bài giảng về sắc ký

Nguyên tắc của IEC: Trước tiên, protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tư ơng tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu, Sau đó, protein gắn được chiết rút riêng biệ

Trang 1

Techniquese in Biotechnology

Trang 2

Sắc Ký

Trang 3

Tổng quan về sắc ký

 Khái niệm chung

Sắc ký là tên gọi chung của một nhóm phương pháp tách các chất

Tên gọi này sau đó được giữ nguyên mặc dù nhiều chất phân tách không có màu.

Trang 4

 Lịch sử

Năm 1903, nhà khoa học người Nga Svet lần đầu tiên

đã sử dụng cột hấp phụ (than hoạt tính) để tách các sắc tố thực vật từ một hỗn hợp ban đầu (thành các lớp

có màu khác nhau), từ đó đã đặt tên cho phương pháp

là sắc ký (chromatography -ghi màu, theo đó gốc từ Hylạp chromato- màu sắc cũng đồng thời bao hàm nghĩa tên của ông trong tiếng Nga)

Tên gọi này sau đó được giữ nguyên mặc dù nhiều

chất phân tách không có màu.

Trang 5

Phương pháp này sau một thời gian bị lãng quên lại được phát triển mạnh từ sau 1930, với các phát kiến về.

Sắc ký trao đổi ion (1935), Sắc ký trên giấy (1940), Sắc ký khí (1940- 50), Sắc ký lớp mỏng (1938- 50), Sắc ký lọc gel (1959).

Trang 6

Nguyên tắc chung

Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký

là dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha:mộtcố định

và một di động.

Trang 7

Phân loại

Có thể phân chia sắc ký thành 3 nhóm dựa trên hiện tượng hoá lý xảy ra trong quá trình tiến hành:

Sắc ký hấp phụ

Sắc ký phân bố

Sắc ký trao đổi ion (tđio)

Một cách phân loại khác dựa trên hình dạng chất giá của pha cố định hoặc bản chất của pha di

Trang 8

Các phương pháp sắc ký lỏng để tách protein

Trang 9

Sắc ký trao đổi ion

(Ion- exchange chromatography - IEC)

Giới thiệu chung

Tương tác ion - cơ sở của việc tách và tinh chế protein bằng IEC- đã

được ứng dụng thành công từ cuối những năm 1940

Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau):

IEC: 75%,

sắc ký ái lực (AC): 60%,

sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp

Những số liệu thống kê từ các công bố gần đây (từ 7 tạp chí hoá

sinh học uy tín nhất thế giới trong 2 năm 1996- 1997) cho thấy IEC hiện được vẫn là phương pháp phổ biến nhất trong các bước sắc ký của quy trình tinh sạch protein (với cả protein thường và protein tái

tổ hợp): chiếm khoảng 40% (AC: 16,5% , GF: 17%)

Trang 10

Nguyên tắc của IEC:

Trước tiên, protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tư

ơng tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu,

Sau đó, protein gắn được chiết rút riêng biệt, thường là nhờ việc tăng dần lực ion (khiến cho tương tác ion bị bẻ gãy hoàn toàn)

 Hay dùng nhất là gradient của NaCl) của đệm (có rất nhiều loại khác nhau được sử dụng để cân bằng chất trao đổi),

 Có thể bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên protein bị mất điện tích

Mặc dù đây là phương pháp thông dụng trong nhiều phòng thí nghiệm hoá sinh, cơ chế cơ bản trong tương tác giữa protein và bề mặt tĩnh điện vẫn còn

ít được hiểu biết

Trang 11

The principle of ion-exchange chromatography

(salt gradient elution)

Trang 12

The principle of ion-exchange chromatography

The fractionation of variously charged molecules (squares) on an

anion exchanger (cirles)

Trang 13

IEC illustration

The separation of an amino acid mixture at

pH 3.0 on EIC column (above);

Automatically recorded high- performance liquid chromatographic analysis of amino acids on a cation- exchange resin (below)

Trang 14

Những nguyên nhân giải thích sự thông dụng của IEC

Trang 15

Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác

Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích thực

và vào lực ion của môi trường

Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi, Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra

Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào:

Sự phân bố điện tích bề mặt của protein

ph

Bản chất các ion trong dung dịch.

Các chất được thêm vào như dung môi hữu cơ.

Đặc tính của chất trao đổi

Trang 16

 Rõ ràng là điện tích của protein càng cao, nó càng gắn chặt vào chất trao đổi tích điện trái dấu

 Tương tự như vậy, chất trao đổi càng tích điện nhiều (có nghĩa là có mức độ thay thế các nhóm tích điện mạnh hơn), sẽ liên kết với protein mạnh hơn các chất tích điện yếu

 Những điều kiện khác như pH làm thay đổi hoặc protein hoặc chất trao

đổi sẽ ảnh hưởng đ n tương tác của chúng và có thể được sử dụng để ế tác động lên quá trình trao đổi ion

Trang 17

 Gồm có pha tĩnh (cột nhồi gel, với khác biệt là có các nhóm chức năng ở dạng ion hoá)

 Pha động

Về cách thực hiện IEC gồm hai bước:

1) gắn protein vào các điện tích cố định trên cột

2) chiết rút chúng ra

Trang 18

Các chất (nhựa) trao đổi ion và cách lựa chọn

 Nhiều loại nhựa có chứa nhóm tích điện cố định trên chất giá

không tan được bán và sử dụng rộng rãi (liệt kê trên bảng với

khoảng pH thích hợp)

