Nhân giống vô tính invitro

Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô tính truyền thống giâm, chiết, ghép, …

I Phần Mở Đầu

• Khái niệm về nhân giống invitro

• Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái

niệm chung cho tất cả các loại nguyên liệu

nuôi cấy thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật

trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

• Nhân giống vô tính invitro là quá trình sản xuất

một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận

cơ quan như: Chồi, mắt ngủ, vảycủ, thân lá …

Nhóm 1:Nhân giống vô tính

invitro

2 Tính cấp thiết của phương pháp nhân

giống vô tính in vitro:

• Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô tính

truyền thống giâm, chiết, ghép, …

• Nhưng các biện pháp đó ngày càng bộc lộ nhiều hạn chế : giống được nhân nhiều

lần bị thoái hóa giống, mắc nhiều bệnh

hơn, năng suất giảm, phân ly …

• Bằng biện pháp nhân giống invitro, với

công nghệ vô trùng cao đã khắc phục

được những hạn chế trên, nâng cao năng suất chất lượng của giống cây trồng cả về giá trị nông học và giá trị thương phẩm

• Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển nhân

giống invitro ngày nay là rất quan trọng

cần được chú trọng đầu tư.

3 Ưu điểm của phương pháp nhân giống

invitro

• Có hệ số nhân rất cao

• Có thể nhân giống ở quy mô công

nghiệp, đặc biệt đối với các đối tượng khó nhân bằng các phương pháp thông thường.

• Chủ động giống trong sản xuất

• Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh

• VD: khoai tây, dứa…

4 Nhược điểm của phương pháp invitro

• Chi phí cao hơn so với các phương pháp

nhân giống vô tính khác nên khó cạnh

tranh.

• Một số cây rất dễ bị biến dị khi nhân

giống invitro.

• Nhân giống invitro không thể áp dụng

trên tất cả các đối tượng.

II Cơ sở khoa học

• Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.

• Theo quan điểm của sinh học hiện đại: tính

toàn năng của tế bào thực vật tế bào là tế bào chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cơ thể thực vật.

• Sự hình thành và phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của

những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý thực vật và di truyền học phân tử:

• 1 Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế

bào thực vật cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách rời;

• 2 Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng hợp tử

tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình

lai tạo;

• 3 Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng chuyển gen để gây biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic

• 4 Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả năng ứng

dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao

để phục vụ cho công tác tạo giống;

• 5 Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast lai (cybrid);

• 6 Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô

tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính.

• 7 Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi

protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh một số cây trồng;

• 8 Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa;

• 9 Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng

nuôi cấy trong ống nghiệm;

• 10 Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà

không mất tính toàn thể của tế bào.

• III CÁC BƯỚC THỰC HIỆN

Bước 1: Nuôi cấy

y/c

Ngoại cảnh thích hợp

Bước o: chọn lọc và chuẩn bị cây

tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

Bước 1: nuôi cấy khởi động

• Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.

• Yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống

ccao, mô tồn tại, sinh trưởng phát triển tốt.

• Cần chý ý chọn đúng loại mô, đúng giai

đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ…)

• Cần xác định chế độ khử trùng mẫu thích hợp Thường dùng các chất: Hgcl2 0.1%

xử lý trong 5 – 10 phút

Bước 2: nhân nhanh

• Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng

thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi

bất định, và tạo phôi vô tính.

• Chú ý xác định điều kiện môi trường và

điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu

quả là cao nhất: Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích

thích tạo chồi, nhiều auxin sẽ kích thích ra

Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh

• Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường ra rễ.

• Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin Tuy nhiên có một số chồi có

thể phát sinh rễ ngay chuyển từ môi

trường nhân nhanh sang môi trường

không chứa chất điều tiết sinh trưởng.

• Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng hoặc có nồng độ xytokinin

thấp để phôi phát triển thành cây

Bước 4: thích ứng cây in vitro ngoài

điều kiện tự nhiên

• Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm

có tỷ lệ sống cao cần phải chú ý một số

điểm:

• Cây đạt tiêu chuẩn hình thái nhất định: số

lá, chiều cao cây, bộ rễ…)

• Có giá thể sạch, tơi xốp, thích hợp để tiếp nhận cây con in vitro.

