Lập bản đồ di truyền Xác định gen bệnh

Nguyen Thi Hong VanDepartment of Genetics – HUS Lập bản đồ di truyền và xác định các gen bệnh ở người Chương 2 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics – HUS Nội dung chương Lập bản

Trang 1

Nguyen Thi Hong Van

Department of Genetics – HUS

Lập bản đồ di truyền và xác định

các gen bệnh ở người

Chương 2

Nội dung chương

Lập bản đồ di truyền các gen quy định tính trạng theo Mendel

Thể tái tổ hợp và thể không tái tổ hợp

Các chỉ thị di truyền

Lập bản đồ hai điểm

Lập bản đồ đa điểm

Xác định các gen bệnh ở người

Nguyên lý và chiến lược xác định các gen bệnh

Chiến lược xác định gen bệnh không phụ thuộc vị trí

Tách dòng vị trí

Sử dụng các bất thường nst

Các ví dụ về việc xác định gen bệnh

Lập bản đồ di truyền các gen quy định tính trạng theo Mendel

Department of Genetics – HUS 13_01.jpg

Trang 2

13_04.jpg

13_06.jpg

13_08.jpg

Trang 3

13_11.jpg

2.1 Nguyên lý và chiến lược xác định các gen bệnh

 Mọi cách xác định các gen bệnh đều tập trung vào gen ứng viên

(candicate gene).

 Kiểm tra gen ứng viên bằng việc sàng lọc các đột biến ở các bệnh nhân.

 Chỉ ra vùng nhiễm sắc thể ứng viên và xác định gen ứng viên.

 Từ 30000 gen người  bằng tách dòng vị trí  xác định vùng ứng viên mang 10 – 30 gen.

 Sau khi xác định gen  xác định nguyên nhân gây bệnh.

 VD: mất chức năng của protein FMR1  chậm phát triển tâm thần;

đột biến ở vùng bám TATA  mất điều hòa gai tiểu não SCA17

Cách xác định gen bệnh ở người

2.2 Chiến lược xác định gen bệnh không phụ thuộc vị trí

Dựa vào thông tin sản phẩm protein

Xác định gen bệnh qua mô hình động vật

Sử dụng hiểu biết về trình tự ADN không phụ thuộc vị trí

2.2.1 Xác định gen bệnh dựa vào thông tin sản phẩm

protein

 Xác định protein bằng các kỹ thuật proteomic: định lượng, giải trình

tự protein

 Dựa vào trình tự mã hóa cDNA  tổng hợp mẫu dò oligonucleotide

 sàng lọc thư viện để khôi phục trình tự cDNA

 mẫu dò pải là trình tự oligonucleotide suy diễn  tăng cơ hội

xác định trình tự đích đúng

 Sàng lọc thư viện gen

 Sử dụng các oligonucleotide thoái hóa làm mồi PCR

 Lai cDNA đích vào một vector; thực hiện PCR với một mồi đặc

thù vector và một mồi đặc hiệu protein

 Sử dụng kháng thể với protein để tìm gen đích.

 dựa vào thư viện biểu hiện cDNA

 tạo ra protein hoặc một phần protein

2.2.2 Xác định gen bệnh qua mô hình động vật

Sử dụng mô hình động vật: chuột đột biến mang bệnh tương tự bệnh ở người

tách dòng gen chuột và kiểm tra trình tự tương đồng ở người

hoặc: xác định gen bệnh ở chuột  phân lập trình tự tương đồng ở người  lập bản đồ gen bằng FISH

VD: xác định gen MITF gây hội chứng Waardenburg type 2 (điếc, thay đổi sắc tố da, tóc và mắt)

Xét nghiệm gen trực tiếp ở bệnh nhân

VD: SOX10 gene

Trang 4

trí

khi bệnh do đột biến ở một gen đã biết

Tiến hành các thí nghiệm thử nghiệm biểu hiện gen

phân lập mRNA từ các bệnh nhân và đối chứng

so sánh trình tự để liệt kê một loạt các gen thay đổi mô

hình biểu hiện ở bệnh

VD: tách dòng gen chứa các đoạn lặp ba nucleotide mới

(gây các bệnh về hệ thần kinh di truyền)

2.3 Tách dòng vị trí

Khi chưa có thông tin về gen, ngoại trừ vị trí tương đối của nó trên nhiễm sắc thể

Áp dụng đối với các gen mã hóa: liên quan bệnh u hạt mãn tính liên kết nst X (tế bào bạch cầu mất khả năng tiêu diệt vi khuẩn, các yếu tố gây bệnh); xơ nang (cystic fibrosis), bệnh Huntington,

14_02.jpg

Logic của việc tách dòng vị trí

14_03.jpg

The difficult path from candidate region to gene.

