Phân tích di truyền phân tử người

Nguyen Thị Hong VanDepartment of Genetics - HUS Phân tích di truyền phân tử người Chương 3 Nguyen Thi Hong Van Department of Genetics-HUS Nội dung  Nhân bản ADN: PCR và tách dòng dựa và

Trang 1

Nguyen Thị Hong Van

Department of Genetics - HUS

Phân tích di truyền phân tử người

Chương 3

Nguyen Thi Hong Van

Department of Genetics-HUS

Nội dung

 Nhân bản ADN: PCR và tách dòng dựa vào tế bào

 Lai axit nucleic: nguyên lý và ứng dụng

 Giải trình tự ADN và xác định kiểu gen

 Nghiên cứu biểu hiện gen

Tách dòng ADN

 Tách dòng ADN là việc khuếch đại có chọn lọc để thu

được một lượng lớn bản sao giống nhau của trình tự

ADN mong muốn.

 Tách dòng ADN in vitro: PCR, sử dụng mồi

oligonucleotide

 Tách dòng ADN dựa vào tế bào:

sử dụng vector tách dòng tái tổ hợp (đơn vị sao chép) và biến

nạp vào tế bào chủ thích hợp

mỗi tế bào nhận một loại phân tử ADN tái tổ hợp này  toàn bộ

các dòng nhận một loại phân tử ADN tái tổ hợp này  toàn bộ

các thế hệ tế bào sau tạo nên một dòng ADN (chứa cùng một

loại phân tử đích)

3.1 Nhân bản ADN: PCR và tách dòng dựa vào

tế bào

 3.1.1 PCR: nguyên lý và ứng dụng

Nguyên lý PCR và RT-PCR

Các ứng dụng của PCR

 3.1.2 Tách dòng dựa vào tế bào

Sàng lọc thể tái tổ hợp

3.1.1 Nguyên lý PCR và RT-PCR

 Nhằm khuếch đại một trình tự ADN đích đặc hiệu (gen

hoặc một phân đoạn ADN), sử dụng DNA polymerase

 Các thành phần chính của PCR:

ADN hệ gen (từ mô hoặc tế bào nuôi cấy)

mồi oligonucleotide

các dNTP

DNA polymerase bền nhiệt

 RT-PCR được sử dụng để khuếch đại các trình tự ADN

mã hóa, bắt đầu bằng việc tinh sạch mARN từ mô thích

hợp, tổng hợp cDNA sử dụng enzym phiên mã ngược

05_01.jpg

Trang 2

Nguyên lý PCR và RT-PCR

 Mồi cho PCR:

Mồi xuôi và mồi ngược (dài khoảng 18-25 nucleotide)

đặc hiệu với các trình tự nằm rìa hai bên trình tự đích

Để khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu, mồi phải được thiết kế với

các lưu ý:

thành phần base: hàm lượng GC ~40-60%, chứa cả 4 loại

nucleotide

Tm được tính cho 2 mồi không khác nhau trên >5oC và không

khác so với Tm của sản phẩm trên >10oC

để đảm bảo chỉ alen đặc hiệu được khuếch đại, trình tự đầu

3’ phải không bổ sung với mồi khác trong cùng phản ứng

mồi không chứa các trình tự tự bổ sung (kích thước >3bp)

05_02.jpg

05_02_2.jpg

05_02_3.jpg

Nguyên lý PCR và RT-PCR

 Chu trình PCR

biến tính: đối với ADN hệ gen người, nhiệt độ biến tính thường

là 93-95oC

gắn mồi: 50-70oC, phụ thuộc Tmcủa sợi ADN kép

tổng hợp ADN : 70-75oC, sử dụng DNA polymerase bền nhiệt

(Taq polymerase - không có hoạt tính 3’5’ exonuclease) hoặc

Pfu (Pyrococcus furiosus) polymerase (có hoạt tính đọc sửa

3’5’ exonuclease)