• Chủ động điều chỉnh hàm lượng dinh

IV CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN

GIỐNG VÔ TÍNH

1 Hoạt hoá chồi nách

Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách, hay xảy ra khi nuôi cấy cây 2 lá mầm: khoai tây,

hoa cúc,…

Tạo cụm chồi từ chồi

đỉnh hoặc chồi nách, hay

gặp với cây 1 lá mầm: mía, lúa,…

2 Tạo chồi bất định-

Thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá

tế bào để bắt các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển

mô sẹo.

Ở cây 1 lá mầm: lan, dứa, hoa loa kèn,…

3 Tạo phôi vô tính

• Tương tự như tạo chồi bất định, nhưng

phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao

gồm cả chồi mầm và rễ mầm.

• Phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo.

Sự hình thành phôi vô tính có 2 bước:

Bước 1: phân hóa tế bào có khả năng phát sinh phôi ( thường là các tế bào nhỏ, nhân lớn nhiều hạch nhân,không có không bào,

tế bào chất đậm đặc, giàu protein và

mRNA Cần môi trường giàu auxin.

Bước 2: sự phát triển của những tế bào

phôi mới hình thành Môi trường nghèo

hoặc không có auxin ( nồng độ auxin cao kích thích hình thành phôi vô tính nhưng

ức chế quá trình phân hóa và phát triển

tiếp theo của phôi.

Từ việc tạo phôi vô tính người ta đã sản

xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

• Quy trình cụ thể như sau:

• Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi

trường dinh dưỡng với mật độ phù hợp và

bổ sung Na – alginate dược làm tan trong nước với nồng độ 2-4%.

• Dùng pipet nhỏ 100 – 150 µl huyền phù

nêu trên có chứa 1 phôi soma và dung

dịch Cacl2 (2-5%) Khi đó sẽ sinh ra phản ứng trao đổi ion Na – Ca và hạt nhân tạo được hình thành, có đủ độ cứng thích

hợp. ngâm trong nước làm cứng hạt.

• Dùng Ca – alginate thường hạt luôn luôn

ẩm ướt bề mặt, hiện nay người ta dùng 1 loại polymer Elvax (4260) để bao lớp

Chú ý

• Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải được

cơ giới hóa và không phụ thuộc vào

những thiết bị đắt tiền và nhất là thỏa mãn yêu cầu vô trùng.

4 Ngoài ra còn có phương pháp nhân giống qua tạo củ in vitro

Những công nghệ nới trong vi nhân

giống cây trồng

1 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng.

Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên môi trường không có đường nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2

VD: Phòng công nghệ tế bào viện sinh học nhiệt đới

đã tiến hành nuôi cấy mô quang tự dưỡng thành

công theo 2 phương pháp:

1 Trao đổi khí tự nhiên (khí trao đổi bằng cách

khuếch tán qua màng millipore hoặc nút giấy).

• Ưu điểm:

- Tốc độ sinh trưởng, chất lượnh và tỉ lệ

sống của mô thực vật được nâng cao ở tất cả các bước trong điều kiên tự dưỡng.

- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế.

- Tỉ lệ đột biến có thể được giảm.

- Tự động hóa =>giảm chi phí lao động.

2 Bioreactor

• Bioreactor là một hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học

• Là thiết bị mà trong đó sự biến đổi hóa sinh

được tiến hành bởi các tế bào sống hoặc các thành phần tế bào invivo Thường dùng để lên men lien tục, bán lien tục hay gján đoạn

• Có thể dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối

• Cũng có thể dùng trong nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống cây

• - Takayama và Miasawa là những người đầu

tiên sử dụng bioreactor vào nhân giống cây

trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa

ly, hoa lan hồ điệp

• - Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa

• VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất 100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch đó được đặt trên 1tấm

Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh.Bioreactor trong phòng Nuôi cấy mô tế bào và công nghệ tế bào thưc vật -Viện DT nông nghiệp

• Thuận lợi;

- Thể tích nuôi cấy tăng => sản xuất nhiều phôi,

chồi hơn mà không cần những kĩ thuật cao cấp

- Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí để duy trì

nuôi cấy gần như đồng dạng

- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi

cấy và môi trường vật lí có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng Điều này không thể thực hiện với hệ thống nuôi cấy bình tam giác

• Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm

• Ứng dụng:

- Tạo chồi: chuối, dứa, hoa lan

- Tạo củ invitro: khoai tây, lily

- Tạo phôi soma: cà phê, cao su

VD: Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quốc

Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo

Các bioreactor ứng dụng trong công nghiệp

V Ứng dụng

1 Trong nông nghiệp

• Sản xuất nhanh chóng các giống cây

trồng đáp ứng được nhu cầu về cây giống cao trong trồng trọt.

