Ứng dụng phương pháp MABC (marker assisted backcrossing) nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven b

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Lưu Minh Cúc, người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã dạy dỗ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Sinh học phân tử, Viện

Di truyền Nông nghiệp, đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện

đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng bằng ven biển Việt Nam” của Viện Di truyền Nông nghiệp, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè, những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua

Học viên

Trần Long

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và

Việt Nam 3

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới 3

1.1.2 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam

Error! Bookmark not defined

1.1.2.1 Các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam Error! Bookmark not defined

1.2 Những nghiên cứu về tính chống chịu mặn ở cây lúaError! Bookmark not defined

1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa Error! Bookmark not defined

1.2.2 Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn Error! Bookmark not defined

1.2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặnError! Bookmark not

defined

1.2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặnError! Bookmark not

defined

1.2.2.3 Sự biểu hiện gen chống chịu mặn Error! Bookmark not defined

1.3 Chỉ thị phân tử Error! Bookmark not defined

1.3.1 Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử Error! Bookmark not defined

1.3.2 Một số chỉ thị phân tử thường dùng Error! Bookmark not defined

1.3.2.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)Error! Bookmark not

defined

1.3.2.2 Chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Chỉ thị

RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị STS… Error! Bookmark not defined

1.3.2.3 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lạiError! Bookmark

not defined

1.4 Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử Error! Bookmark not defined

1.4.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền Error! Bookmark not defined 1.4.2 Nghiên cứu lập bản đồ di truyền Error! Bookmark not defined 1.4.3 Trong chọn giống cây trồng Error! Bookmark not defined 1.4.4 Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại

(Marker Assited Backcrossing - MABC) Error! Bookmark not defined

1.5 Một số kết quả trong chọn tạo giống lúa chịu mặnError! Bookmark not defined

1.5.1 Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới

Error! Bookmark not defined

1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam và tình hình chọn giống lúa chịu mặn

Error! Bookmark not defined CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.1 Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số Error! Bookmark not defined 2.3.1.2 Phương pháp PCR với mồi SSR Error! Bookmark not defined 2.3.1.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%Error! Bookmark not defined 2.3.1.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamideError! Bookmark not defined

2.3.2 Phương pháp lai nhân tạo Error! Bookmark not defined 2.3.3 Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) trong chọn tạo giống lúa chịu mặn Error! Bookmark not defined 2.3.4 Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo Error! Bookmark not defined 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNError! Bookmark not defined

3.1 Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số Error! Bookmark not defined

3.2 Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ Error! Bookmark not defined 3.3 Phân tích các cá thể BC bằng phương pháp MABCError! Bookmark not defined

3.3.1 Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC1F1

(AS996/FL478 x AS996) Error! Bookmark not defined 3.3.2 Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1

(AS996/FL478/AS996/ AS996) Error! Bookmark not defined 3.3.3 Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1

(AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) Error! Bookmark not defined 3.3.4 Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dòng chọn lọcError! Bookmark not

defined

3.3.5 Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất

của các dòng chịu mặn Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 4 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms

BĐKH Biến đổi khí hậu

CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide

ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long

ĐBSH Đồng bằng Sông Hồng

dNTP Deoxynucleotide Triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

FAO Food and Agriculture Organization

GDP Gross Domestic Product

GGT Graphical Genotyper

IRRI International Rice Research Institute

LD-MAS Linkage Disequilibrium - MAS

MAS Marker-assisted selection

PCR Polymerase Chain Reaction

QTL Quantitative trait loci

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse Ribonuclease

SSR Simple Sequence Repeat

STR Short Tandem Repeats

STS Sequence-Tagged Sites

TEMED Tetramethylethylenediamine

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 Error!

Bookmark not defined

Bảng 2 Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000) Error! Bookmark

not defined

Bảng 3 Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú

(nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1 Error! Bookmark not

defined

Bảng 4 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR Error!

Bookmark not defined

Bảng 5 Chương trình chạy của phản ứng PCR Error! Bookmark not defined

Bảng 6 Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida (Yoshida và ctv, 1976)

Error! Bookmark not defined

Bảng 7 Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997)Error! Bookmark not

defined

Bảng 8 Tỷ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp thế hệ BC1F1 43 Bảng 9 Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 theo tiêu chuẩn IRRI,

1997 50 Bảng 10 Đặc tính nông sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội 51 Bảng 11 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản nước biển dâng

thêm 1,0 m so với hiện nay 7

Hình 2 Bản đồ nguy cơ ngập vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m 7

Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC) 36

Hình 4: Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose 37

Hình 5 Các chỉ thị liên kết gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 38

Hình 6 Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 6% 39

Hình 7 Đánh giá đa hình các giống bố mẹ trên gel polyacrylamide 4.5% 39

Hình 8 Bản đồ di truyền các chỉ thị SSR được sử dụng cho phân tích các cá thể quần thể AS996/FL478 40

Hình 9 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị AP3206 41

Hình 10 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM10793 41

Hình 11 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310 42

Hình 12 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639 42

Hình 13 Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và 10 43

Hình 14 Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM3412 44

Hình 15 Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị RM10793, và RM10711 44

Hình 16 Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206 và RM10694 45

Hình 17: Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần mềm GGT2.0 46

Hình 18 Các dòng thí nghiệm BC3F3 trước khi thử mặn 47

Hình 19 Đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) 48

Hình 20 Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dòng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=6 0 / 00 ) 49

MỞ ĐẦU

Lúa gạo cung cấp khoảng 32% tổng sản lượng lương thực Châu Á Mỗi năm toàn thế giới cung cấp khoảng 729 triệu tấn gạo, trong đó chỉ tính riêng khu vực Châu Á là 661 triệu tấn [15] Biến đổi khí hậu toàn cầu là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực thế giới Với hơn 3000km bờ biển, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển Việt Nam chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển Theo thống

kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha [1]

và năm 2013, chỉ tính riêng trên đồng bằng song Cửu Long là khoảng 740.000 ha Đồng bằng sông Cửu Long là vùng tạo ra 40% GDP nông nghiệp của cả nước So với

cả nước, sản lượng lương thực vùng chiếm 50%, thủy sản chiến 70% Tuy nhiên, Đồng bằng sông Cửu Long lại được xem là vùng sẽ phải chịu tác động của biến đổi khí hậu nhiều nhất và những tác động này sẽ ảnh hưởng rất lớn đến an ninh lương thực Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, và hệ lụy của nó là nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

Theo kịch bản biến đổi khí hậu năm 2012, nếu mực nước biển dâng 1m, sẽ

có khoảng 39% diện tích đồng bằng sông Cửu Long, trên 10% diện tích vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, trên 2,5% diện tích thuộc các tỉnh ven biển miền Trung và trên 20% diện tích Thành phố Hồ Chí Minh có nguy cơ bị ngập; gần 35% dân số thuộc các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, trên 9% dân số vùng đồng bằng sông Hồng và Quảng Ninh, gần 9% dân số các tỉnh ven biển miền Trung và khoảng 7% dân số Thành phố Hồ Chí Minh bị ảnh hưởng trực tiếp; trên 4% hệ thống đường sắt, trên 9% hệ thống quốc lộ và khoảng 12% hệ thống tỉnh lộ của Việt Nam sẽ bị ảnh hưởng [2]

Để giải quyết những khó khăn này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là

rất cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng

phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ

thị phân tử kết hợp với lai trở lại trong quy tụ gen chịu mặn Saltol đã được xác định

trước trong giống lúa FL478 vào giống lúa AS996 đang được trồng phổ biến tại

Việt Nam để tạo ra dòng AS996 – Saltol đáp ứng nhu cầu về giống chịu mặn trong

sản xuất lúa gạo

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới

Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí hậu toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm Nguyên nhân của những biến đổi này là do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt trời,

và gần đây có thêm hoạt động tác động của con người

Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của một khu vực mà là vấn đề toàn cầu Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới Nhiệt độ tăng, mực nước biển dâng cao, sẽ gây hiện tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và các hệ thống kinh tế -

xã hội trong tương lai (Ứng phó với biến đổi khí hậu và biển dâng, 2009)

Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng quan trọng Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất thấp hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Thái lan, Bangladesh, Ấn Độ Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn khi mực nước biển dâng cao, cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng được cả tình trạng ngập nước lẫn độ mặn cao Theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác nhau [15] Điều này là nghiêm trọng hơn kể từ khi các khu vực tưới tiêu có trách nhiệm bảo đảm một phần ba sản xuất lương thực thế giới

Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km2 rừng đước sẽ bị ngập, 10.000km2 đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn, 21,5 triệu ha đât canh tác phải đối mặt với vấn đề nhiễm mặn, và ước tính gây thiệt hại lên tới 50% đất trồng trọt toàn cầu vào khoảng giữa thế kỷ 21 [28]

Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), 6 triệu người phải di dời và 4.500km2

đất nông nghiệp

bị ngập và nhiễm mặn Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông nghiệp bị ngập, ảnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1 Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa

chịu mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học và Công nghệ Hạt nhân, 4/2005, Tr 28-30

2 Bộ Tài nguyên Môi trường (2012), Kịch bản Biến đổi khí hậu nước biển dâng cho Việt Nam

3 Tăng Thị Hạnh, Dương Thị Hồng Mai, Trần Văn Luyện, Phạm Văn Cường, Lê Khả Tường, Phan Thị Nga (2011), “Nghiên cứu khả năng chịu mặn của một số nguồn gen lúa lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia”

4 Lê Sâm (2003), Xâm nhập mặn ở đồng bằng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp

5 Lê Duy Thành (1999), “Kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó trong chọn

giống thực vật”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Tr 156-158

6 Nguyễn Thị Tâm và cs (2008), “Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa OM4498, VND 95-20, IR64, CR203 ở mức độ mô sẹo bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ

7 Lê Thị Thu Trang (2011), “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen

liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam”, Tạp chí Khoa hoc Công nghệ

Tài liệu tiếng Anh

8 Awala, S.K., Nanhapo P.I., Sakagami, J., Kanyomeka, L., and Iijima,

M (2010), “Differential salinity tolerance among Oryza glaberrima, Oryza sativa and their Interspecies including NERICA”, Plant Prod Sc 13 (1), pp 3-10

9 Aslam, M., Qureshi R H., and Ahmad (1993), “Mechanisms of

salinity tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Department of soil science and physiology, University of Agriculture, Pakistan

10 Bonille P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K and Gregorio G.(2002),

“RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of rice

(Oryza sativa L.) using recombinant inbred lines”, Philipp Agric Sci, 85, pp 64–76

11 Akbar M, GS Khush, D HilleRisLambers (1985), “Genetics of salt

tolerance”, Rice Genetics, IRRI Philippines, pp 399-409