THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TỦY XƯƠNG LÊN MÀNG

THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TỦY XƯƠNG LÊN MÀNG

1.1 Công nghệ vật liệu trong y sinh học: [1], [7], [8], [21], [29]

Hình 1: Tai nhân tạo, một trong những thành tựu của công nghệ vật liệu

Công nghệ vật liệu là một trong những lĩnh vực tiềm năng vì các cơ quan cấy ghép lấy từ cơ thể người cho thường được cung cấp rất hạn chế Mỗi năm có khoảng 19.000 ca cấy ghép được thực hiện tại Mỹ và khoảng 56.000 bệnh nhân tại đất nước này cần được ghép cơ quan, thậm chí có trường hợp một người phải chờ đợi tới 13 năm Các ca mổ này thường rất khó khăn và tốn kém, đòi hỏi bệnh nhân phải trải qua một chế độ nghiêm ngặt vì hệ miễn dịch bị suy giảm Đây là thử thách lớn trong điều trị bằng phẫu thuật cấy ghép

Cho đến nay, một số sản phẩm vật liệu được đưa ra thị trường, vật liệu thay thế da, xương và sụn

Vật liệu sinh học trong nuôi cấy mô được sử dụng để hỗ trợ, hướng dẫn các tế bào trong các cấu trúc 2 và 3 chiều chuyên biệt Chúng được biết đến với thuật ngữ ECM (Extracellular matrix), ECM có cấu trúc khung bao gồm các proteins, carbohydrates và các phân tử tín hiệu Giàn giáo lí tưởng làm bằng các vật liệu sinh học mang đến cho các tế bào những tín hiệu cần thiết cho sự phát triển, biệt hóa và tương tác với nhau tạo nên các cấu trúc mong muốn Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng phân hủy chậm tạo thành các hợp chất không độc hại trong khi mô mới được hình thành và xác nhập

với mô của người bệnh Hơn thế nữa, vật liệu sinh học cần phải an toàn, dễ sử dụng với giá cả hợp lí

Những vật liệu sinh học đầu tiên được sử dụng trong giải phẫu thường được nghiên cứu sao cho không độc, không gây đáp ứng miễn dịch và tự phân hủy Ngày nay, các nghiên cứu thường tập trung vào sự phát triển của vật liệu sinh học với những đặc tính mới như: khả năng phân hủy có thể điều chỉnh, khả năng hỗ trợ cho tương tác tế bào Trong đó, quan tâm nhất là sự sát nhập của các phân tử tín hiệu sinh học với vật liệu sinh học

Hinh 2: Hình ảnh của một khuôn tái sinh da điển hình có cấu trúc lỗ

xốp dưới kính hiển vi điện tử quét Cấu trúc này cho phép tế bào len lỏi bên trong

Vật liệu sinh học có thể được làm bằng các chất tổng hợp (lactide, glycolide, ceramics), dạng tự nhiên (collagen, các polysaccharide tự nhiên) hay những vật liệu bán tổng hợp (poly-4-hydroxybutyrate, axit polylactic và polyglycolic hay là sự kết hợp của các thành phần trên để tạo ra các loại vật liệu dùng trong thử nghiệm lâm sàng và trong nghiên cứu Một số thành tựu điển hình của công nghệ vật liệu có thể kể đến như:

Các polymer tổng hợp có khả năng phân hủy được (VD: Chất dẻo chịu nhiệt) Sự tạo thành của chúng có thể biến đổi bỡi nhiệt độ (từ nhiệt độ phòng đến nhiệt độ của cơ thể) [7]

¾ Những vật liệu hỗn hợp làm từ polylactide-co-glycolide hứa hẹn nhiều tiềm năng cho vật liệu thay thế xương [7]

¾ Các hydrogel tổng hợp được biến đổi ở một vài đoạn peptide giúp cho các tế bào có thể định cư vào gel Bởi tính thấm tốt cho chất dinh dưỡng và khí, tính tương hợp sinh học và một số đặc điểm khác Hydrogel là vật liệu tiềm năng cho các ứng dụng về công nghệ mô

¾ Sự quang polymer hóa có thể tạo ra các khung có tính linh động cao

¾ Một số polymer như poly-4-hydroxybutyrate với tính linh động cao và khả năng phân hủy sinh học được kiểm soát đã mở ra những khả năng mới cho việc thiết kế các vật liệu sinh học

¾ Các polymer kết hợp với protein được sản xuất dựa trên sự phát triển của kỹ thuật gen và công nghệ vật liệu có khả năng phân hủy sinh học và tính tương hợp sinh học cao Sự kết hợp của các amino acid nhân tạo có thể mang đến cho vật liệu những đặc tính rõ ràng

1.2 Vật liệu sinh học thay thế da:

Trong suốt hơn 30 năm qua, đã có nhiều nỗ lực để phát triển các sản phẩm giống như da cho một vài trường hợp nguy kịch Những sản phẩm này không những đã đáp ứng được những yêu cầu nêu trên mà còn mang nhiều đặc điểm có lợi khác như:

¾ Tạo những đáp ứng tăng sinh từ vết thương mà không gây ra viêm hay loại thải

¾ Bền và đàn hồi để có chức năng bình thường và tạo vẻ bên ngoài

¾ Có sắc tố giống với da thật

¾ Thích hợp cho những ca nguy cấp và dễ dàng sử dụng

Da nhân tạo có thể được ứng dụng trong điều trị bỏng, loét, giải phẫu thẩm mĩ, khoảng 150.000 bệnh nhân hằng năm ở miền tây Châu Aâu cần được điều trị bằng da nhân tạo, nhưng con số này vẫn ít hơn số người bị loét Đây là một tổn thương không thể lành trong 6 tuần và duy trì trong nhiều năm, gây tốn kém trong điều trị Một số bệnh gây ra loét như tiểu đường hay bệnh tĩnh mạch, số người mắc bệnh tăng lên theo tuổi và do lối sống Riêng ở Đức, có khoảng 2-3 triệu người bị loét, chi phí điều trị lên đến hơn một tỉ euro

Những mảnh da tổng hợp thường được sử dụng phổ biến trong điều trị những tổn thương nêu trên So với các kĩ thuật truyền thống như sử dụng da người chết là vật thay thế, mảnh ghép tổng hợp có thuận lợi lớn là không phụ thuộc vào nguồn da của người cho