• Giống là một khâu rất quan trọng trong

sản xuất nông nghiệp Công tác giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn

gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển

chọn, thử nghiệm giống và nhân giống.

• Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào

thực vật nên ngày nay phần lớn các công việc này được thực hiện một cách khá

thuận lợi và nhanh chóng

• VD: chuối, khoai tây…

• Nhân giống ổn định chất lượng, năng suất cao phẩm chất tốt

• VD: Các cây trồng chuyển gen, con lai

• 2 Trong công nghiệp

• Dây chuyền sản xuất nhân nhanh các giống hoa cây cảnh phục vụ cho thị trường.

• VD: Nhờ nuôi cấy mô vào sản xuất các giống hoa như: tuylip, đồng tiền, hoa ly ở Hà Lan Sản xuất hoa lan ở Trung Quốc, đồng tiền ở Việt Nam, Cẩm Chướng …

• Cây hoa cẩm chướng đang ra hoa trong ống nghiệm - in vitro flowering

of Dianthus caryophyllus L

• Dây chuyền sản xuất giống cây con cung cấp cho thị trường, giảm giá thành sản phẩm.

• VD: sản xuất cây giống lâm nghiệp theo quy

mô công nghiệp: Bạch đàn, keo…

• 3 Trong y học

• Ứng dụng sản xuất nhanh sinh khối các cây dược liệu bằng thu sinh khối callus hoặc thể huyền phù.

• VD: nhân nhanh

sâm Triều Tiên…

nhân sâm Ngọc Linh

4 Trong nghiên cứu khoa học

• Phục tráng các giống cây quý hiếm nằm trong sách

đỏ

VD: Cây sưa - Dallbergia tonkinensis:

cây lan hài đỏ quí nhất Việt Nam

• Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết

một cách có hiệu quả công tác giống cây trồng mà còn mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di truyền thực vật, các cơ

thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà không

mất tính toàn thể của tế bào.

• Làm cơ sở cho các kỹ thuật di truyền khác

là khâu cuối cùng cho các công tác đánh giá giống.

Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô:

+ Hạn chế của vi nhân giống

+ Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây

trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng

vi nhân giống

+Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen.

+ Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy

và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa

• Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép

và nhân giống bằng hạt

• Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây

mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào

soma Kết quả là cây con không giữ được

các đặc tính quý của cây mẹ

• Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều

hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và

tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.

• Ngoài ra còn xảy ra hiện tượng nhiễm

mẫu.

VI Quy trình cụ thể

• Quy trình nhân giống hoa Lan bằng phương

pháp nuôi cấy in-vitro

• Lan là loại hoa vương giả, với vẻ đẹp

vương giả, quý phái nên khắp nơi trên thế giới ngày càng có nhiều người thích chơi hoa Lan Chính vì vậy, hoa Lan là sản

phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao

• Bắt kịp thị hiếu này, ngày nay đã xuất hiện nhiều cơ sở kinh doanh hoa Lan với nhiều chủng loại, giá cả khác nhau Do đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in- vitro tạo ra hàng loạt cây con ổn định về

mặt di truyền và đáp ứng giá cả phải

chăng là vô cùng hữu ích.

• Sau đây, chúng tôi xin giới thiệu quy trình

cơ bản nhân giống Lan bằng phương

pháp nuôi cấy mô in-vitro:

42

• Quy trình trên được tiến hành qua các giai

đoạn sau:

• 1 Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy:

• Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng

• Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng

bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong

dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy Mô được rửa

• Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng

và cẩn thận tách các lá non.

• Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn

700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô

trùng.

• Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh

sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi

trường nhân giống ban đầu.

• Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C -

260C và tuỳ vào mỗi loài

• Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi

• Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban

đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi

• Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần,

có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường

2 Nhân giống:

• Môi trường nhân giống thường là môi trường

MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung các

chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi

• Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên

giảm dần trong các lần cấy chuyển sau đó Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây Nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường