Áp lực CO2

♥ Mục ñích sử dụng: tách các tế bào từ mô hoặc trải các tế bào thành lớp ñơn

♥ Sử dụng trong các huyền phù tế bào có các tế bào chỉ có thể tăng trưởng khi bám vào

Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không ñược không ñược tổng hợp

trong cơ thể nên cần bổ sung từ môi trường nuôi cấy Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay ñổi khác nhau tùy theo dòng tế bào Nồng ñộ của amino acid thường hạn chế mật ñộ tối ña của các tế bào và sự cân bằng amino acid sẽ ảnh hưởng ñến sức sống và tốc ñộ tăng trưởng của tế bào Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào và chỉ một dòng tế bào có thể sử dụng ñược glutamate Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng glutamate ñược sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon

Vitamin: khi tăng thành phần môi trường lên (mục ñích ñể giảm hàm lượng huyết thanh

xuống) thì danh sách các vitamin trong môi trường cũng phải tăng theo Khi mật ñộ tế bào trong môi trường nuôi cấy thấp (trong giai ñoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng vitamin cho dù trong môi trường ñã có sự hiện diện của huyết thanh Sự hạn chết về vitamin

có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc ñộ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật ñộ tế bào

Muối: các loại muối chủ yếu là là thành phần chính tạo ra áp suất của môi trường Trong

huyền phù tế bào, lượng thường ñược giảm xuống ñể hạn chế sự kết cụm của tế bào Nồng

ñộ ñược xác ñịnh bằng nồng ñộ CO2 ở dạng khí

Glucose: ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñể cung cấp năng lượng Glucose ñược

chuyển hóa chủ yếu bởi chu trình ñường phân (glycoside) tạo ra acid lactic ñể ñi qua chu trình Krebs giải phóng CO2 Trong in vitro, chu trình Krebs hoạt ñộng không trọn vẹn, carbon trong acid lactic ña số từ glutamine, chỉ một phần nhỏ từ glucose ðiều này giải thích cho nhu cầu glutamine và glutamate của tế bào nuôi cấy

Dung dịch ñệm: khi torng môi trường có dung dịch muôi cân bằng thì khả năng ñệm của

dung dịch ñệm bị hạn chế, ñó là do sự hiện diện của phospahte Trong những môi trường ñòi hỏi cần phải có dun dịch ñệm thì lượng phải tương ñương với lượng CO2 ở dạng khí khi bình nuôi cấy mở nắp

Khoáng chất: cũng như một vài loại vitamin, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào

ñược cung cấp bởi huyết thanh Việc bổ sung các chất nay vào môi trường nói chung không cần thiết làm, trừ khi có sự giảm lượng huyết thanh trong môi trường Trong môi trường có

hàm lượng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc ñó cần phải bổ sung sắt, ñồng, kẽm, selenium và các nguyên tố dạng vết khác vào môi trường nuôi cấy

Các chất hữu cơ khác: các hợp chất khác nhau như nucleoside, các chất trung gian của chu

trình Krebs, pyruvate và lipid cũng có mặt trong các môi trường nuôi cấy phức tạp Những hợp chất này cần thiết khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy Các chất này

có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng chuyên biệt

c Huyết thanh

Huyết thanh ñược sử dụng hầu hết trong các môi trường nuôi cấy mô là huyết thanh

bê, huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người Huyết thanh bê thường ñược

sử dụng nhiều nhất, kế ñến là huyết thanh bò (tùy theo nhu cầu của dòng tế bào) và huyết thanh người ñược sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào người

Mặc dù hầu hết các dòng tế bào ñều cần có huyết thanh trong môi trường nuôi cấy, nhưng hiện nay người ta thấy cũng có những dòng tế bào có thể ñược duy trì và tăng sinh trong môi trường không có huyết thanh Các chủng tế bào liên tục (continuous cell) như L929

và tế bào Hela là những chủng ñầu tiên ñược nuôi cấy và tăng trưởng trong môi trường không

có huyết thanh Tuy nhiên, ở phòng thí nghiệm Ham và một số phòng thí nghiệm khác (Carney) ñã chứng minh rằng có thể giảm lượng huyết thanh hoặc bỏ hẳn mà không ảnh hưởng ñến tế bào nếu như các chất khoáng và hormone bổ sung vào môi trường thích hợp với dòng tế bào ñược nghiên cứu