Hình 3: Ảnh minh họa sự gắn kết của tế bào lên vật liệu

Có hai thành phần chính của da nhân tạo: khuôn, có thể làm bằng collagen, axit hyaluronic, những polymer phân hủy sinh học bán tổng hợp khác và những tế bào da khác nhau như keratin, fibroblast, melanin Một số sản phẩm đầu tiên trên thị trường để điều trị các vết bỏng sâu là: Epicel (Enzyme Biosurgery, USA), Integra (Integra life sciences, USA), và Transcyte (Smith & Nephew, UK) Tuy nhiên ngày nay đã có nhiều các sản phẩm dùng để điều trị loét như: Apligraf (Organogenesis, USA), Dermagraft (Advanced Tissue Sciences)…

Hình 4: Sự phối hợp của vật liệu, tế bào và các chất tăng trưởng trong

việc tạo thành cơ quan nhân tạo

Các sản phẩm da nhân tạo cũng được sử dụng trong các thử nghiệm

invitro như thử nghiệm độc tố, dược lí học và thẩm mĩ…

1.2.2 Tiêu chuẩn cho vật liệu phủ vết thương: [1]

1.2.2.1 Tính thấm ướt nền vết thương và sự bám dính:

¾ Làm ướt bề mặt vết thương

¾ Thích ứng với bề mặt vết thương

¾ Bám dính hóa học với nền vết thương Tránh sự tăng sinh của lớp hạt

¾ Bám dính ở tất cả các vùng Nếu không sẽ hình thành các túi không khí nhỏ giúp cho vi khuẩn sinh sôi

¾ Năng lượng bề mặt của mảnh ghép và nền vết thương nhỏ hơn giao diện của không khí và nền vết thương Nền vết thương được

làm ướt, túi không khí được thải ra

1.2.2.2 Sự tạo lỗ của mảnh ghép:

Mảnh ghép phải thấm được và ẩm Nhưng độ ẩm lớn sẽ phá hủy giao diện của vết thương và mảnh ghép Độ ẩm nhỏ thì dịch tiết bên dưới mảnh ghép sẽ nâng nó lên khỏi tấm nền vết thương Lượng nước tối ưu: 5 mg/cm2/h

Có khả năng tạo ra các lỗ giúp cho tế bào fibroblast phân chia và di trú bên trong vật liệu Bởi vì các tế bào biểu bì, trung mô trong vết thương có đường kính 10 µm nên các lỗ phù hợp với trật tự này sẽ tạo thuận lợi cho fibroblast đi vào bên trong vật ghép

Sự di trú của tế bào phụ thuộc vào:

¾ Kích thước lỗ

¾ Bề dày mảnh ghép Lỗ có đường kính nhỏ hơn 10 µm làm cho các tế bào fibroblast, biểu

bì không di chuyển xuyên qua lỗ, ta phải phân hủy khuôn giúp tế bào đi vào bên trong vật liệu

Vật liệu nếu dày sẽ làm chất dinh dưỡng từ nền vết thương đến mảnh ghép bị hạn chế Mảnh ghép mỏng dễ đứt gãy còn mảnh ghép dày sẽ cứng và không dính với vết thương

Khoảng cách giới hạn để duy trì chất dinh dưỡng tới tế bào đang di trú được qui định bằng biểu thức không thứ nguyên bắt nguồn từ công thức Thiele và được biến đổi bởi Wagner và Weisz:

R* L2

S=

D* C0

Trong đó: R : tốc độ sử dụng chất dinh dưỡng tới hạn của tế bào

L : khoảng cách hỗ trợ chất dinh dưỡng khuyếch tán

D : sự khuyếch tán chất dinh dưỡng qua màng được hydrate hoá

C0 : nồng độ chất dinh dưỡng tại nền vết thương

S : số không thứ nguyên

S=1 thì tử và mẫu cân bằng, sự sinh truởng mao quản xảy

ra, cung cấp cho tế bào cơ chất và oxi

1.2.2.3 Độ bền của vật ghép:

Vật ghép có độ bền cao giúp cho thao tác không bị rách, phủ vết thương trong toàn bộ chu trình lành hóa

1.2.2.4 Tốc độ phân hủy sinh học:

Quá trình phân hủy sinh học gây đáp ứng viêm tối thiểu đối với vật chủ Ta cần tính toán, cân bằng tốc độ phân hủy vật liệu với thời gian cần cho tái sinh tế bào

Nếu mảnh ghép phân hủy nhanh thì vết thương không được che phủ hiệu quả

Nếu mảnh ghép phân hủy chậm thì sẽ hình thành sẹo và phối hợp vật

liệu vào trong vết thương

1.2.2.5 Tính kháng nguyên:

Vật liệu thay thế da có khả năng bị loại ra và làm viêm cục bộ nếu có

tính kháng nguyên

1.2.2.6 Cấu trúc vĩ mô:

Nếu không có giàn giáo (scaffold), nguyên bào sợi sẽ xắp xếp

collagen ngẫu nhiên và hình thành sẹo

1.2.3 Phân loại các loại màng sinh học dang dược sử dụng hiện nay: [1] 1.2.3.1 Vật ghép tự nhiên:

Chủ yếu là autograft (da tự thân) và allograft (da từ người khác) Tác dụng của autograft và allograft:

¾ Giảm số lượng vi khuẩn trên bề mặt được làm ướt của vết thương

¾ Giảm sự mất dịch và protein

¾ Giảm đau

¾ Hạn chế sự co cứng của vết thương

¾ Tăng sự tạo mạch mới

Hạn chế:

¾ Thiếu autograft ở bệnh nhân phỏng nặng

¾ Khó khăn trong dự trữ allograft, có tính kháng nguyên Xenograft từ heo, là vật liệu che phủ tạm thời, đòi hỏi tiệt trùng cao, bệnh nhân bỏng phải được xóa bỏ miễn dịch, mảnh ghép cuối cùng bị đẩy ra và thay thế bằng autograft

Màng ối: màng phủ vết thương tự nhiên tạm thời nhưng tăng sự tạo hạt của nền vết thương Do đó mảnh ghép của da sống lâu hơn nhưng cũng

có nhiều sẹo hơn

1.2.3.2 Vật ghép tổng hợp:

Mảnh ghép đơn lớp: thường sử dụng collagen do:

¾ Nguồn chiết tách lớn

¾ Liên kết chéo của collagen làm tăng độ bền và sức căng nhưng cũng có khuynh hướng làm cho sợi cứng & dòn

¾ Bám dính tự nhiên với vết thương lúc ban đầu do kết hợp với fibrin

¾ Collagenase xuất hiện trong nền vết thương & vi khuẩn từ nền vết thương có thể làm tuột miếng xốp collagen này

Mảnh ghép đa lớp:

Màng 2 lớp: bên trong là collagen & chondroitin-6-sulfate và lớp bên ngoài là silastic Có tác dụng ngăn chặn sự co vết thương với kích thước lỗ tối

ưu là 50 µm Lớp silastic dày 0,1 mm, có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn trong khi vẫn duy trì dòng nước thích hợp qua màng, cung cấp độ cứng cần thiết để

khâu mảnh ghép vào đúng chỗ, ngăn chặn sự di chuyển mảnh ghép trong quá trình lành hóa vết thương Vật liệu trên bám dính với vết thương trong vài phút và tạo mạch mới trong 3 - 5 ngày

Hình 5: Màng 2 lớp

Màng giai đoạn 2: các tế bào đáy của da được tách, nuôi cấy và được đưa vào trong khuôn bằng cách tiêm trực tiếp hay sử dụng lực li tâm Tế bào biểu bì nhanh chóng tăng sinh Sự thay thế da chức năng đạt được ở heo sau

4 tuần, tốc độ nhiễm trùng thấp, bề mặt đồng nhất, mềm dẻo và trơn láng

tương tự da bình thường

1.2.3.3 Các đặc tính lí tưởng của vật liệu thay thế da:

¾ Bám dính nhanh, bền lên bề mặt vết thương

¾ Cấu trúc cho phép sự cố định, di chuyển, tăng sinh, tăng trưởng của các tế bào mô mới

¾ Không thấm các vi khuẩn ngoại sinh

¾ Giảm sự mất nước, mất điện giải, protein

¾ Không tạo kháng nguyên, không gây dị ứng

¾ Có tính linh động, độ co giãn cao nhưng vẫn bảo vệ vết thương

Không gây độc

¾ Có thể tiệt trùng được

¾ Có thể hạn chế sự nhiễm trùng bên dưới

¾ Giảm thiểu sự tạo sẹo

¾ Giúp bám nhanh vết thương

¾ Có khả năng thấm, chứa các chất kháng khuẩn

¾ Khả năng phục hồi chức năng da sau chữa trị

¾ Dễ bảo quản và bảo quản được lâu

¾ Giá thành rẻ

1.2.4 Các loại màng trên thị trường: [16], [27]

Orcell là vật liệu tương hợp sinh học có khả năng hấp thu tốt, tạo điều kiện lí tưởng cho sự di trú của các tế bào khởi động cho quá trình tái tạo mô

da Các tế bào trên cũng tiết ra các cytokine và các hormon tăng trưởng Orcell cũng cung cấp một cấu trúc mở Cấu trúc này giúp các tế bào có thể di

cư vào và xuyên qua các lỗ Các lỗ trên vật liệu cho phép tế bào fibroblast có thể di chuyển và tạo lại da Trước khi đưa tế bào lên, vật liệu được tạo thành và sau đó được phủ lên một lớp gel mỏng làm bằng collagen

Nhiều thử nghiệm đã được thực hiện trên Orcell để đảm bảo rằng không có các phản ứng nguy hiểm xảy ra Các tế bào cũng được thử nghiệm

để cho kết quả âm tính với virus người, retrovirus, vi khuẩn, nấm…

1.2.4.2 Dermagraft:

Hình 6: Màng Dermagraft

Dermagraft là một màng thay thế trung bì dẫn xuất nguyên bào sợi người Cấu tạo màng Dermagraft gồm nguyên bào sợi, chất nền ngoại bào và một giàn đỡ có thể hấp thu sinh học Các nguyên bào sợi nuôi cấy được đưa vào giàn đỡ mạng lưới polyglactin có thể hấp thu sinh học Các nguyên bào sợi tăng sinh để lấp kín các kẽ hở của giàn đỡ này, sản xuất collagen trung

bì, các protein nền, các nhân tố tăng trưởng và cytokine của người

1.2.4.3 Transcyte:

Hình 7: Màng Transcyte

Tế bào fibroblast được phát triển trên một mạng lưới, nơi chúng phân chia và sản xuất ra các nhân tố tăng trưởng, collagen và các protein khác để

tạo thành da người có chức năng cụ thể

1.2.4.4 Integra: [30]

Hình 8: Màng integra

Integra là một nền polymer collagen – glucoaminoglycan (CG) có khả năng phân hủy sinh học, được phủ một lớp polysiloxane (silicone) mỏng Collagen loại 1 của bò và chondroitin-6-sulfate (một trong số các glycoaminoglycan chính) được ủ chung với nhau, được làm lạnh khô và khâu mạch

Kích thước lỗ được xác định để tối đa sự tăng trưởng của tế bào và mức độ khâu mạch cũng như thành phần GAG được thiết kế để kiểm soát tốc độ phân hủy của chất nền

Sau 2 – 3 tuần ghép, trung bì mới và mạch mới được hình thành

1.2.4.5 Apligraf: [25], [26]

Hình 9: Màng Apligraft

Được sử dụng bằng cách đưa các tế bào fibroblast lên trên vật liệu để tạo lớp dưới Khi tế bào fibroblast di chuyển xuyên qua collagen, lớp da được thay đổi, sản xuất ra nhiều collagen hơn Lúc này, các tế bào keratin được đặt lên trên, tạo thành lớp biểu mô ở trên Lớp biểu mô này tiếp xúc với không khí, là lớp bên ngoài có chức năng bảo vệ của da

1.2.4.6 EZ Derm: [3]

Hình 10: Màng EZ Derm

EZ Derm là một mảnh ghép da dị loại từ heo đã được biến đổi hóa học để bảo quản

Tất cả các yếu tố của trung bì từ trung bì heo gốc bị bất hoạt theo quy trình hóa học, không giống như trung bì heo đông lạnh sẵn có Tuy nhiên, màng phủ này không kích thích làm lành vết bỏng

1.2.4.7 Promogran:

Hình 11: Màng Promogran

Màng phủ collagen Promogran là màng kết hợp collagen động vật (55%) với cellulose tái sinh được oxi hóa (oxidized regernerated cellulose – ORC) (45%) Vai trò của cellulose là hấp thu ORC/collagen hấp thu các protease thừa từ bề mặt vết bỏng

Màng phủ ORC/collagen tạo ra một môi trường collagen hấp dẫn tế bào và kích thích tăng trưởng mô

1.3 Nguyên liệu thiết kế màng phủ vết thương:

1.3.1 Chitosan: [1], [7], [17]

Hình 12: Cấu tạo hóa học của chitosan

Chitosan là một polysaccharide, glucopyranose], được tạo ra do quá trình deacetyl hóa chitin tự nhiên Chitin và chitosan được biết từ lâu, nhưng gần đây chitin và chiosan mới được chú ý nghiên cứu và sử dụng Sản lượng chitosan trên thế giới hiện nay khoảng

poly[β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-2000 tấn/năm, điều này cho thấy mức độ và nhu cầu sử dụng nó trên thực tế

Trong hóa học, chitosan được điều chế từ chitin Chitin có nhiều trong tự nhiên nhất là trong vỏ các loài động vật giáp xác như tôm, cua… Mẫu chitin nhận được từ nguồn vỏ tôm, cua qua quá trình xử lí như sau: vỏ tôm, cua được xay nhỏ, loại protein bằng NaOH 0,005N, loại muối phosphate bằng HCl 1N, loại protein trong cấu trúc vỏ bằng NaOH 2N ở 100oC Sau đó rửa sạch, sấy khô thu được chitin Chitin được xử lí 1 hoặc 2 giờ trong dung dịch NaOH 47% ở 110oC (hoặc 60oC) trong môi trường có nitrogen, sau đó rửa nước ở 80oC đến trung hòa Sản phẩm thu được có độ deacetyl hóa khoảng 80% Việc xử lí kiềm và rửa trong nước được lặp lại nhiều lần để thu được sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa cao hơn

Chitosan và các dẫn xuất của chitosan được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau:

¾ Trong lĩnh vực môi trường, chitosan được xem như vật liệu mới có tác dụng làm sạch nước, khí thải công nghiệp, thu hồi kim loại nặng, protein chống ô nhiễm môi trường

¾ Trong nông nghiệp, chitosan dạng dung dịch được phủ lên hạt giống, có tác dụng chống nấm mốc và kích thích nẩy mầm hạt giống làm tăng năng suất vụ mùa Người ta còn sử dụng chitosan làm nguyên liệu chính để điều chế chế phẩm bảo quản hoa tươi, hoa quả đóng hộp, thịt, trứng, làm chất điều hòa sinh trưởng cho cây, bảo quản thực phẩm, chế phẩm phòng chống nấm bệnh thực vật…

¾ Trong mĩ phẩm, chitosan dùng làm keo xịt tóc, kem dưỡng da, làm chất keo cảm quan trong công nghiệp in, làm vải côn, làm tăng độ bền màu vải nhuộm trong công nghiệp dệt

¾ Các kết quả nghiên cứu dược lý của chitosan cho thấy: chitosan có tính tương hợp sinh học khá cao: không gây độc tính ở các mức độ cấp, bán cấp, độc tính tại chỗ, hay toàn thân Chúng cũng không gây ảnh hưởng đối với trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, các chức năng gan, thận,

cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu sinh hóa của máu và nứơc tiểu trong các thử nghiệm dài hạn… nghĩa là chúng có tính an toàn sinh học cao

¾ Về tác dụng chữa bệnh, chitosan có tác dụng kháng khuẩn và nấm, có khả năng thúc đẩy sự lành hóa vết thương Thế nên nó được sử dụng làm thuốc và màng sinh học trong điều trị tổn thương bỏng Chitosan còn dùng làm giảm lượng cholesterol trong máu, làm chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu, làm kính áp tròng, làm thuốc cầm máu, kích thích hệ thống miễn dịch và làm chất mang đưa thuốc đến vùng cần trị liệu như khối u trong điều trị ung thư

¾ Chitin và chitosan tỏ ra thích hợp để ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm vì chúng có tính tương hợp sinh học, thoái biến sinh học và

an toàn sinh học Chitosan có thể dùng làm các chất phụ gia, tá dược các loại, chất tạo màng, tạo vỏ viên nang mềm và cứng, chất mang sinh học dẫn

thuốc…

1.3.2 Collagen và gelatin: [3], [12], [19]

Hình 13: Cấu tạo hóa học của gelatin

Khoản ¼ protein trong cơ thể là collagen Collagen là một protein cấu trúc chính hình thành các sợi phân tử, tạo sự rắn chắc cho gân và các phiến đàn hồi nâng đỡ da và các cơ quan bên trong Xương và răng được tạo thành

do việc thêm các tinh thể khoáng vào collagen

Nguyên bào sợi tạo collagen Quá trình tổng hợp collagen là tiến trình kết hợp các axit amin thành những chuỗi liên kết với nhau để thành các phân tử tạo ra các tơ, chúng gắn bó với nhau thành sợi rồi thành các bó collagen

Collagen gồm ba chuỗi kết hợp tạo cấu trúc xoắn ba chặt, mỗi chuỗi có chiều dài hơn 1400 axit amin, chủ yếu gồm glycin (xấp xỉ 1/3 gốc axit amin), prolin và hydroxyprolin (hơn ¼ gốc axit amin)

Collagen bị biến tính ở nhiệt độ cao Khi xoắn ba này được tháo xoắn, các chuỗi tách rời, được làm lạnh và hấp thu nước mạnh sẽ tạo thành gelatin Như vậy, gelatin được thu nhận khi thủy phân giới hạn sợi collagen không hòa tan Thành phần và trình tự axit amin của gelatin tương tự collagen Gelatin có hàm lượng glycin, prolin và hydroxyprolin cao Cấu trúc xoắn ba của tropocollagen được bảo tồn trong gelatin, vì vậy gelatin có thể giữ nước để tạo thành gel

Hình 14: Thành phần axit amin của collagen và gelatin

Gelatin không tan trong nước lạnh nhưng dễ hòa tan trong nước ấm Khi thêm nước lạnh, những hạt gelatin trương phồng, tăng đến 5 – 10 lần trọng lượng trong nước Khi tăng nhiệt độ lên 40oC, những hạt gelatin này hòa tan để tạo thành dung dịch Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của gelatin là nhiệt độ, nồng độ và kích thước hạt

Collagen thể hiện tính kháng nguyên ở điều kiện sinh lí khi sử dụng trong sinh y Gelatin được sử dụng nhiều trong các ứng dụng sinh y, đặc biệt ứng dụng làm màng phủ vết thương, nhờ một số ưu điểm: không có tính kháng nguyên, hoạt hóa đại thực bào, hiệu quả cầm máu cao, có thể được

hấp thu hoàn toàn invivo

1.3.3 Axit Hyaluronic: [13], [14]

Axit hyaluronic, hay còn gọi là hyaluronan (HA), là một trong số các polysaccharide nhầy có trọng lượng phân tử cao tồn tại với số lượng lớn ở huyết thanh, mào gà, da cá mập và sụn cá voi

HA có cấu tạo của một glucoaminoglycan, gồm một mạch không phân nhánh chứa các chuỗi β-(1,4)-glucoronic acid và β-(1,3)-N-

acetylglucosamine sắp xếp một cách tuần tự tạo thành một dimer, mỗi dimer như vậy có khối lượng là 450 dalton Một phân tử HA có khoảng từ 1000 dimer như vậy Protein gắn với HA (HABP) liên kết với HA bằng nối H+, mỗi vị trí gắn HABP chứa khoảng 10 đơn vị dimer, phân tử HA phải chứa tối thiểu 20 đơn vị cho hai vị trí gắn

Hình 15: Cấu tạo hóa học của axit hyaluronic

HA chủ yếu do tế bào fibroblast và các tế bào liên kết mô tạo ra HA

ở dịch khớp đi vào trong huyết tương thông qua hệ thống bạch huyết và nhanh chóng rời khỏi máu bằng một cơ chế phụ thuộc receptor ở các tế bào biểu mô của gan và bằng hoạt động của enzyme hyaluronidase

HA được tìm thấy nhiều ở trạng thái liên kết với protein và chondroitin sulfate ở khoảng không giữa các tế bào của mô liên kết như da và nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc, ẩm độ của mô và bảo vệ, chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn Khả năng giữ nước tuyệt vời của HA cho phép nó có thể duy trì ẩm độ ở trong mắt, khớp nối và các mô

da

Vì không bền ở dạng axit nên HA thường được chiết xuất và tinh chế

ở dạng muối natri Natri hyaluronate có khả năng giữ nước cao và dung dịch muối hyaluronate có độ nhớt cao

Hình 16: Cấu tạo hóa học của muối hyaluronate

Trong lĩnh vực y dược, muối hyaluronate được sử dụng trong giải phẫu bệnh đục nhân mắt, là thuốc chữa bệnh viêm khớp (dạng tiêm), giảm thị lực…

ỨNG DỤNG:

HA-protein:

Khuôn xốp được tạo thành từ gelatin và hyaluronan bằng cách nhúng hỗn hợp gelatin, hyaluronan vào hỗn hợp aceton:nước theo tỉ lệ 9:1 cùng với một lượng nhỏ carbodiimide (EDC) để tạo liên kết chéo Vật liệu xốp được hình thành để phủ vết thương hoặc làm khuôn cho những ứng dụng nuôi cấy mô Khi được tẩm với sulfadiazine bạc, vật liệu trên có tác dụng làm lành vết thương ở chuột [14]

Vật liệu được làm từ collagen và hyaluronan bằng cách kết hợp các thành phần trên trong dung dịch axit acetic loãng Sau đó tạo liên kết chéo

với glyoxal hay periodate-oxidized dialdehyde Vật liệu này kháng được collagenase và cho phép tế bào fibroblast phát triển [14]

Bên cạnh đó, vật liệu làm từ hydroxyapatite-collagen-hyaluronan được tạo thành bằng cách thêm hydroxyapatite vào dung dịch hyaluronan Sau đó, trộn với các sợi collagen Vật liệu sau cùng có 90% hydroxyapatite, 9,2% collagen và 0,8% hyaluronan có tính tương hợp sinh học cao, được sử dụng để điều trị các tổn thương ở xương [14]

Hyaluronan-chitosan

Hỗn hợp hyaluronan và chitosan glutamate được tạo thành có độ nhớt cao, có khả năng mang và thải gentamycin Đây là sự kết hợp giữa khả năng bám dính tốt của hyaluronan với hiệu quả xâm nhập mạnh mẽ của chitosan Phức hợp này được tạo thành ngay trong môi trường axit và bền vững với một khoảng pH rộng Hỗn hợp cũng cho thấy khả năng bám dính, tăng sinh tế bào và làm lành vết thương [14]

1.3.4 EDC [1–ethyl–3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide]: [3]

Trong khi thiết kế màng phủ sinh học, các tác nhân khâu mạch có vai trò làm giảm tốc độ phân hủy của vật cấy ghép do nó tạo thành các liên kết chéo hóa học Có nhiều tác nhân khâu mạch như :

¾ Tác nhân vật lí: nhiệt, bức xạ ion hóa

¾ Tác nhân hóa học : formaldehyde, glutaraldehyde, carbodiimide…

Tuy nhiên, tính độc của các tác nhân khâu mạch có ảnh hưởng rất lớn trong việc phát triển các vật liệu sinh học Glutaraldehyde là tác nhân khâu mạch có hiệu quả, nhưng có tính độc cao khi thải vào cơ thể vật chủ sau quá trình phân hủy sinh học thậm chí ở nồng độ 3 ppm

Với tác nhân khâu mạch là 1–ethyl–3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) được biết là không có tính độc và tương hợp sinh học

do EDC không hợp nhất vào trong cấu trúc xốp được khâu mạch, mà chỉ biến đổi thành một dẫn xuất urea hòa tan trong nước Tính độc của dẫn xuất urea rất thấp so với EDC

EDC là dẫn xuất tan trong nước của carbodiimide Carbodiimide xúc tác sự tạo thành liên kết amide giữa axit carboxylic và hoặc nhóm phosphate và amine bằng cách hoạt hóa nhóm carboxyl hoặc nhóm phosphate hình thành dẫn xuất O-urea

EDC dễ bị mất hoạt tính trong môi trường nước nên thường sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan

Yêu cầu cần thiết của vật cấy ghép là cấu trúc lỗ bên trong xốp Cấu trúc lỗ có hai chức năng lâm sàng :

¾ Các kênh có lỗ là cổng vào cho sự di trú tế bào từ mô kề cận vào chất thịt của vật ghép hay đối với sự thấm dịch từ mạch máu xuất huyết gần kề

¾ Các lỗ sẽ tương tác đặc trưng với tế bào đang xâm lấn hay tương tác với các yếu tố đông máu khi máu chảy vào trong vật liệu (như miếng xốp cầm máu)

Các lỗ được tạo ra đầu tiên bằng đông tụ huyền phù loãng sợi collagen và sau đó thăng hoa tinh thể nước đá bằng cách phơi bày huyền phù với chân không ở nhiệt độ thấp Cấu trúc lỗ cuối cùng là mô hình âm tính của mạng lưới tinh thể nước đá, kích thước của lỗ giảm khi nhiệt độ đông giảm

1.4 Tế bào mầm của tủy xương: [6], [33]

Hình 17: Tế bào mầm của tủy xương quan sát dưới kính hiển vi

Một quần thể tế bào trong tủy xương chịu trách nhiệm trong việc hình thành tất cả các dạng tế bào máu khác nhau trong cơ thể là những tế bào mầm của mô tạo máu (HSC: hepatopoietic stem cell) HSC đã được nhận diện từ hơn 40 năm nay Ngoài ra, một quần thể tế bào khác trong tủy xương là quần thể tế bào nền của tủy xương (Bone marrow stromal cell) Những tế bào nền trong tủy xương là một hỗn hợp các quần thể tế bào có thể sản sinh

ra xương, sụn, mỡ, mô liên kết dạng sợi và hệ thống mạng lưới hỗ trợ cho sự hình thành những tế bào máu Những tế bào mầm trung mô của tủy xương (MSC: Mesenchymal stem cell) cũng có thể tạo ra những mô này và tạo thành cùng một quần thể tế bào như những tế bào nền tủy xương Gần đây, một quần thể những nguyên bào định hướng biệt hóa thành những tế bào nội mạc, một loại tế bào nằm lót trong mạch máu và được phân lập từ vòng tuần hoàn máu, được nhận biết là có nguồn gốc từ tủy xương Dù rằng những nguyên bào nội mạc giống với những nguyên bào mạch, loại tế bào tạo thành mạch máu trong quá trình phát triển của phôi, nhưng việc chúng có đại diện cho một quần thể tế bào mầm của tủy xương ở cá thể trưởng thành thật hay không vẫn còn là điều không chắc chắn Do đó, tủy xương dường như có

chứa 3 quần thể tế bào mầm là: HSC, MSC và có thể là cả nguyên bào nội

mạc

1.4.1 Tế bào mầm của mô tạo máu (HSC: Hematopoietic Stem Cell):

Tế bào máu là một trong những tế bào có khoảng thời gian sống ngắn nhất trong tất cả các loại tế bào của cơ thể (ví dụ tế bào hồng cầu không nhân chỉ sống được khoảng 120 ngày), cho nên cuộc sống của động vật phụ thuộc vào khả năng bổ sung liên tục những tế bào hồng cầu và những tế bào máu khác của cơ thể Quá trình bổ sung này xảy ra chủ yếu ở tủy xương nơi mà những HSC cư trú, phân chia và biệt hóa thành những loại tế bào máu Những HSC có khả năng tự làm mới và tạo ra tất cả các loại tế bào máu của

cơ thể Điều này có nghĩa là một HSC đơn có khả năng tái sinh ra một hệ tế bào tạo máu hoàn chỉnh Hơn nữa, chúng còn có khả năng tái sinh lại hệ thống mô tạo máu của động vật Cơ sở của kết luận này là một thử nghiệm trên đối tượng chuột nhắt Những con chuột này nhận liều phóng xạ gây tử vong để phá hủy hoàn toàn hệ thống mô tạo máu của bản thân chúng Sau đó, những HSC được cấy ghép vào tủy xương của chúng và hệ thống mô tạo máu của chúng được tái sinh trở lại

Cả vòng đời của HSC lẫn vòng đời của các loại tế bào máu đều bắt đầu từ tủy xương đến máu và quay trở lại tủy xương dưới ảnh hưởng của một loạt những yếu tố được tiết ra để điều hòa sự tăng sinh, biệt hóa và di trú của chúng

Những HSC được chứng minh là những tế bào mầm tạo máu lần đầu tiên trong một loạt thí nghiệm ở chuột và những tế bào mầm tạo máu tương tự cũng được chứng minh là có hiện diện ở người

Có hai loại HSC là HSC dài hạn (long-term HSC) và HSC ngắn hạn (short-term HSC) Những HSC dài hạn tăng sinh trong suốt đời sống của sinh

vật Ở con chuột nhắt còn non thì có khoảng từ 8-10% lượng HSC dài hạn bước vào chu trình tế bào và phân chia mỗi ngày Những HSC ngắn hạn thì chỉ tăng sinh trong một khoảng thời gian giới hạn có thể là vài tháng Những HSC dài hạn có hoạt động telomerase (telomerase là một enzyme giúp duy trì độ dài của đầu nhiễm sắc thể, mà chúng ta gọi là telomere, bằng cách thêm vào những nucleotide) ở mức cao Telomerase hoạt động là một đặc tính của những tế bào chưa biệt hóa, những tế bào đang phân chia và những tế bào ung thư Ở chuột nhắt, có khoảng 1 trong 10.000 hay 1 trong 15.000 tế bào của tủy xương là những HSC dài hạn Những HSC ngắn hạn biệt hóa thành nguyên bào bạch cầu và nguyên bào tủy, hai loại nguyên bào chính của những dòng tế bào máu Nguyên bào bạch cầu biệt hóa thành những dòng tế bào lympho T, những tế bào lympho B và tế bào tìm diệt tự nhiên (NK-Natural killer cell) Những cơ chế và con đường dẫn đến sự biệt hóa của chúng vẫn còn đang được nghiên cứu Nguyên bào tuỷ biệt hóa thành bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, bạch cầu ưa axit, bạch cầu ưa bazơ, tế bào có nhân khổng lồ cũng như hồng cầu Một nghiên cứu gần đây cho thấy những HSC ngắn hạn là một quần thể tế bào không đồng nhất và khác nhau đáng kể trong khái niệm về khả năng tự làm mới và tái phục hồi quần thể của hệ thống mô tạo máu

Trong điều kiện invivo, có nhiều yếu tố điều hòa sự biệt hóa của

những HSC trong tủy xương, đó là những cytokine Những cytokine này được tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau và sau đó được tập trung về tủy xương nhờ chất nền ngoại bào của những tế bào nền, nơi những tế bào máu được tạo thành Cho đến nay, hai cytokine được nghiên cứu nhiều nhất là yếu tố kích hoạt tạo quần thể bạch cầu hạt và đại thực bào (GM-CSF-Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) và interleukin-3 (IL-3) Những mối quan hệ giữa các tế bào với những phân tử đính vào chất nền ngoại bào của

tủy xương cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng sinh và biệt hóa mầm

tạo máu của tủy xương

1.4.2 Tế bào mầm trung mô của tủy xương (MSC: Messenchymal Stem Cell):

Những tế bào nền của tủy xương đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hóa các tế bào máu trưởng thành có nguồn gốc từ những tế bào mầm tạo máu của tủy xương Nhưng những tế bào nền này cũng có những chức năng quan trọng khác Để cung cấp môi trường vật lý cho sự biệt hóa của những HSC, những tế bào nền của tủy xương sản sinh ra sụn, xương và mỡ

Những tế bào nền của tủy xương có nhiều đặc điểm bên ngoài để phân biệt chúng với những HSC Hai loại tế bào này rất dễ phân lập trong

điều kiện in vitro Khi tủy xương được tách rời ra và hỗn hợp tế bào được trải

ra trên bề mặt nuôi cấy với mật độ thấp thì những tế bào nền của tủy xương bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy trong khi những HSC thì không

Trong những điều kiện in vitro đặc biệt, các tế bào nền của tủy xương

hình thành quần thể tế bào có dạng giống với nguyên bào sợi từ một tế bào đơn và được gọi là đơn vị hình thành quần thể F (colony forming unit-F CFU-F) Sau đó, những quần thể này có thể biệt hóa thành những tế bào mỡ hay chất nền làm giá đỡ cho tủy Đây là một kĩ thuật để chứng minh rằng những tế bào nền có bản chất giống tế bào mầm

Khác với HSC, là những tế bào không có khả năng phân chia trong

điều kiện in vitro hay chỉ tăng sinh trong một khoảng thời gian giới hạn, tế

bào nền của tủy xương có thể tăng sinh và đạt đến 35 lần nhân đôi trong điều

kiện in vitro Những tế bào nền của tủy xương sẽ tăng trưởng rất nhanh dưới

ảnh hưởng của những tác nhân gây ra sự phân bào như yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (Platelet-derived Growth Factor-PDGF), yếu tố tăng

trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor-EGF), yếu tố cơ bản tăng trưởng nguyên bào sợi (Basic Fibroblast Growth Factor-bFGF) và yếu tố tăng trưởng giống insulin 1 (Insulin-like Growth Factor-1 IGF-1)

Giống như HSC, những tế bào nền của tủy xương phát sinh từ trung phôi bì trong suốt quá trình phát triển mặc dù chưa có nguyên bào hay tế bào mầm đặc trưng nào của chúng được phân lập và xác định

Một giả thuyết được cho rằng những tế bào mầm này được để dành lại trong quá trình phát triển của thai và bị ngăn cản khỏi sự biệt hóa Một giả thuyết khác về nguồn gốc của chúng đó là một loại nguyên bào phổ biến có thể là một tế bào nội mạc nguyên thủy lót bên trong những mạch máu của phôi tạo ra cả những HSC và những nguyên bào của trung bì Nguyên bào của trung bì có thể biệt hóa thành nguyên bào cơ và những tế bào nền của

tủy xương Trong điều kiện in vivo, sự biệt hóa của những tế bào nền thành

tế bào xương đều khá phức tạp Những tế bào mỡ của tủy xương và những tế bào nền làm giá đỡ cho tủy đều có nguồn gốc từ tế bào nền của tủy xương và có thể được xem như những kiểu hình có thể hoán đổi được Những tế bào mỡ không phát triển cho đến khi con non được sinh ra Đó cũng chính là lúc xương lớn lên và không gian dành cho tủy mở rộng ra để điều tiết sự gia tăng của mô tạo máu Khi bộ xương ngừng tăng trưởng thì khối HSC sẽ giảm theo tuổi của động vật Lúc đó, những tế bào nền của tủy xương sẽ biệt hóa thành những tế bào mỡ để lấp đầy những chỗ trống Sự hình thành xương mới hiển nhiên là lớn hơn trong quá trình tăng trưởng của bộ xương mặc dù sự phát triển xương quay vòng trong suốt đời sống sinh vật Những tế bào hình thành xương là những nguyên cốt bào nhưng mối quan hệ của nó với chất nền của tủy xương thì chưa được biết đến rõ ràng Những lá xương mới nằm bên trong của xương sát với tủy cho nên có thể suy ra một cách hợp lí rằng chúng phát triển từ những tế bào nền của tủy xương Nhưng ở bề mặt ngoài của

xương cũng có sự quay vòng như cách mà xương hoạt động bên cạnh hệ Havers (hệ thống kênh có hình dạng cắt ngang là những vòng tròn đồng tâm nằm trong xương) Và không có bất cứ bề mặt nào của hệ này tiếp xúc với chất nền của tủy xương

1.5 Ứng dụng nuôi cấy tủy xương:

1.5.1 Ứng dụng nuôi cấy tủy xương trong y học [6]:

Những tế bào mầm là chìa khóa cho sự thay thế những tế bào đã mất trong rất nhiều căn bệnh có sức tàn phá lớn như bệnh Parkinson, bệnh tiểu đường, bệnh tim mãn tính, giai đoạn cuối của những bệnh về thận, sự hư hỏng gan và ung thư…

Đối với những bệnh ảnh hưởng tới tuổi thọ con người thì mục đích của các nhà khoa học và các nhà nghiên cứu là tìm cách thay thế những chu trình tự nhiên đã bị mất đi Nói cách khác, họ đang tìm cách sử dụng những tế bào mầm để phục hồi lại những chức năng đã mất dù chỉ là một phần nào đó

Ngoài ra, vì khả năng loại bỏ những tế bào mầm cấy ghép như một vật lạ của người nhận là rất cao nên các nhà khoa học và nghiên cứu còn đang tìm cách biến đổi những tế bào mầm cũng như biến đổi hệ miễn dịch của người bệnh Cả hai vấn đề trên là những điều kiện chính tất yếu để đạt được mục đích cuối cùng là phục hồi lại chức năng của cơ thể sống

1.5.2 Ứng dụng nuôi cấy tủy xương trong dược học [6]:

Những tế bào mầm sẵn sàng được khảo sát như một phương tiện để phân phát gen đến những mô đặc biệt trong cơ thể Những liệu pháp chữa bệnh dựa vào tế bào mầm là một lĩnh vực chính trong nghiên cứu về ung thư

Trong nhiều năm, các nhà sinh học đã sử dụng những tế bào mầm để phục hồi lại hệ máu và chức năng của hệ thống miễn dịch cho những bệnh nhân bị ung thư đã được điều trị bằng hóa trị cũng như bằng xạ trị

Trong tương lai, tế bào mầm (và những tế bào có nguồn gốc từ chúng) có thể được sử dụng để thử nghiệm hiệu quả của dược phẩm cũng như thử nghiệm một số liệu pháp trị bệnh khác Mặc dù những mẫu vật để thử là động vật và chúng là chỗ dựa chính cho những nghiên cứu dược học, nhưng không phải lúc nào thông qua mẫu thử này chúng ta cũng tiên đoán được những hiệu ứng của một loại thuốc có thể có trên những tế bào của người trong quá trình phát triển Những tế bào mầm chắc chắn sẽ được sử dụng để phát triển thành những tế bào gan chuyên hóa để đánh giá năng lực khử độc tiềm tàng của thuốc và đại diện cho một kiểu hệ thống cảnh báo mới sớm để ngăn chặn những phản ứng ngược và những phản ứng phụ trong cơ thể bệnh

nhân

1.5.3 Ứng dụng nuôi cấy tủy xương trong công nghệ mô:

1.5.3.1 Ứng dụng trong công nghệ mô xương nhân tạo [36], [37]:

Ứng dụng chủ yếu của nuôi cấy tủy xương trong công nghệ vật liệu là tạo ra các mô xương nhân tạo, nhằm giải quyết những bệnh gây ra do xâm nhiễm, mất đi nguồn tế bào máu hay một căn bệnh thường xảy ra ở người già, đó là bệnh loãng xương Trong nghiên cứu, người ta đã sử dụng các tế

bào trung mô của tủy xương, dựa vào sự lan tỏa của các tế bào này trong

môi trường nuôi cấy hai chiều để thu nhận một lượng lớn tế bào và từ đó đưa lên vật liệu được tạo thành bằng các sợi poly (L-lactic-co-glycolic acid) (PLLGA) và bổ sung các tác nhân tạo xương Ở đây, việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào xương là yếu tố tiên quyết cho sự thành công Sau đó, giải quyết các vấn đề như mật độ tế bào tốt nhất để cố định, ảnh hưởng của

môi trường tại thời điểm cố định tế bào, ảnh hưởng của các tác nhân mô tạo xương, những hạn chế của vật liệu khuôn ngoại bào khi nuôi cấy tế bào với các tác nhân trên Bất chấp những vấn đề phức tạp trên, các nhà khoa học đang từng ngày nỗ lực nghiên cứu, tạo ra các mô tương tự mô xương nhằm mục đích chữa bệnh

Một dự án khác sử dụng các tế bào tủy xương chuột nhằm mục đích thiết kế những mảnh ghép xương, từ đó giảm nhu cầu sử dụng mảnh ghép tự thân và mảnh ghép đồng loại Yêu cầu quan trọng là tìm kiếm một giàn giáo sinh học thích hợp cho tế bào bám dính và tăng sinh Nghiên cứu này sử dụng lỗ collagen để tạo ra mảnh ghép thay thế xương Collagen có sự cứng chắc và cấu trúc ổn định cho một số lượng lớn các mô trong cơ thể như da, mạch máu, gân, sụn và xương Như thế, đây là vật liệu lý tưởng để nghiên cứu tế bào tạo xương Sau khi thiết kế giàn giáo, người ta khảo sát sự bám dính, tăng sinh, sự tạo khuôn ngoại bào và sự khoáng hóa trên giàn giáo của các tế

bào tủy xương chuột

1.5.3.2 Ứng dụng trong công nghệ mô da nhân tạo [11]:

Các tế bào tủy xương không chỉ được sử dụng tạo ra các mô xương mà chúng còn được sử dụng trong nghiên cứu da nhân tạo bởi khả năng bám dính tốt, dễ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy ngắn của chúng

Hoạt động sinh học của giàn giáo sử dụng trong công nghệ mô tùy thuộc vào mật độ các liên kết, vị trí trên giàn giáo nơi mà diễn ra quá trình gắn của tế bào Sử dụng giàn giáo tạo bởi collagen-glucoaminoglycan (CG) cho việc nghiên cứu sự tái tạo da Giàn giáo trên không có hoạt tính khi kích thước trung bình của lỗ nhỏ hơn 20 µm hay lớn hơn 120 µm Để nghiên cứu mối quan hệ giữa khả năng bám dính, sống sót của tế bào và cấu trúc của giàn giáo, các giàn giáo CG được tạo thành với 4 kích cỡ lỗ khác nhau bằng