Ứng dụng phương pháp MABC (marker assisted backcrossing) nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại trong quy tụ gen chịu mặn Saltol đã được xác định trước trong giống lúa FL478

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Sinh học phân tử, Viện

Di truyền Nông nghiệp, đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện

đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam” của Viện Di truyền Nông nghiệp, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè, những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua

Học viên Trần Long

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới 3

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam 4

1.1.2.1 Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam 5

1.2 Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa 8

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa 8

1.2.2 Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn 10

1.2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn 10

1.2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn 11

1.2.2.3 Sự biểu hiện gen chống chịu mặn 11

1.3 Chỉ thị phân tử 12

1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử 12

1.3.2 Một số chỉ thị phân tử thường dùng 13

1.3.2.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) 13

1.3.2.2 Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS… 14

1.3.2.3 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại 15

1.4 Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử 17

1.4.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền 17

1.4.2 Nghiên cứu lập bản đồ di truyền 17

1.4.3 Trong chọn giống cây trồng 18 1.4.4 Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại

(Marker Assited Backcrossing - MABC) 20

1.5 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 22

1.5.1 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới 22

1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn 25

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.2 Nội dung nghiên cứu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 28

2.3.1.2 Phương pháp PCR với mồi SSR 28

2.3.1.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% 29

2.3.1.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 30

2.3.2 Phương pháp lai nhân tạo 31

2.3.3 Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 32

2.3.4 Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo 33

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số 37

3.2 Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ 38

3.3 Phân tích các cá thể BC bằng phương pháp MABC 41

3.3.1 Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1 (AS996/FL478 x AS996) 41

3.3.2 Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) 44 3.3.3 Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1

(AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) 45 3.3.4 Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọc 47 3.3.5 Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất

của các dòng chịu mặn 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms APS Ammonium Persulfate

BĐKH Biến đổi khí hậu

CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide

ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long

ĐBSH Đồng bằng Sông Hồng

dNTP Deoxynucleotide Triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

FAO Food and Agriculture Organization

GDP Gross Domestic Product

GGT Graphical Genotyper

IRRI International Rice Research Institute

LD-MAS Linkage Disequilibrium - MAS

MAS Marker-assisted selection

NST Nhiễm Sắc Thể

PCR Polymerase Chain Reaction

QTL Quantitative trait loci

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse Ribonuclease

SSR Simple Sequence Repeat

STR Short Tandem Repeats

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 4 Bảng 2 Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) 6 Bảng 3 Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1 20 Bảng 4 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR 28 Bảng 5 Chương trình chạy của phản ứng PCR 29 Bảng 6 Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) 34 Bảng 7 Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997) 35 Bảng 8 Tỷ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp thế hệ BC1F1 43 Bảng 9 Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 theo tiêu chuẩn IRRI,

1997 50 Bảng 10 Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội 51 Bảng 11 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng

thêm 1,0 m so với hiện nay 7

Hình 2 Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m 7

Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC) 36

Hình 4: Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose 37

Hình 5 Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 38

Hình 6 Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6% 39

Hình 7 Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5% 39

Hình 8 Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể quần thể AS996/FL478 40

Hình 9 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206 41

Hình 10 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793 41

Hình 11 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310 42

Hình 12 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639 42

Hình 13 Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10 43

Hình 14 Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412 44

Hình 15 Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM10793, và RM10711 44

Hình 16 Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206 và RM10694 45

Hình 17: Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm GGT2.0 46

Hình 18 Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn 47

Hình 19 Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) 48

Hình 20 Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=6 0 / 00 ) 49

MỞ ĐẦU

Lúa gạo cung cấp khoảng 32% tổng sản lượng lương thực Châu Á Mỗi năm toàn thế giới cung cấp khoảng 729 triệu tấn gạo, trong đó chỉ tính riêng khu vực Châu Á là 661 triệu tấn [15] Biến đổi khí hậu toàn cầu là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực thế giới Với hơn 3000km bờ biển, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển Việt Nam chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển Theo thống

kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha [1]

và năm 2013, chỉ tính riêng trên đồng bằng song Cửu Long là khoảng 740.000 ha Đồng bằng sông Cửu Long là vùng tạo ra 40% GDP nông nghiệp của cả nước So với

cả nước, sản lượng lương thực vùng chiếm 50%, thủy sản chiến 70% Tuy nhiên, Đồng bằng sông Cửu Long lại được xem là vùng sẽ phải chịu tác động của biến đổi khí hậu nhiều nhất và những tác động này sẽ ảnh hưởng rất lớn đến an ninh lương thực Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, và hệ lụy của nó là nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012, nếu mực nước biển dâng 1m, sẽ

có khoảng 39% diện tích đồng bằng sông Cửu Long, trên 10% diện tích vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, trên 2,5% diện tích thuộc các tỉnh ven biển miền Trung và trên 20% diện tích Thành phố Hồ Chí Minh có nguy cơ bị ngập; gần 35% dân số thuộc các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, trên 9% dân số vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, gần 9% dân số các tỉnh ven biển miền Trung và khoảng 7% dân số Thành phố Hồ Chí Minh bị ảnh hưởng trực tiếp; trên 4% hệ thống đường sắt, trên 9% hệ thống quốc lộ và khoảng 12% hệ thống tỉnh lộ của Việt Nam sẽ bị ảnh hưởng [2]

Để giải quyết những khó khăn này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là

rất cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng

phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ

thị phân tử kết hợp với lai trở lại trong quy tụ gen chịu mặn Saltol đã được xác định

trước trong giống lúa FL478 vào giống lúa AS996 đang được trồng phổ biến tại

Việt Nam để tạo ra dòng AS996 – Saltol đáp ứng nhu cầu về giống chịu mặn trong

sản xuất lúa gạo

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới

Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí hậu toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm Nguyên nhân của những biến đổi này là do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt trời,

và gần đây có thêm hoạt động tác động của con người

Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của một khu vực mà là vấn đề toàn cầu Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới Nhiệt độ tăng, mực nước biển dâng cao, sẽ gây hiện tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và các hệ thống kinh tế -

xã hội trong tương lai (Ứng phó với biến đổi khí hậu và biển dâng, 2009)

Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng quan trọng Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất thấp hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Thái lan, Bangladesh, Ấn Độ Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn khi mực nước biển dâng cao, cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng được cả tình trạng ngập nước lẫn độ mặn cao Theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau [15] Điều này là nghiêm trọng hơn kể từ khi các khu vực tưới tiêu có trách nhiệm bảo đảm một phần ba sản xuất lương thực thế giới

Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km2 rừng đước sẽ bị ngập, 10.000km2 đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn, 21,5 triệu ha đât canh tác phải đối mặt với vấn đề nhiễm mặn, và ước tính gây thiệt hại lên tới 50% đất trồng trọt toàn cầu vào khoảng giữa thế kỷ 21 [28]

Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), 6 triệu người phải di dời và 4.500km2 đất nông nghiệp

bị ngập và nhiễm mặn Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông nghiệp bị ngập, ảnh

hưởng đến 11% dân số Theo ước tính của Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) mỗi năm nông dân Ấn Độ và Bangladesh bị thiệt hại tới 4 triệu tấn thóc do lũ lụt, do nhiều giống lúa chỉ chịu ngập trong vòng chưa đầy một tuần Còn ở Maldives hơn 80% diện tích đất thấp hơn mực nước biển và có thể bị ngập, mặn khi nước biển dâng cao [39]

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề do mực nước biển dâng Nước biển dâng thì phần lớn đất màu mỡ nhất của Việt Nam sẽ bị ngập mặn Theo đó, sản lượng lúa có thể giảm đáng kể do mực nước biển dâng cao và sự thay đổi lượng mưa làm thay đổi thủy văn ở các vùng đồng bằng Do chúng ta có bờ biển dài hơn 3.620 km, 28 tỉnh, thành phố giáp biển nên mực nước biển dâng cao sẽ làm giảm lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển

Bảng 1 Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999

nghiêm trọng nhất bởi mực nước biển dâng, dẫn đến sự xâm nhiễm mặn ngày càng gia tăng, chủ yếu là Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng Sông Cửu Long Mặn là hiện tượng liên kết với nước biển dâng mang nước mặn tiến sâu vào đất liền, biến nhiều vùng đất trồng lúa bị mặn hóa [3]

1.1.2.1 Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam

Đất nhiễm mặn là loại đất có chứa nhiều cation Na+ hấp phụ trên bề mặt keo đất và trong dung dịch đất [1;2] Đất chứa nhiều Na+ dưới dạng muối tan NaCl,

Na2SO4 nên áp suất thẩm thấu dung dịch đất lớn làm ảnh hưởng tới quá trình hút nước và dinh dưỡng cây trồng Hoạt động của vi sinh vật đất yếu

Sự hình thành đất nhiễm mặn do 2 nguyên nhân chủ yếu là ảnh hưởng của nước ngầm hay do ảnh hưởng của nước biển mặn theo trủy triều tràn vào

Ở Việt Nam, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở 2 vùng châu thổ lớn là ĐBSH và ĐBSCL Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông vào đất liền ở ĐBSH chỉ khoảng 15km, nhưng ở vùng ĐBSCL lại có thể xâm nhập tới 40 – 50 km (FAO, 2012) [16]

Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng sông Cửu Long:

Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012 [2] dự báo khoảng 7.600km2 (tương đương 20% diện tích) ĐBSCL sẽ chìm khi nước biển dâng 75cm

và ở mức 100cm thì phạm vi ngập trải rộng trên diện tích 15.116km2, tương đương 37,8% diện tích tự nhiên toàn vùng Dự báo vào năm 2030, khoảng 45% đất của ĐBSCL có nguy cơ nhiễm mặn cục bộ Nhiễm mặn gây hại rất lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa, trung bình năng suất lúa có thể giảm 20-25%, thậm chí tới 50%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến canh tác 3 vụ mùa, sản lượng lương thực

bị mất đi đáng kể, đe dọa an ninh lương thực quốc gia

Nước ta có khoảng 1 triệu ha đất nhiễm mặn, trong đó có 2 vùng nhiễm mặn lớn là vùng châu thổ sông Hồng và vùng lúa ĐBSCL ĐBSCL có diện tích tự nhiên

là 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, trong đó diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng 2,9 triệu ha, đất sản xuất lâm nghiệp là 430.770 ha, đất khác chiếm 277.000 ha và đất chuyên dùng khoảng 262.682 ha [3]

ĐBSCL bị chia cắt bởi hệ thống sông tự nhiên kết hợp với hệ thống sông ngòi chằng chịt đã tạo thành hệ thống thủy lợi cung cấp nước cho sản xuất nông

nghiệp, thau chua rửa mặn và cũng là hệ thống vận chuyển đường thủy tốt, rất thuận lợi cho vận chuyển hàng hóa, nông sản Mùa lũ thường kéo dài 5 tháng với lượng nước chiếm khoảng 3/4 tổng lượng nước cả năm, và 7 tháng mùa khô cạn, lượng nước còn lại rất ít Do đó, thủy triều có ảnh hưởng rất lớn đến phần lớn vùng hạ lưu sông Mekong, toàn bộ ĐBSCL vào mùa khô Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay ít phụ thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từng vùng Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện cùng với kỳ triều cường trong tháng, nước biển càng mặn, càng vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và ít có nước thượng nguồn đổ về [3]

Mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâm nhập của nước biển, và tùy vào mùa trong năm, cao điểm vào các tháng có lượng mưa thấp, khoảng tháng 3 – 4 dương lịch Qua chuỗi số lượng thực đo 10 năm (1991 – 2000) ở ĐBSCL [4] đã phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặn ứng với các trị số: 0,4 g/l; 2 g/l; 4 g/l; 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô, tìm ra diễn biến mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm) của thời đoạn

10 năm trên ĐBSCL diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l chiếm 2.126.635 ha (Bảng 1.2)

ĐBSCL có khoảng 1,8 – 2,1 triệu ha đất tự nhiên chịu ảnh hưởng mặn tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Kiên Giang, Tiền Giang, Trà Vinh và Sóc Trăng, phần lớn là đất bị nhiễm mặn kết hợp với phèn, ngập nước [3]

Hình 1 Diện tích và nồng độ mă ̣n vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng

thêm 1,0 m so với hiện nay

Vùng đất nhiễm mặn Đồng bằng Sông Hồng

Hình 2 Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh

ứng với mực nước biển dâng cao 1m

Nước biển dâng là một quá trình liên tục, nếu chúng ta không có biện pháp ngăn chặn quyết liệt thì quá trình càng ngày càng nhanh Ảnh hưởng của nó là khôn

lường, cần có sự chuẩn bị ứng phó đúng mức và ngay từ bây giờ

Các vùng lúa nhiễm mặn ở vùng ĐBSH thuộc các tỉnh như: Thái Bình, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn khoảng 20.000ha ở hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ 0,3 – 0,5%, chủ yếu tập trung tại các huyện như: Kiến Thụy, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, Vinh Bảo,… Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy, Tiền Hải, Kiến Xương,… Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện như Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy,

… Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000ha đất nhiễm mặn ở các huyện như Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung, … riêng huyện Hậu Lộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005 Các giống lúa mùa địa phương trước đây thường được gieo trồng là: Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha Gần đây một số giống lúa chịu mặn trung bình như: Mộc Tuyền, X21, Xỉ, X19, VD97, VD920 cho năng suất khá cao nhưng có dạng hình yếu, ít chịu phân, cao cây, lá lướt [6]

1.2 Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúa

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa

Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá

là cây nhiễm trung bình với mặn Vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước, những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa [9] Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích luỹ quá nhiều ion Cl [11] Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, nguyên nhân gây tổn hại cho cây lúa trong môi trường mặn là do tích luỹ quá nhiều ion Na+ và ion này trực tiếp gây độc trên cây trồng, làm cho Cl- trở thành ion trơ nên phổ kháng của cây tương đối rộng (Yeo và Flower, 1996) Như vậy, sự tổn hại ở cây lúa trên đất mặn là do cây hấp thu quá dư cả ion Na+ và Cl- [42]

Ảnh hưởng của Na+ là phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na - K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt Cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na - K tốt trong chồi Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn [36] Tuy thế việc khám phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát được

Mặn gây hại trên cây trồng bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những

lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kế tiếp và cứ thế tiếp diễn Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy trì sự sống và xanh Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tương ứng với mức độ thiệt hại [20]

Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt thời gian nảy mầm, trở nên rất nhiễm ở giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), tiếp tục chống chịu trong giai đoạn sinh sản dinh dưỡng, kế đến nhiễm suốt trong giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [36] Tuy thế, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trổ, cây lúa không mẫn cảm với mặn [9] Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải được chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của lúa

Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [11], [28] Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977) Yeo và Flower (1984) đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung như sau:

+ Hiện tượng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lượng muối dư thừa nhờ hiện tượng hấp thu có chọn lọc

+ Hiện tượng tái hấp thu - Cây hấp thu một lượng muối thừa nhưng được tái hấp thu trong mô libe Na+ không chuyển vị đến chồi thân

+ Chuyển vị từ rễ đến chồi - Tính trạng chống chịu mặn được phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho

sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi

+ Hiện tượng ngăn cách từ lá đến lá - Lượng muối dư thừa được chuyển từ lá non sang lá già, muối được định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngược lại

+ Chống chịu ở mô: Cây hấp thu muối và được ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hưởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trưởng của cây

+ Ảnh hưởng pha loãng - Cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi

1.2.2 Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn

1.2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lƣợng tính chống chịu mặn

Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trường là tính trạng di truyền số lượng Tính trạng số lượng được định nghĩa một cách kinh điển là tính trạng có phân bố liên tục (Continuous distribution), tính trạng này được điều khiển bởi nhiều QTL, mỗi QTL có một ảnh hưởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu

Cho đến nay trên thế giới đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu sự di truyền của tính chống chịu mặn Theo Mishra và ctv, 1998: Tính trạng chống chịu mặn là một tính trạng di truyền đa gen, không di truyền theo dòng mẹ (không do các gen trong tế bào chất quy định) [29]

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng được yêu cầu của người chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Gregorio và Senadrina, 2002)[19] Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa tính trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện mặn được điều khiển bởi những gen cộng tính (Mishra và ctv, 1990)[30]

1.2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn

Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhưng công trình nghiên cứu kinh điển

về sự di truyền phân tử tính chống chịu mặn

Dựa vào bản đồ QTL trên cơ sở tính chống chịu mặn là tính trạng mục tiêu

do đa gen điều khiển, sử dụng chỉ thị AFLP và STS các nhà khoa học đã cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn được định vị trên Nhiễm sắc thể

số 1 và được gọi là gen Saltol

Bản đồ QTL được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (thí dụ như tính chống chịu mặn) Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những Locut riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng chỉ thị phủ trên toàn bộ nhiễm thể trong hệ gen cây trồng sẽ cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm thể

và xác định các gen mục tiêu [7]

Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của những tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, các vị trí, những ảnh hưởng của gen và hoạt động của những Locut bao gồm tương tác gen (Epistasis) và tương tác QTL x

E (môi trường) Một mục đích khác của bản đồ QTL là xác định những chỉ thị mang tính chẩn đoán đối với những kiểu hình đặc thù nào đó, sao cho việc ứng dụng trở nên có hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn dòng (giống) chống chịu khô hạn, chống chịu mặn, v.v Mục tiêu lâu dài của thí nghiệm về bản đồ QTL là “tách dòng” các gen điều khiển tính trạng số lượng vô cùng phức tạp, thông qua tiếp cận kỹ thuật

“map-based cloning” [6]

1.2.2.3 Sự biểu hiện gen chống chịu mặn

Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh lý thực vật, hàng loạt ảnh hưởng ức chế do mặn cho thấy rằng thực vật tự bảo vệ mình khỏi những thiệt hại do mặn gây ra theo

mô hình phản ứng oxy hóa, tránh thiếu hụt nước, tăng cường hấp thụ ion trong chu trình quang hợp [13] Sự thể hiện gen chống chịu mặn xét về lĩnh vực sinh học phân

tử là một khám phá vô cùng thú vị Tín hiệu được truyền vào tế bào, các gen có chức năng chuyên môn được khởi động và hàng loạt các qúa trình phiên mã, dịch

mã xảy ra [1]

Các biểu hiện của cây khi gặp điều kiện mặn bao gồm những triệu chứng chính là: Trắng đầu lá sau đó cháy Lá vàng và chết hoặc sinh trưởng còi cọc, đẻ nhánh kém, lép hạt, rễ phát triển kém…

1.3 Chỉ thị phân tử

1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử

Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu, đánh giá sự có mặt của gen kháng làm cơ sở chính xác cho chọn lọc các cá thể mang tính trạng mong muốn đã trở nên đơn giản hơn

Chỉ thị phân tử (hay chỉ thị phân tử ADN) là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN Nó có thể là những dòng phân tử ADN có sẵn hay dưới dạng thông tin

về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP )

Đặc điểm chung của chỉ thị phân tử là, cho nhiều đa hình, là chỉ thị trội hoặc đồng trội Nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại “đơn Locut–nhiều alen”, biểu hiện đa hình 1 cách trung tính, không phụ thuộc vào mô, cơ quan (hay bộ phận cần tách chiết ADN ra để khảo sát), không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường Bên cạnh đó, chỉ thị phân tử có số lượng vô cùng lớn

Việc sử dụng chỉ thị phân tử ADN có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh, dễ dàng tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một chỉ thị ADN liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó Chỉ thị phân tử còn có thể đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật Ngoài việc loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của một Locut hoặc giữa các Locut khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng, tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra

kiểu hình, số lượng các chỉ thị phân tử còn cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống

phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các

alen, các chủng sinh lý gây bệnh Đây là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm

Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính:

Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR

Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại Thực chất nhóm chỉ thị này cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do có bản chất là chuỗi lặp lại nên được xếp vào 1 nhóm riêng

Các chỉ thị phân tử ADN thường có tên gọi theo tên kỹ thuật tương ứng như: RFLP, STS, AFLP, CAPS, RAPD, SSR… Tuỳ vào mục đích nghiên cứu mà chỉ thị nào sẽ được sử dụng Về cơ bản, chúng ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị phân tử nào trong nghiên cứu đa hình và lập bản đồ phân tử Ngoài ra, cũng có thể sử dụng những thông tin về trình tự ADN trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các sinh vật Tuy nhiên một chỉ thị tối ưu cần đảm bảo sự gắn kết chặt giữa chỉ thị và tính trạng hay vùng quyết định tính trạng, phải có đa hình, có khả năng lặp lại được, phải dễ sử dụng và phải có khả năng phân tích hàng loạt số lượng lớn

Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN hệ gen đặc hiệu trong cấu trúc Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò

Như vậy nguyên lý cơ bản của chỉ thị RFLP dựa trên kỹ thuật lai Southern

(cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn, điện di ADN trên gel agarose, biến tính ADN, trung hòa, chuyển ADN lên màng lai, cố định ADN trên màng lai, lai với mẫu dò đã được đánh dấu)

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một Locut gen Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử Aa Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị RFLP

Chỉ thị RFLP cho kết quả rất chính xác, do đó người ta sử dụng nó để kiểm tra các loại chỉ thị phân tử khác

Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh

1.3.2.2 Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS…

Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADNs)

Loại chỉ thị này được sinh ra bởi phản ứng PCR để nhân những đoạn ADN

hệ gen Chỉ thị RAPD sử dụng những đoạn mồi ngẫu nhiên (random primers), dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 37o C) Lưu ý là phản ứng PCR trong trường hợp RAPD chỉ sử dụng mồi đơn lẻ, nghĩa là mỗi phản ứng chỉ sử dụng 1 mồi (vừa là mồi thuận vừa là mồi nghịch) Do mồi ngẫu nhiên có chiều dài

10 nucleotide, nên trên suốt chiều dài của hệ gen, trung bình cứ khoảng 410 (≈106) nucleotide lại bắt gặp 1 vị trí mà mồi ngẫu nhiên xác định có thể kết cặp được

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP (Zabeau và ctv, 1993) có thể phát hiện được sự có mặt của những đoạn cắt giới hạn thuộc bất kỳ loại ADN nào [38] Vì thế, loại chỉ thị này được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen Nguyên lý của kỹ thuật dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen Nghĩa là AFLP có 2 công đoạn chính:

Cắt ADN hệ gen thành những đoạn ngắn bằng enzym giới hạn

Nhân bội các đoạn ADN chọn lọc bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị nhiều nhất so với các kỹ thuật khác, có thể áp dụng cho tất cả các thực vật, động vật Lượng ADN tổng số tiêu tốn

cho kỹ thuật này lại rất ít Đây là một phương pháp có hiệu quả rất cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen Tuy nhiên, mặt hạn chế của loại chỉ thị di truyền này là ở chỗ nó thuộc loại chỉ thị trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và thể dị hợp Ngoài ra nó có giá thành tương đối cao

Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Vị trí đƣợc xác định bởi trình tự)

Chỉ thị STS do M Olson và cộng sự đề xuất năm 1989 STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong hệ gen [27]

STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những Locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh, sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành dễ dàng Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài

1.3.2.3 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại

Trình tự lặp lại có kế tiếp (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi Thực ra, một số chuỗi lặp lại cũng thuộc loại chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN như chỉ thị vi vệ tinh Tuy nhiên, do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng

Tiểu vệ tinh (Minisatellite)

Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotid trở lên (thường vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3kb Không giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour và Jeffreys) Có 2 loại ADN tiểu

vệ tinh Đó là ADN đầu mút NST và ADN tiểu vệ tinh siêu biến ADN đầu mút NST nằm ở tận cùng của vai NST, gồm một vài kilobase ADN tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng cận đầu mút NST (subtelomeric regions) (Napvi N.I và ctv, 1995)[32]

Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates = SSR)

Vi vệ tinh, hay ở thực vật còn gọi là Simple Sequence Repeates – SSR (ở người và động vật, người ta gọi “vi vệ tinh” là “Short Tandem Repeats” - STR) là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến

6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn vài chục lần SSR đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của tất cả các Eukaryota khác

Các “vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật Những kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở thực vật, vi vệ tinh mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lại giàu vi vệ tinh kiểu (GT)n hơn Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau Như vậy vùng “vi vệ tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác Người ta lợi dụng đặc điểm này để thiết kế mồi SSR nằm ở 2 đầu gần kề với đoạn lặp lại

Ưu điểm của chỉ thị SSR:

1.4 Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử

1.4.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể Nghiên cứu đa dạng di truyền còn giúp đánh giá nguồn tài nguyên di truyền của tập đoàn giống cây trồng, vật nuôi, giúp cho việc sử dụng nguồn tài nguyên di truyền hiệu quả hơn Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ (cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn)

Một số chương trình phân tích đa dạng di truyền

NTSYS: Rất phổ biến Sử dụng các thông số “1” hay “+” (có mặt), và “0” hay “-“ (vắng mặt) Có thể dùng chương trình NTSYS cho các chỉ thị phân tử RAPD, AFLP hay các chỉ thị “trội’ khác

PopGene: Tương đối phổ biến Sử dụng các thông số “1” (có mặt) và “0” (vắng mặt) trong trường hợp chỉ thị di truyền là “trội”, hoặc các thông số AA, BB,

CC, AB, AC, BC trong trường hợp chỉ thị di truyền là “đồng trội” Ngoài ra, PopGene còn được sử dụng trong trường hợp cần đánh giá những mẫu vật của nhiều quần thể hoặc nhóm các quần thể

1.4.2 Nghiên cứu lập bản đồ di truyền

Bản đồ di truyền phân tử được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP ) Trong quá trình giảm phân, các gen trên cùng NST thường được phân ly cùng nhau như một nhóm liên kết gen Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn do kết quả của quá trình trao đổi chéo giữa các NST tương đồng Kết quả của hiện tượng này là sự tái tổ hợp giữa các gen trong một cặp NST hay giữa các nhiễm sắc thể Tần số trao đổi chéo giữa hai gen nào đó phản ánh khoảng cách di truyền giữa chúng và cho phép lập bản đồ di truyền của NST biểu thị vị trí tương đối của các gen [7] Sự liên kết của những gen nằm trên cùng một NST được trình bày thành một bản đồ liên kết hay bản đồ NST thể hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền

kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên kết được coi là đơn vị bản đồ, nó được xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ

hợp, trong đó 1 centiMorgan (cM) tương đương với 1% tái tổ hợp Bản đồ di truyền phân tử được lập trên cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm soát các tính trạng nghiên cứu Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể nghiên cứu thể hiện ở kiểu hình Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ thị liên kết gen Khoảng cách di truyền giữa các chỉ thị và gen được thể hiện bằng tần số tái tổ hợp giữa chúng

1.4.3 Trong chọn giống cây trồng

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của

cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị

“may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection - MAS) với mục đích sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:

Kiểu gen của các Locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể

Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân

tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp

Bert Collard & David Mackill đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với Locut mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN (ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy [14]

MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu điểm nổi bật là: đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình; tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc; rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt; có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3; không bị ảnh hưởng của môi trường; có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình [6]

Theo E Francia, 2005, sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố: bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm; mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs; sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả

Có 2 kiểu chỉ thị có thể ứng dụng trong MAS Một là chỉ thị phân tử được định

vị ngay trong phạm vi gen quan tâm Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này Hai là nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng với gen quan tâm Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS (Linkage Disequilibrium -MAS)

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với nhiều ưu điểm:

Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong

quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả

và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang)

Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc)

Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy

có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

1.4.4 Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assited Backcrossing - MABC)

Trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục qua 5-

6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được [31]

Trong trường hợp có một giống cây trồng ưu tú nhưng cần đưa thêm một vài gen mong muốn vào giống đó, người ta sử dụng quy trình lai trở lại (trở lại) nhiều lần với giống ưu tú nhằm thu được một giống cây trồng mới mang gen mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên nền di truyền của giống ưu tú Theo quy trình chọn giống lai trở lại truyền thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ trở lại mới thu được cây mang gen mong muốn nhưng giữ được gần 100% nền gen di truyền của giống ưu tú (bảng 3)

Bảng 3 Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen

của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1

Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc nền di truyền của dòng cho thông qua phân tích toàn bộ hệ gen bằng chỉ thị phân tử (Thomson và ctv., 2010)[40] Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ

Ưu điểm chính của phương pháp MABC là:

(1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với Locut gen đích

(2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp

(3) Tiến gần đến Locut quan tâm trên bản đồ liên kết

(4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng [38] Ngoài ra, thông qua phương pháp này, tốc độ của quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp

đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường

Chọn giống trở lại nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu hình Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt

1.5 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

1.5.1 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới

Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng về năng suất, chất lượng gạo tốt, kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), từ năm 1977 - 1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chống chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm Những giống lúa cải tiến này cho năng suất cao hơn những giống lúa cổ truyền 2 tấn/ha

Tác giả Gregorio và cộng sự (2002), báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao cây, cảm quang, yếu rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo xấu), tác giả đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởng mạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng

và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali Giống lúa TCCP226-2-49-B-B-3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều Trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [19]

Cho tới nay, rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến (Gregorio và cs, 2002; Negrao và cs, 2011) Một số giống lúa địa phương có nguồn gốc từ các vùng duyên hải Đông Á có tính kháng mặn cao như giống Nona Bokra (Ấn độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn độ), SR26B, Damodar, Cheriviruppu, Pat và Solla (Ấn độ), Ketumbar (In đô nê xi a),

Khao Seetha (Thái Lan), các giống thể hiện tính kháng mặn trên đều thuộc nhóm

Indica Hơn nữa theo số liệu cập nhật mới nhất, một số dòng giống thuộc nhóm Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn vượt trội cao

hơn cả các giống lúa Pokkali và Nona Bokra [19, 33]

Đối với nhóm Japonica, ít dòng giống thể hiện tính kháng mặn hơn nhóm

Indica Một số giống thuộc các nước ôn đới có tính chịu mặn khá như giống Harra

(Tây ban Nha), Agami (Ai cập), và Daeyabyeo (Hàn quốc) Các giống Japonica

nhiệt đới như giống Moroberekan mang tính kháng mặn cao, có nguồn gốc ở Guinea nơi đất canh tác ảnh hưởng ngập mặn Giống này đã được nghiên cứu và sử dụng làm cây cho gen kháng mặn và lập bản đồ quần thể [24] Các giống lúa thuộc

họ Oryza glaberrima, phần lớn được trồng ở Tây Phi thể hiện tính kháng mặn ít hơn các giống lúa thuộc họ Oryza sativa [8]

Để hiểu sâu hơn về các tính di truyền kiểm soát khả năng chịu mặn của các giống lúa, việc xác định các QTLs liên quan đến tính kháng mặn là rất cần thiết Danh sách các QTL liên quan đến tính chịu mặn ở lúa có thể tìm được trên trang web Gramene (http://www.gramene.org) Đặc biệt các thông tin chi tiết về các QTLs liên quan đến tính kháng mặn ở lúa có thể tra cứu tại trang dữ liệu TropGene (http://tropenesdb,cirad.fr) Phần lớn các quần thể được sử dụng để lập bản đồ QTL

là sử dụng quần thể indica lai với Japonica chẳng hạn như IR64 lai với Azucena hoặc Co29 x Moroberekan Hơn nữa phần lớn các nghiên cứu đều lập bản đồ quần thể RIL, DH hoặc F2:3 Tuy nhiên gần đây Kim và cs đã sử dụng quần thể lai trở lại thì quy tụ được QTL chịu mặn nhanh chóng hơn [24] Các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa thể hiện do các gen phức hợp kiểm soát Các QTL liên quan đã được xác định trên các nhiễm sắc thể 1, 4, 6 và 7 Hiện vẫn chưa có QTL thể hiện tính chịu mặn được tìm thấy trên nhiễm sắc thể 8 và 11, và một số ít QTL

đã xác định trên nhiễm sắc thể 2, 3, 5, 9, 10 và 12 [21,37,39] Nhờ ứng dụng các công nghệ, kỹ thuật tiên tiến như phương pháp MAS và MABC các nhà khoa học

đã chuyển được các QTLs/gen liên quan đến tính chịu mặn vào các giống lúa cải tiến.[23,37]

Trong các năm từ 1969-1984, riêng các nhà khoa hoc thuộc viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã sàng lọc và đánh giá khả năng kháng mặn của hơn 100.000 giống lúa thu thập từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới Trong đó trên 20%

giống có khả năng chịu mặn khá Các giống lúa bản địa thu thập ở khu vực vùng duyên hải Nam Á có tính chịu mặn cao chẳng hạn giống Nona Bokra, Cheriviruppu, SR26B, Solla (Ấn độ), Ketumbar (Indonesia), Khao Seetha (Thái lan), hay giống Sóc nâu (Việt nam) Đặc biệt giống Hawasi nguồn gôc từ Saudi Arabia có khả năng chịu mặn lớn hơn cả các giống chịu mặn Pokkali và Nona Bokra [17, 33]

Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chống chịu mặn từ Pokkali vào một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu mặn bằng phương pháp trở lại vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp lai tạo truyền thống là cần nhiều thời gian để tạo ra một giống lúa chống chịu mặn tốt Thông thường thì 6 – 8 lần trở lại cần được thực hiện, tương đương với 3 – 4 năm lai tạo Một khó khăn khác thường gặp trong lai tạo giống mới

là đôi khi có mối quan hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con lai cùng lúc Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trường hợp kéo dài

10 – 15 năm để phát triển một giống lúa mới (Collard và Mackill, 2008)[12] Việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen (QTL) của tính trạng chống chịu mặn Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn bởi điều kiện môi trường ngoại cảnh Theo Islam (2011) thì do hệ số

di truyền của tính chống chịu mặn thấp (nhỏ hơn 19,18%), nên tính chống chịu mặn của các dòng con lai không cao như bố mẹ có gen chống chịu mặn như trường hợp của giống Pokkali [22]

Sự phát triển của chỉ thị phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu của Gregorio (1997); Bonille và ctv (2002) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất

chi tiết cho QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng

40 – 65% tính chống chịu mặn của lúa [20, 10, 35]

Trong số các chỉ thị phân tử thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế Sự phát triển của marker phân tử

và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập

được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” nằm trên nhiễm sắc thể số 1, quyết

định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn của lúa [20, 35]

1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn

Việt Nam mới có rất ít nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn Một số giống lúa chịu mặn trồng ở các vùng ven biển Việt Nam như Cườm, Nhộng, Tẻ Tép, Tẻ Đỏ, Chiêm Bầu, Cút Hương năng suất thấp, chỉ đạt 18 - 20 tạ /ha Là những giống địa phương cho năng suất thấp

Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống Các giống lúa CM1, CM5, là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [1]

Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm được 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện tính chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Một số giống lúa mới của Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như: OM5629, OM5891, OM4900 đã được phát triển năng suất có thể đạt từ 5-6 tấn/ha dưới điều kiện bất lợi do nhiễm mặn từ 6.0 đến 9.0 dS/m, các giống này hiện đang được phát triển và mở rộng qui mô Kết quả đã tạo ra các dạng thử nghiệm tại nhiều địa điểm khác nhau trên cánh đồng trong 3 năm từ 2009 đến

2011 và những tác động ban đầu của chúng đã đang được tiếp tục khảo nghiệm, xác định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu mặn và năng suất [34]

Lã Hoàng Anh và cộng sự đã tìm ra 10 QTL liên quan đến tính chống chịu mặn trên giống Chành Trụi, nằm trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 6, 7, 9 Trong đó

QTL trên nhiễm sắc thể số 4 được xác định là QTL chính quy định tính chống chịu mặn của giống [25]

Đề tài “Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu

mặn” của tôi được tiến hành trong khuôn khổ của dự án hợp tác quốc tế VN-Đan

Mạch nhằm “tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam”, được thực hiện chính tại

Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Giống nhận gen: là giống AS996 hạt dài, ngắn ngày, chất lượng gạo trung

bình, năng suất khá cao được trồng phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Giống cho gen là: giống FL478 được nhập nội từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc

tế, mang Locut gen chịu mặn Saltol Vùng Locut gen Saltol ở giống FL478 với vị trí

từ 10,6 đến 11,5 Mb trên NST số một gồm một số QTL quy định 45%-60% tính chống chịu mặn ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa, chúng đóng vai trò đặc biệt trong việc điều khiển tính nội cân bằng giữa tỉ lệ Na+/K+ cùng với sự có mặt

của các allen khác của giống gốc Pokkali trong vùng Locut gen Saltol đã được các

nhà khoa học tại IRRI chứng minh là sẽ mang phần lớn tính chống chịu mặn có thể dùng được cho các chương trình chọn tạo giống bằng sinh học phân tử [3]

Giống lúa đối chứng nhiễm (giống mẫn cảm với điều kiện mặn) trong thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn là giống IR29 nhập nội từ IRRI

Hóa chất: 500 chỉ thị SSR trải đều trên 12 NST của lúa (Hãng Bioneer – Hàn Quốc); các hóa chất cho PCR (Hãng Fermentas – Mỹ); hóa chất tách chiết AND (Hãng Sigma – Mỹ); hóa chất chạy gel (Hãng Merk – Đức)

Thiết bị máy móc sử dụng thuộc bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp

Phần mềm GGT2.0 để phân tính gen của các cá thể tái tổ hợp

Thời gian thực hiện: năm 2012 -2014

2.2 Nội dung nghiên cứu

Sàng lọc chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ trên 12 nhiễm sắc thể

Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết gen chịu mặn Saltol để chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn Saltol trong các thế hệ quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1.

Sử dụng chỉ thị phân tử nằm về hai phía gen Saltol để chọn lọc dòng tái tổ

hợp trong các thế hệ quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1

Chọn lọc các dòng mang gen chịu mặn và chứa phần lớn nền di truyền của giống nhận gen AS996 bằng chỉ thị phân tử