2.3.1 Tách dòng vị trí:

Bước 1: xác định vùng ứng viên càng hẹp càng tốt

 Phụ thuộc vào kíc thước của vùng ứng viên

  thu hẹp vùng này càng nhiều càng tốt.

 Phân tích liên kết gen: 100 sản phẩm giảm phân có thông tin giúp

định vị bệnh di truyền theo Mendel tới một vùng ứng viên khoảng

1Mb (= 1cM)

 Hạn chế về độ phân giải: lập bản đồ các thể tái tổ hợp giữa các chỉ

thị gần nhàu, quyết định bởi các haplotype đang xem xét (Hình

14.4).

 Xác định ranh giới vùng ứng viên dựa vào các thể tái tổ hợp đơn

 Các kiểu hình không theo Mendel: phân tích liên kết không chính

xác (~20 cM hoặc hơn)  sử dụng cân bằng kép liên kết để thu hẹp

vùng nghiên cứu

Xác định vùng ứng viên nhỏ nhất bằng việc xem xét các haplotype Phả hệ minh họa bệnh da di truyền trội (Darier - White), trước đó được lập bản đồ

ở nst 12q Haplotype 12 q chỉ thị phân ly cùng với bệnh được tô vàng, hộp nền xám chỉ các haplotype ở người đã chết.

Trang 5

14_04_2.jpg

2.3.2 Tách dòng vị trí: xét nghiệm đột biến

Tìm kiếm các gen thể hiện mô hình biểu hiện và/hoặc chức năng phù hợp từ danh sách các gen ứng viên

Tìm kiếm dạng tương đồng với gen đã biết là có chức năng và/hoặc biểu hiện tương tự hoặc các thể đột biến

có kiểu hình liên quan

2.3.2.1 Các gen có sự biểu hiện phù hợp

Gen ứng viên có mô hình biểu hiện phù hợp với kiểu

hình bệnh

được biểu hiện ở cùng thời điểm và vị trí nơi quan sát thấy

tình trạng bệnh lý

Kiểm tra bằng RT-PCR, Nothern bloting hoặc SAGE

(serial analysis gene expression – phân tích biểu hiện

gen hàng loạt)

Lai tại chỗ với mRNA ở các phần cắt mô hoặc nhuộm

hóa mô miễn dịch (IHC) với các kháng thể đánh dấu –

thể hiện mô hìn biểu hiện

Nghiên cứu ở các mô chuột  suy diễn ra các mô

người

14_05.jpg

Sử dụng trình duyệt hệ gen để liệt kê các gen trong vùng ứng viên

Trên hình là các gen được dự đoán và khẳng định trong vùng 1Mb của nhiễm sắc thể 6p21.1

2.3.2.2 Các gen thể hiện chức năng phù hợp

Khi biết chức năng của gen trong vùng ứng viên 

khẳng định được gen có phải là ứng viên hay không

Với các gen mới: Phân tích trình tự để biết chức năng

của gen (VD: các domain xuyên màng, các motif

tyrosine kinase )

Dựa vào mối quan hệ chức năng gần gũi với một gen đã

biết liên quan đến bệnh

gen mã hóa thụ thể – gen mã hóa ligand của nó

gen mã hóa các thành phần tương tác trong mooyj con

đường chuyển hóa hoặc phát triển

2.3.2.3 Sự tương đồng với một gen paralog

Gen ứng viên là một gen tương đồng gần của một gen

đã biết (gen paralog ở người hoặc ortholog ở các loài khác)

Đột biến ở gen tương đồng gây nên kiểu hình liên quan

 gen mới trở thành gen ứng viên

VD: sau khi fibrillin được xác định là gen bị đột biến ở hội chứng Marfan  gen paralog của nó FNB2 được xác định nằm ở nst 5q

hội chứng co màng nhện não (Contractural arachnodactyly) được xác định nằm ở cùng vùng 5q

Trang 6

2.3.2.4Sự tương đồng với một gen ortholog liên quan

Các trình tự tương đồng về cấu trúc và chức năng giữa

các loài có quan hệ xa, VD: người, cá ngựa, ruồi giấm,

C elegans, nấm men

Không chỉ trình tự gen, các con đường cũng thể hiện

tính bảo thủ cao

VD: các con đường phát triển hoặc điều hòa ở các

sinh vật mô hình được sử dụng để dự đoán các con

đường ở người

14_06.jpg

con đường phát triển ở người: gen LHX2

Loài người có một gen giúp ruồi giấm có cánh bình thường

Thể đột biến ruồi giấm không cánh (A) có thể được phục hồi thành dạng có cánh bởi gen kiểu dại của ruồi giấm (B) hoặc bởi gen

LHX2 của người (C)

Các đoạn bảo thủ giữa nst 6 ở người

(Hsa6) và nst chuột (Mmu)

2.4 Sử dụng các đột biến nhiễm sắc thể

Để định vị gen bệnh

VD: ở dạng rải rác, các thể đột biến trội nghiêm trọng:

các dạng sai hỏng nst cung cấp phương pháp xác định gen ứng viên  xác định vị trí chính xác

Các đột biến nst cân bằng (chuyển đoạn hoặc đảo đoạn)

là rất hữu ích

Các đột biến nst quan sát được (mất đoạn, chuyển đoạn) rất có giá trị

Các đột biến nst cân bằng(1)

 Thường không ảnh hưởng đến kiểu hình của thể mang

 Có thể ảnh hưởng, do:

 sự phát hiện trùng khớp giữa kiểu hình bất thường và đột biến

nst

 sự tái sắp xếp nst thực ra ko cân bằng: mất hoặc thêm vật chất

di truyền

 chứa điểm đứt gãy nst gây bệnh

 kiểu hình mất chức năng

 kiểu hình giành chức năng (tạo nên gen mới)

 dễ định vị gen bệnh

 Các bất thường cân bằng là có giá trị, dựa vào các điểm đứt gãy đặc thù

 Điểm đứt gãy chuyển đoạn  mất chức năng của một trong hai bản sao

của gen

  không có tác động kiểu hình nếu nồng độ sản phẩm bình thường vẫn

đủ

14_09.jpg

Sử dụng FISH để xác định vị trí đứt gãy chuyển đoạn Chuyển đoạn được xác định nhờ

di truyền tế bào t(8;16)(p22;q21)

Bản đồ vật lý một phần vùng đứt gãy trrrn nst số 8 bình thường (thể hiện vị trí của 7 dòng)

Các kết quả thí nghiệm FISH thành công.

Các điểm đứt gãy nằm trong trình tự ở dòng D,

Trang 7

Các đột biến nst cân bằng (2)

Các chuyển đoạn giữa nstX- nst thường ở nữ:

Sự bất hoạt X là ngẫu nhiên

Các tế bào mang X chuyển đoạn bị bất hoạt phải chịu sự

mất cân bằng di truyền gây chết

Thể mang là nữ có chuyển đoạn gồm toàn bộ các tế bào

chứa nst X bình thường bị bất hoạt

 không có bản sao có hoạt tính chức năng của gen

CD: chuyển đoạn X;21 thường gặp  gen DMD (bệnh

loạn dưỡng cơ Duchene) được xác định nằm ở Xp21

14_10.jpg

Sự bất hoạt X không ngẫu nhiên xảy ra ở bệnh nhân nữ bị DMD mang chuyển đoạn Xp21- nst thường Chuyển đoạn cân bằng, nhưng điểm đứt gãy nst X làm phá vỡ gen dystrophine gene (hộp màu đỏ) Sự bất hoạt X là ngẫu nhiên, nhưng các tế bào bất hoạt X mang chuyển đoạn bị chết bởi sự mất cân bằng di truyền

Phôi phát triển hoàn toàn từ các tế bào mà X bình thường bị bất hoạt, dẫn đến người phụ nữ không có gen dystrophine có chức năng bình thường Do vậy dẫn đến bệnh DMD.

14_11.jpg

A balanced 5;8 translocation disrupts the NSD1 gene in a patient

with Sotos syndrome

Các bệnh liên kết mất đoạn nst

Các vùng mất đoạn toàn bộ  là công cụ xác định nhiều gen bệnh

Tách dòng tính trừ (Subtraction cloning) được sử dụng

để phân lập các dòng từ ADN bình tường tương ứng với các trình tự bị mất ở bệnh nhân

xác định mất đoạn Xp21 từ bệnh nhân DMD

sử dụng mất đoạn liên quan gen PHEX bị đột biến ở bệnh còi xương do kháng vitamin D  lập bản đồ di truyền gen này trên đoạn nhỏ ở cánh ngắn nst X

Các bệnh liên kết mất đoạn nst

Mất đoạn nhỏ: gây ra nhiều hội chứng di truyền

Vùng mất đoạn nhỏ  có giá trị xác định các gen bệnh

Khẳng định các mất đoạn nghi ngờ bằng FISH hoặc điện

di gel trường xung (pulsed field gel electrophoresis) và

Southern blotting

NSD1 microdeletion demonstrated by FISH in a patient with Sotos syndrome.

Two homologs of chromosome 5 are identify by the red FISH probe that recognizes a sequence on 5pter The green probe is a BAC from 5qter

containing NSD1 gene; this sequence is

lacking on one copy of chromosome 5.

Trang 8

5 Khẳng định gen ứng viên

Gen ứng viên phải được kiểm tra để xác định đột biến ở

gen đó có gây bệnh hay không

Các cách kiểm tra :

Sàng lọc đột biến

Khôi phục kiểu hình bình thường in vitro

Tạo nên mô hình chuột bệnh

Sau khi khẳng định, tìm hiểu chức năng của gen ứng

viên

Sàng lọc đột biến để kiểm tra gen ứng viên

có khả năng áp dụng, tương đối nhanh

Nếu tỷ lệ bệnh nhân mang các đột biến độc lập là đủ lớn

 tiến hành sàng lọc đôt biến liên quan đến bệnh

VD: mất chức năng gen  bệnh liên kết X hoặc trội trên nst thường

Kiểm tra bằng các quy trình sàng lọc đột biến

18_01.jpg

Phát hiện đột biến bằng giải trình tự

Double peak shows a heterozygous mutation 332CT

18_01_2.jpg

Đột biến mất 1 nuceleotide A 3659delA Trình tự phía sau vị trí mất bị nhiễu, cho thấy trình tự trùm nhau của hai alen ở thể dị hợp tử

16_01.jpg

Các đột biến mất chức năng ở gen PAX3 (trong hội chứng Waardenburg Type 1)

10 exon được biểu diễn bằng các hộp

(DNA binding domains)

18_03.jpg

Sàng lọ đột biến ở gen CFTR (A) Phân tích heteroduplex và SSCP.

(B) Điện di gel gradient biến tính (Denaturing gradient gel electrophoresis)

Trang 9

biến tính

Đường xanh: người nam bị ảnh

hưởng

Đường đỏ: đối chứng bình thường

Giải trình tự cho thấy đột biến ở vị

trí cắt nối 738+1GT

Sàng lọc đột biến DMD sử dụng protein truncation test (PTT) Phản ứng cặp đôi phiên mã – dịch mã được sử dụng để tạo ra các sản phẩm polypeptide được đánh dấu được mã hóa bởi một đoạn mARN Các đoạn cứa các codon kết thúc sớm tạo nên chuỗi pp ngắn RT-PCR được sử dụng để quét toàn bộ gen dystrophin ở 10 đoạn trùm nhau trong một loạt các bệnh nhân DMD Các polypeptide chạy nhanh hơn cho thấy có chứa codon kết thúc sớm

18_06.jpg

Sàng lọc nhiều đột biến mất đoạn ở gen dystrophin ở nam giới.

Sản phẩm multiplex PCR exon sử dụng các mẫu từ 10 người nam không có

quan hệ họ hàng bị bệnh DMD.

Mồi PCR được thiết kế để mỗi exon được nhân với cả trình tự intron biên,

tạo ra các sản phẩm PCR kích thước khác nhau

14_13.jpg

Functional complementation in transgenic mice

as a tool for identifying a human disease gene.

Shaker-2 mouse mutation was identify by finding

a wild-type clone that corrected the defect Human families with a similar phenotype that mapped to the corresponding chromosomal location proved to have mutation in the orthologous gene.

Các ví dụ minh họa các gen bệnh khác nhau đã được xác

định

Hội chứng Sotos: xác địn trực tiếp bằng đột biến nst

Hội chứng Treacher Collins: bằng lập bản đồ bản mã

sao

Hội chứng Branchio-oto-renal: bằng giải trình tự đoạn

gen lớn và tìm trình tự tương đồng

Rodopsin và fibrillin: bằng xác định chức năng của gen

ứng viên dựa vào vị trí



14_13_2.jpg

Định dạng
Số trang	9
Dung lượng	1,73 MB