Ứng dụng của PCR

 Các ưu điểm của PCR

rất nhanh chóng, dễ thực hiện

rất nhạy: có thể khuếch đại từ lượng ADN đích rất nhỏ

rất mạnh: có thể khuếch đại ADN từ các mẫu bị phân hủy, biến tính hoặc các mẫu ở môi trường khó tách ADN

 Ứng dụng đa dạng

chẩn đoán, phân tích liên kết di truyền, trong khoa học hình sự

Trang 3

05_03.jpg

Các dạng PCR cải biến

 PCR đặc hiệu alen

để khuếch đại trình tự ADN và loại bỏ khả năng khuếch đại các alen khác

cần mồi đặc hiệu alen (ASP)

 Nested primer PCR (PCR lồng)

sản phẩm của lần PCR đầu được sử dụng làm ADN khuôn cho lần PCR tiếp theo với các mồi khác

làm tăng tính đặc hiệu của PCR

 Real-time PCR : PCR định lượng

 RT-PCR

 (Box 5.1)

05_04.jpg

05_04_2.jpg

Khuếch đại ADN chưa biết trình tự

 DOP-PCR (Degenerate oligonucleotide primed PCR –

PCR sử dụng mồi suy diễn): ít nhất một trong các thàn

viên của họ gen hoặc họ ADN lặp lại đã được biết, chứa

vùng bảo thủ và được sử dụng để thiết kế mồi, dựa vào

các oligonucleotide thoái hóa.

 PCR toàn bộ hệ gen

 Anchored PCR (PCR neo)

 Inverse PCR (PCR đảo ngược)

 RACE-PCR

3.1.2 Tách dòng ADN dựa vào tế bào

 Bốn bước để tách dòng ADN dựa vào tế bào

Tạo phân tử ADN tái tổ hợp

Biến nạp

Nhân bản chọn lọc dòng tế bào

Tinh sạch dòng ADN tái tổ hợp

Trang 4

05_05.jpg

Biến nạp

05_05_2.jpgNhân bản chọn lọc dòng tế bào

Tinh sạch dòng ADN tái tổ hợp

(A) Tạo phân tử ADN tái tổ hợp

 Sử dụng các enzym giới hạn

có nguồn gốc vi khuẩn, type II

cắt tại các trình tự nhận biết đặc hiệu (4-8bp) (có cấu trúc

palindromes)

đoạn cắt giới hạn có thể có

đầu bằng (tù)

đầu so le (dính)

các ưu điểm của tách dòng ADN và phân tích :

tạo ra một tập hợp xác định các đoạn ADN

sử dụng ADN ligase để gắn nối, tạo phân tử ADN tái tổ hợp

(A) Tạo phân tử ADN tái tổ hợp

 Các vector để tách dòng sử dụng tế bào vi khuẩn

là đơn vị sao chép: có thể sao chép độc lập ở tế bào chủ (vi khuẩn, nấm)

các plasmid

bacteriophage

chứa gen chỉ thị và các vị trí đa tách dòng (polylinker)

 Các tạo phân tử ADN tái tổ hợp

cắt phân tử ADN hệ gen và vector với cùng loại RE

lai các đoạn ADN vào vector

05_06.jpg

(B) Biến nạp

 Đưa phân tử ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận

 Các tế bào khả biến: có khả năng tiếp nhận ADN ngoại lai từ môi trường ngoại bào

khả biến tự nhiên

khả biến nhân tạo: xử lý với hóa chất hoặc nhiệt, xung điện

 Các phân tử ADN tái tổ hợp được chuyển vào tế bào chủ

Trang 5

05_07.jpg

(C) Nhân chọn lọc các dòng tế bào

 Nhân bản các tế bào biến nạp

Cấy trải lên đĩa petri  tạo các khuẩn lạc

Một khuẩn lạc là một dòng tế bào, bao gồm các tế bào giống nhau và có nguồn gốc từ một tế bào ban đầu

 Nhặt riêng khuẩn lạc khỏi đĩa và nuôi trong dịch lỏng để thu dịch nuôi

(D) Tinh sạch dòng ADN tái tổ hợp

 Thu dịch tế bào và tinh sạch ADN tái tổ hợp

05_07_2.jpg

Hình Tạo thư viện ADN hệ gen

05_10.jpg

Hình Tạo thư viện cDNA

05_10_2.jpg

Trang 6

Sàng lọc thể tái tổ hợp

 Để phát hiện các tế bào chứa phân tử đích

 Sàng lọc tổng quát : sàng lọc thư viện ADN từ tập hợp

ADN chưa biết

 Sàng lọc trực tiếp: được sử dụng để kiểm tra sự có mặt

của trình tự đã biết hoặc trình tự có liên quan đến trình

tự đã biết.

 Sàng lọc các tế bào biến nạp bằng vector, dựa vào:

gen kháng kháng sinh:

chủng tế bào chủ mẫn cảm với kháng sinh

tế bào biến nạp chứa vector: kháng kháng sinh

sự bù gen -galactosidase

tế bào chủ: chứa gen -galactosidase không tạo chức năng

tế bào biến nạp: vector chứa đoạn gen bù chức năng  có thể tạo enzyme có hoạt tính, biến đổi cơ chất Xgal (không màu) thành sản phẩm có màu xanh (khuẩn lạc xanh)

 Sàng lọc tổng quát thể tái tổ hợp

dựa vào sự bất hoạt đoạn chèn

chèn đoạn đích vào vị trí polylinker trong gen chỉ thị

sàng lọc dựa vào -galactosidase: tế bào tái tổ hợp chứa

đoạn chèn vào gen -galactosidase  chức năng bị bất hoạt

 tạo khuẩn lạc trắng

sàng lọc dựa vào tARN dập tắt

 Sàng lọc trực tiếp thể tái tổ hợp

kiểm tra sự có mặt của trình tự ADN đã biết

bằng lai hoặc PCR

sàng lọc dựa vào lai

Dòng ADN quan tâm được đánh dấu, sử dụng mẫu dò để xác định các khuẩn lạc chứa trình tự đích

Sàng lọc dựa vào PCR

trình tự được nhận biết bằng thử nghiệm PCR đặc hiệu (được gắn thẻ - tagged)

Vị trí gắn trình tự (sequence tagged site - STS): vị trí duy nhất có trình tự đó trong hệ gen

05_11.jpg

3.2 Lai axit nucleic: nguyên lý và ứng dụng

 Nguyên lý lai axit nucleic

 Mẫu dò axit nucleic

 Thử nghiệm lai axit nucleic

Trang 7

3.2.1 Nguyên lý lai axit nucleic

 là công cụ cơ bản của di truyền phân tử

 dựa vào khả năng các phân tử axit nucleic sợi đơn có

thể tạo phân tử sợi kép bằng phản ứng lai

 Hai sợi đơn có sự đủ sự bổ sung về trình tự nucleotide

 Sử dụng mẫu dò axit nucleic đánh dấu để xác định các

phân tử ADN hoặc ARN liên quan (phân tử đích).

Lai axit nucleic để xác định các phân tử liên quan gần trong hai tập hợp (nguồn) axit nucleic

Nguồn chưa biết: các phân tử axit nucleic chưa biết rõ (đích)

độ bổ sung về trình tự base

biến tính (bằng nhiệt hoặc xử lý với kiềm)

Hai loại sản phẩm lai

 Các phân tử sợi kép đồng hợp (Homoduplex): các sợi

bổ sung hoàn toàn từ các sợi đơn có nguồn đích hoặc

nguồn mẫu dò

 Các phân tử sợi kép dị hợp (Heteroduplex): các phân tử

sợi kép được tạo thành bằng việc bắt cặp giữa mẫu dò

sợi đơn và đích sợi đơn

06_08.jpg

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự biến tính axit nucleic

 Độ dài sợi: sợi càng dài  càng khó biến tính

 Thành phần base: thành phần % GC càng cao  càng

khó phân tách

 môi trường hóa học:

các cation hóa trị một (Na+) làm ổn định sợi kép

các phân tử phân cực mạnh (formamide, urea ) là các chất biến

tính hóa học sợi kép

 Nhiệt độ tách mạch (Tm): nhiệt độ tương ứng với điểm

giữa trong sự chuyển tiếp từ dạng sợi đơn sang dạng

sợi kép

Các phương pháp thử nghiệm lai axit nucleic

 Lai dung dịch: trộn dung dịch mẫu dò và dung dịch đích:

quá trình tái kết hợp diễn ra chậm

bổ sung thêm phân tử rút nước - polyethylene glycol để tăng tốc độ

 Lai trên màng: gắn đích lên giá thể rắn (màng nitrocellulose hoặc nylon) và đính mẫu dò đã đánh dấu vào giá thể đó.

sau đó loại bỏ mẫu dò còn dư

thử nghiệm lai ngược (mẫu dò chưa được đánh dấu được gắn lên giá thể rắn; đích được đánh dấu trong dung dịch)

Trang 8

06_10.jpg

3.2.2 Các mẫu dò axit nucleic

 Được tạo ra ở dạng sợi đơn hoặc kép

 Mẫu dò hoạt động phải ở dạng sợi đơn

 Có ba loại mẫu dò:

Mẫu dò DNA

Mẫu dò RNA

Mẫu dò oligonucleotide

các oligonucleotide thoái hóa làm mẫu dò

06_01.jpg

Các phương pháp đánh dấu axit nucleic

Đánh dấu in vitro bằng cách gắn thêm các nucleotide cải biến

sử dụng enzym phù hợp để gắn các nucleotide đánh dấu

Hai quy trình chủ yếu:

Đánh dấu sợi tổng hợp:

• sử dụng DNA hoặc RNA polymerase để tạo ra các bản sao DNA hoặc RNA

• một trong bốn loại dNTP mang một nhóm chức đánh dấu

• Phương pháp đánh dấu ADN: nick-translation; đánh dấu mồi ngẫu nhiên; đánh dấu nhờ PCR (PCR-mediated labeling)

• Phương pháp đánh dấu ARN: hệ thống phiên mã in vitro

Đánh dấu tận cùng

• nhóm được đánh dấu được gắn vào một hoặc một vài nucleotide đầu tận cùng

• hữu ích cho việc đánh dấu các oligonucleotide sợi đơn

Các phương pháp đánh dấu axit nucleic

Đánh dấu và phát hiện đồng vị

bằng việc gắn các nucleotide chứa các đồng vị phóng xạ (32P, 33P, 35S,

3H )

phát hiện bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography)

cường độ của tín hiệu phóng xạ phụ thuộc vào cường độ của bức xạ phát ra bởi đồng vị phóng xạ, thời gian phơi nhiễm

Đánh dấu và phát hiện mẫu dò không phóng xạ

sử dụng mẫu dò không phóng xạ

đánh dấu không đồng vị trực tiếp

gắn một nucleotide chứa nhóm đánh dấu đính vào (fluorophore)  phát hiện bằng chiếu ánh sáng (UV )

đánh dấu không đồng vị gián tiếp

gắn cặp một phân tử báo cáo bị cải biến với tiền chất nucleotide và gắn vào ADN

phân tử báo cáo được bám bởi phân tử có ái lực với nó (protein hoặc ligand)

liên hợp với phân tử có ái lực là một phân tử chỉ thị hoặc nhóm chỉ thị

được phát hiện bởi thử nghiệm thích hợp

Trang 9

Các hệ thống đánh dấu

không đồng vị phóng xạ gián tiếp

 Biotin-streptavidin

hai chất gắn (ligand) với ái lực cực cao: biotin là chất báo cáo,

streptavidin (protein vi khuẩn) là phân tử ái lực

các mẫu dò được gắn nhóm biotin được tạo ra bằng việc thêm

một nucleotide gắn biotin trong phản ứng đánh dấu

 Digoxigenin (là steroid thực vật, bám vào kháng thể đặc

hiệu)

là nhóm báo cáo, gắn với các nucleotide

 Các nhóm hoặc phân tử chỉ thị có thể được liên hợp với

phân tử ái lực:

các fluorophore

các enzyme

06_05.jpg

06_06.jpg

3.2.3 Các thử nghiệm lai axit nucleic

 Sử dụng các mẫu dò ADN tách dòng để sàng lọc tập hợp axit nucleic chưa được tách dòng

Lai dot-blot:

đưa dung dịch ADN đích (hệ gen) lên giá thể rắn (slot-blot:

dùng pipet bơm DNA qua một khe riêng trong khuôn thích hợp)

 ến tính ADN đích

cho đích đã biến tính tiếp xúc với dung dịch mẫu dò sợi đơn

rửa bỏ phần mẫu dò còn dư

làm khô và chụp phim phóng xạ tự ghi Ứng dụng: phân biệt các alen khác nhau chỉ một nucleotide (sử dụng đoạn oligonucleotide đặc hiệu alen – mẫu dò ASO)

 Sử dụng các mẫu dò ADN tách dòng để sàng lọc tập hợp axit nucleic chưa được tách dòng

Lai Southern blot

cắt ADN đích với các enzym giới hạn tạo ra các phân đoạn

có kích thước vài trăm – vài nghìn bp

điện di trên gel, biến tính và chuyển lên màng rắn

lai với dung dịch mẫu dò ADN

rửa bỏ mẫu dò còn dư

làm khô và chụp phim X-ray Ứng dụng: xác định các trình tự có liên quan đến nhau, trong cùng

hệ gen hoặc giữa các hệ gen khác nhau

Trang 10

06_12.jpg

06_12_2.jpg

Các thử nghiệm lai axit nucleic

 Sử dụng các mẫu dò ADN tách dòng để sàng lọc tập

hợp axit nucleic chưa được tách dòng

Lai Northern blot

là dạng cải biến của Southern blot, axit nucleic đích là ARN

được cắt bởi enzym giới hạn

nhằm nhận được thông tin về mô hình biểu hiện của gen

đích:

• sử dụng các mẫu RNA từ các mô khác nhau

cung cấp bằng chứng về các dạng khác nhau của sản phẩm

gen nếu cho biết kích thước bản mã sao khác nhau

06_13.jpg

Các thử nghiệm lai axit nucleic

 Sử dụng các mẫu dò ADN tách dòng để sàng lọc tập

hợp axit nucleic chưa được tách dòng

Lai tại chỗ (In situ hybridization): sử dụng các mẫu dò để lai với

ADN biến tính của nhiễm sắc thể hoặc ARN của mô được cố

định trên lam kính

Lai tại chỗ đối với nhiễm sắc thể: FISH

Lai tại chỗ đối với mô

• sử dụng mẫu dò là các cDNA sợi kép

• hoặc mẫu dò ARN sợi đơn bổ sung (robo-probe)

3.3 Giải trình tự và xác định kiểu gen

 để xác định trình tự ADN và xác định biến dị ADN của các cá thể trong một loài.

 Giải trình tự ADN:

Giải trình tự ADN chuẩn

Giải trình tự ADN tự động

 Xác định kiểu gen

Xác định kiểu gen đa hình vị trí cắt giới hạn (RFLP)

Xác định kiểu gen đa hình về số đoạn lặp kế tiếp (Variable number of tandem repeat polymorphism - VNTR)

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	1,93 MB