Protein: mặc dù protein là thành phần chính trong huyết thanh nhưng vai trò của một

số loại protein vẫn còn chưa ñược chứng minh rõ ràng: một số loại protein có lẽ có vai trò chuyên chở các chất khoáng, acid béo, hormone hoặc bản thân chúng cũng là hormone Các loại protein hữu dụng là albumin và globulin Fibronectin (globulin không tan) ñiều khiển sự kết hợp α 2-macroglobulin hạn chế hoạt ñộng của trypsin Fetuin trong huyết thanh bò làm tăng tính bám của tế bào và transferrin liên kết với sắt làm giảm ñộc tính của sắt ñể phù hợp với nhu cầu của tế bào Có thể có những loại protein khác chưa biết ñược ñặc tính cũng cần thiết cho khả năng bám và tăng trưởng của tế bào

Polypeptide: những huyết thanh có dạng ñóng cục tự nhiên sẽ kích thích sự tăng sinh

của tế bào nhiều hơn là những huyết thanh ở dạng khác ðiều này xảy ra là do có sự phóng thích ra một loại polypeptide từ tiểu cầu trong quá trình trong quá trình ñóng cục của huyết thannh Polypeptide này ñược gọi là yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu ðây là một nhóm các polypeptide gây ra hoạt ñộng phân chia tế bào và có lẽ là yếu tố tăng trưởng chính trong huyết thanh Những yếu tố khác như yếu tố tăng trưởng trong nguyên bào sợi (fibroplast growth factor FGF), yếu tố tăng trưởng biểu bì tế bào (epidermal growth factor EGF), yếu tố tăng trưởng nội bì và hoạt ñộng kích thích sự nhân dòng (Multiplication-Stimulating Activity MSA) ñược cô lập từ mô hoặc tế bào phóng thích ra môi trường trong quá trình nuôi cấy với các mức ñộ chuyên biệt khác nhau và có lẽ chúng có mặt với một lượng nhỏ trong huyết thanh

Hormone: hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên tế bào và thường khó có thể

amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó ñã ảnh hưởng ñến thuộc tính này Các hormone tăng trưởng có thể có mặt trong huyết thanh, ñặc biệt là huyết thanh

bò và cùng với somatomedine ảnh hưởng lên sự phân bào Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lượng thay ñổi, kích thích sự bám dính của tế bào; nhưng trong những ñiều kiện nhất ñịnh (khi có mật ñộ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cám ứng biệt hóa

tế bào Các thí nghiệm giàm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trường nuôi cấy cho thấy các hormone cần thiết cho việc nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành phần của huyết thanh nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là cần thiết

Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có amino acid,

glucose, ketoacid và một số các dưỡng chất, các chất biến dưỡng trung gian Những chất này quan trọng trong môi trường ñơn giản nhưng ít quan trọng hơn trong các môi trường phức tạp, ñặc biệt là những môi trường có các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng ñộ cao

Khoáng chất: các nguyên tố dạng vết như sắt, ñồng, kẽm có thể ñược cung cấp bởi

huyết thanh và chúng liên kết với các protein của huyết thanh

Các yếu tố kìm hãm: huyết thanh có thể có chứa các cơ chất có tác dụng kìm hãm sự

tăng sinh của tế bào Một số chất có thể ñược tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trường như ñộc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trường trước khi qua lọc vô trùng, các phân ñoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trợ ngại cho việc nuôi cấy Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính ñộc của immunoglobulin mà không gây hại ñến các yếu tố tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có thể phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống trước khi xử lý

4.1.2.3 Ảnh hưởng cuả oxygen, carbon dioxide dạng khí và nhiệt ñộ trong quá trình nuôi cấy

a Oxygen

Tùy theo mục ñích sử dụng mà nhu cầu O2 của mẫu cấy thay ñổi: ñó là sự khác nhau giữa cơ quan và môi trường nuôi cấy Trong khi O2 không khí hoặc một lượng O2 thấp hơn nồng ñộ O2 không khí phù hợp hơn với hầu hết các tế bào nuôi cấy thì có vài loại cơ quan, ví

dụ như phôi của các giai ñoạn sau (phôi mới hình thành hoặc phôi trưởng thành) lại cần ñến 95% O2 ở dạng khí Hầu hết các tế bào tách rời nhau cần lượng O2 thấp hơn và sẽ tăng trưởng tốt hơn khi lượng O2 thấp hơn O2 không khí Sự có mặt selenium làm giảm bớt lượng O2 hòa tan trong môi trường Vai trò của O2 hòa tan ngày càng giữ vai trò quan trong và phải cung cấp O2 trong suốt giai ñoạn nuôi mẫu ðộ sâu của môi trường có thể ảnh hưởng ñến sự khuếch tán của O2 vào ñến mẫu nuôi cấy, vì vậy người ta khuyên rằng nên ñổ môi trường vào bình nuôi cấy dày khoảng 2 – 5 mm (0,2 – 0,5 ml/cm2) trong bình nuôi cấy

b Carbon Dioxide (CO 2 )

CO2 có vai trò phức tạp hơn O2 vì có sự tương quan giữa mọi hoạt ñộng của nó, ví dụ CO2 hòa tan, pH và nồng ñộ Khó có thể xác ñịnh ñược tác dụng chính của nó Áp lực

của CO2 không khí sẽ ñiều hòa trực tiếp nồng ñộ CO2 hòa tan trong môi trường tương tự như vai trò của nhiệt ñộ Sự hòa tan CO2 trong nước sẽ tạo ra acid:

(1)

có ñộ hòa tan thấp và không kết hợp với các cation hiện diện trong môi trường

Nó có khuynh hướng tái hợp ñể tạo ra acid Kết quả cuối cùng của sự tăng CO2 không khí là

sự giảm pH môi trường Ảnh hưởng này có thể giải quyết bằng cách tăng nồng ñộ bicarbonate trong môi trường nuôi cấy:

(2)

Sự tăng nồng ñộ bicarbonate sẽ ñẩy phương trình (1) lệch sang trái và sự cân bằng chỉ ñạt ñược khi pH = 4 Nếu sử dụng một chất kiềm khác như NaOH thay cho NaHCO3 thì kết quả cuối cùng cũng tương tự:

(3) Mỗi môi trường ñòi hỏi một nồng ñộ và áp lực CO2 ñể ñạt ñược pH và áp suất thẩm thấu chính xác Tuy nhiên, vẫn có những thay ñổi tối thiểu xảy ra trong các phương pháp chuẩn bị môi trường khác nhau

Tóm lại, khi tế bào ñược nuôi cấy với mật ñộ trong bình có nắp cho phép không khí lưu thông thì cẩn phải ñược nuôi trong ñiều kiện có CO2 không khí, nồng ñộ của CO2 phải cân bằng với nồng ñộ bicarbonate sodium trong môi trường Khi mật ñộ tế bào nuôi cấy thấp (trong quá trình nhân dòng) thì cần phải ñưa CO2 dạng khí quá nắp bình trong hầu hết các thí nghiệm Khi mật ñộ tế bào cao thì thao tác này không cần thiết nhưng cần phải nuôi tế bào trong các dĩa ñể mở dễ trao ñổi khí Trong trường hợp tế bào tạo ra nhiều acid và CO2 nội sinh thì cần phải nới lỏng nắp bình ñể CO2 thoát ra ngoài Trong những trường hợp này cần phải bổ sung dung dịch ñệm HEPES (20mM) vào môi trường ñể ổn ñịnh pH

c Nhiệt ñộ nuôi cấy

Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp của tế bào phụ thuộc vào:

Thân nhiệt của loài ñộng vật cần thu tế bào ñể nuôi cấy

Tế bào ñó thuộc vùng nhiệt ñộ nào trên cơ thể (ví dụ nhiệt ñộ ở da thấp hơn nhiệt ñộ bên trong cơ thể)

Có sự kết hợp của một yếu tố an toàn cho phép những sai sót tối thiểu có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy

Nhu vậy nhiệt ñộ cần thiết ñể nuôi cấy hầu hết tế bào người và ñộng vật máu nóng là 36,5oC, gần với thân nhiệt, nhưng ñể an toàn nên nuôi cấy nhiệt ñộ thấp hơn một chút ít

ðối với các loài chim, vì thân nhiệt của chúng cao nên tế bào của chúng tăng trưởng tốt nhất ở nhiệt ñộ 38,5oC nhưng chúng vẫn có thể tăng trưởng ở nhiệt ñộ 36,5oC Ở nhiệt ñộ này, sự tăng trưởng của tế bào chậm hơn

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào ñộng vật có thể chịu ñược sự giảm nhiệt ñộ, chúng có thể sống vài ngày ở nhiệt ñộ 4oC và có thể chịu ñược sự ñông lạnh ở –196oC, nhưng chúng không thể chịu ñược nhiệt ñộ tăng cao hơn mức bình thường khoảng 2oC (chúng chỉ có thể chịu ñựng ñược nhiệt ñộ 39,5oC trong vài giờ) và sẽ chết rất nhanh khi nhiệt ñộ tăng lên

40oC hoặc trên nữa

Tế bào biểu bì của ñộng vật ñẳng nhiệt có thể tăng trưởng tốt hơn ở 33oC

ðối với ñộng vật không xương sống, phạm vi nhiệt ñộ có lẽ hẹp hơn ðối với những ñộng vật có thân nhiệt thay ñổi, tế bào của chúng có thể chịu ñược một biên ñộ cao nhưng tốt hơn nên nuôi chúng ở một nhiệt ñộ trung bình trong biên ñộ nhiệt ñó

Nhiệt ñộ nuôi nên ñược giữ ổn ñịnh, sự chênh lệch nhiệt ñộ có thể xảy ra tối ña là ± 0,5oC Tế bào có thể tăng trưởng hoàn toàn bình thường ở trong khoảng nhiệt ñộ 33 ÷ 39oC nhưng tốc ñộ tăng trưởng và khả năng biến dưỡng trong tế bào sẽ thay ñổi tùy theo nhiệt ñộ

Bình nuôi cấy ñược giữ trong tủ ấm, phải ñảm bảo nhiệt ñộ ñều và ổn ñịnh ở mọi nơi trong tủ ấm Bể ñiều nhiệt cũng có thể ñược sử dụng ñể giữ mẫu nhưng mẫu cũng sẽ dễ bị nhiễm hơn là khi ñược nuôi trong tủ ấm vì bình thường nuôi cấy phải giữa ngập trong nước

Do ñó bể ñiều nhiệt ít ñược sử dụng Phải sử dụng tủ ấm có không khí ñối lưu cho mục ñích này

4.1.3 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Enzyme thường ñược sử dụng ñể tách tế bào là trypsin, collagenase, elastase, hyaluronidase, Dnase,pronase, dispase hoặc là hỗn hợp các enzyme Trypsin và pronase có thể tách rời tế bào hoàn toàn nhưng có thể gây tổn thương cho tế bào Collagenase và dispase không tách tế bào ñược hoàn toàn nhưng không gây tổn thương ñến tế bào Hyaluronidase có thể ñược sử dụng phối hợp với collagenase và Dnase ñể phân tán DNA và phóng thích từ những tế bào bị vỡ vì nó có khuynh hướng kích thích tế bào kết cụm lại với nhau và làm suy yếu quá trình phân giải protein

Mặc dù mỗi loại mô có thể có những ñòi hỏi ñiều kiện nuôi cấy khác nhau nhưng những yêu cầu thông thường của tế bào trong quá trình nuôi cấy sơ khởi thường giống nhau:

• Chất béo và mô bị hoại tử thường bị bỏ ñi trong quá trình giải phẫu mô

• Mô nên ñược cắt ra trong tình trạng ít bị tổn hại nhất

• Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào nên ñược loải bỏ bằng cách ly tâm sau khi

ñã tách xong tế bào

• Mật ñộ tế bào trong môi trường nuôi cấy ñầu tiên thường cao hơn nhiều so với những lần cấy chuyền kế tiếp, bởi vì khả năng phân chia của tế bào vừa mới tách khỏi mô rất thấp trong môi trường nuôi cấy sơ khởi

Ớ Môi trường giàu chất dinh dưỡng như F10, F12 của Ham thường ựược sử dụng hơn là môi trường cơ bản như môi trường EME của Eagle, và nếu tế bào có nhu cầu về huyết thanh thì huyết thanh phôi bò cần cho sự sống của tế bào hơn là huyết thanh ngựa

Ớ Các cụm tế bào phôi cô lập thường dễ tạo ra nhiều tế bào sống và tăng sinh nhanh chóng trong môi trường khởi ựầu hơn là tế bào trưởng thành

4.2.2 Cấy chuyền lớp mỏng các dòng tế bào tăng trưởng liên tục

Tùy vào từng loại tế bào mà phải xây dựng môi trường cấy chuyền phù hợp Kết quả chỉ ựạt ựược bằng thực nghiệm

4.2.3 đếm số tế bào có sử dụng thuốc nhuộm Ờ Phương pháp sử dụng buồng ựếm

Việc ựếm số tế bào ựược thực hiện trong một thể tắch nhỏ huyền phù tế bào dưới kắnh hiển vi Buồng ựếm là một lame kắnh ựể quan sát dưới kắnh hiển vi, ựược chia thành 9 ô vuông lớn cách nhau bằng 3 ựường gạch Mỗi ô vuông lớn có diện tắch 1mm2 độ sâu của lame kắnh ở vị trắ chia ô là 0,1mm; như vậy tổng số thể tắch của chất lỏng trong mỗi ô vuông

Tế bào có thể ựược ựếm bằng máy ựếm tế bào ựiện tử

Dung dịch: tryptophan xanh 0,4% trong HBSS: trữ ở 4oC

Các bước tiến hành:

đậy lên trên buồng ựếm bằng một kắnh ựậy mẫu và ấn nhẹ ựến khi có thể thấy rõ ựược vòng Newton Cho một giọt huyền phù tế bào (thường pha loãng với tỉ lệ 1:5 có nghĩa là cho 0,2ml tế bào vào cùng với 0,3ml HBSS và 0,5ml trypan xanh 0,4%) ở cạnh (bìa) của kắnh ựậy mẫu

đặt buồng ựếm vào bàn ựể mẫu của kắnh hiển vi soi ngược và ựếm tất cả các tế bào bị nhuộm màu xanh trong bốn ô vuông lớn ở mỗi góc của vùng trung tâm (S1 ựến S4) và

cả ô vuông trung tâm S5 đếm các tế bào nằm ở cạnh bên phải và cạnh trên nhưng không ựếm tế bào ở cạnh trái và cạnh dưới Các tế bào chết bắt màu và có màu xanh

Hệ thống nuôi cấy tốt là hệ thống nuôi cấy có hơn 90% tế bào sống

4.2.4 Cấy chuyền các dòng tế bào liên tục trong dịch huyền phù tế bào

Các tế bào tăng trưởng liên tục trong môi trường nuôi cấy ựược cấy chuyền bằng cách pha loãng Lấy vắ dụ ựối với tế bào bạch cầu Molt-4 của người, ựó là một dòng tế bào tăng trưởng liên tục có thể nhân giống vô hạn ựịnh trong dịch huyền phù

Dung dịch nuôi cấy: giống dung dịch dùng cho cấy chuyền lớp mỏng

Các bước tiến hành

Lấy bình nuôi cấy mô có chứa tế bào Molt-4 ra khỏi tủ ấm CO2 37o, ựộ ẩm 5% đóng nắp và lắc nhẹ đốt nắp bình nuôi cấy trước khi mở và lấy một phần nhỏ huyền phù tế