 Các chất trao đổi có chứa hoặc nhóm acid hoặc base:

 Chất trao đổi ion base có chứa nhóm tích điện dương và được gọi

là anionit (nhựa trao đổi cation, vì chúng gắn và trao đổi cation),

 Ngược lại, chất trao đổi acid có chứa nhóm tích điện âm là

cationit (nhựa trao đổi anion, vì chúng gắn và trao đổi anion)

(Các nhựa tích điện dương được gọi là "trao đổi anion"; các nhựa tích điện âm là "chất trao đổi cation")

Trang 19

Các nhựa pha rắn thông dụng gồm: cellulose, dextran, agarose,

và polystyrene

Nhóm trao đổi anion yếu: DEAE (diethylaminoethyl)

 là 1 base yếu (có điện tích dương rõ khi ion hoá và do vậy sẽ liên kết với các anion trao đổi),

 pH 2-9;

 chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng hạt hay

sợi …

Nhóm trao đổi cation yếu: CM (carboxymethyl):

 là 1 axit yếu có điện tích âm rõ khi ion hoá, do vậy liên kết với cation trao đổi;

 pH 3- 10,

 chất giá có thể là dextran agarose, cellulose dạng sợi…

Trang 20

Protein là những chất lưỡng tính, có tổng điện tích thay đổi tuỳ thuộc môi trư ờng:

 Do vậy một chất trao đổi anion liên kết với protein thông qua nhóm

carboxyl không proton hoá và được tách (rời) ra bằng nhóm amin proton hoá

 Đối với chất trao đổi cation thì ngược lại

Trang 21

Theo nguyên tắc chung:

 Các protein khác nhau về lượng gốc Asp và Glu (a.a axit) tổng

số sẽ được tách bằng nhựa trao đổi anion

 Các protein khác nhau về Lys, Arg và His sẽ được tách bằng

nhựa trao đổi cation

Tuy nhiên còn nhiều tác nhân khác ảnh hưởng đến sự tách

Độ mạnh của liên kết liên quan đến cả pI của protein lẫn số điện tích tổng số

Do vậy, hai protein có pI bằng nhau không tách được bằng đẳng

điện cân bằng lại có thể tách bằng IEC nếu sử dụng giá trị pH

mà tại đó chúng có chứa lượng gốc tích điện khác nhau đáng kể trên 1 phân tử

Trang 22

 Có thể lựa chọn kiểu tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamid trong

điều kiện acid và kiềm, những phân tách này sẽ là những kiểu phân tích sắc

ký trao đổi cation và anion tương ứng.

Ví dụ nếu tách phân tích tốt một hỗn hợp bằng điện di kiềm thì nó có thể tách tốt bằng chất trao đổi anon ở pH tương tự

 Cellulose là loại nhựa được ưa dùng hơn cả để tách protein , …

 Những dẫn xuất của Sephadex G-50 bị thay đổi thể tích rất mạnh khi lực ion thay đổi…

 Các dạng nhựa mới của cellulose, vi hạt và hạt của Whatman có độ lặp lại, khả năng và độ phân giải cao hơn dạng sợi cũ

 Dung tích với protein là tương đối giống nhau ở các loại nhựa: (0.11- 0.15 g albumin/ ml của các loại dẫn xuất DEAE

Trang 23

Schematic morphological structure of different support

materials

Trang 24

Cách chuẩn bị và tái sinh cột

 Cần rửa, làm trương (một số nhựa được bán ở dạng đã được trư

ơng sẵn có thể dùng ngay), và xử lý nhựa thành dạng cần thiết trước khi dùng Các IEC có thể tái sử dụng nhiều lần, sau mỗi lần sử dụng nhất thiết phải tái sinh (hồi nguyên) nhựa

 Rửa và làm trương trộn nhựa với khoảng 10 thể tích đệm, để

lắng, gạn bỏ các hạt lơ lửng(để đảm bảo tốc độ chảy ổn định)

Trang 25

Charged groups

Functional groups used on ion exchangers

Diethylaminoethyl (DEAE) -O-CH2-CH2-N + H(CH2CH3)2

Quaternary aminoethyl (QAE) -O-CH2-CH2-N + H(CH2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Quaternary ammonium (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N + (CH3)3

Cation exchangers Functional group

Carboxymethyl (CM) -O-CH2-COO

-Sulphopropyl (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3

-Methyl sulphonate(S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3

Trang 26

-Sắc ký trao đổi ion

Trang 27

Sephadex ion exchangers (SIE)

Trang 28

Xử lý (với Sephadex và Sepharose acid và base chỉ được dùng ở

nồng độ 0,1M):

1 Khuấy nhẹ nhựa trong ~ 5V thể tích trương với 0,5 M HCl

(anionit) hoặc 0,5 M NaOH (cationit), để 30 phút ở to phòng,

thỉnh thoảng khuấy

2 Rửa sạch bằng nước (bằng phễu lọc hút chân không), hoặc bằng

giấy lọc cho đến khi pH đạt hơn 4 (sau acid) hoặc thấp hơn 8

Trang 29

(cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit)

pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp

Trang 30

Cân bằng đệm : nhựa cần cân bằng hoàn toàn

trong đệm trước khi dùng

1 Cho đệm đã xử lý vào 1 lượng tương đương của đệm có nồng độ

cao gấp 10 lần đệm thường, trộn và để 30 phút ở to phòng

2 pH có thể bị thay đổi, khuấy nhẹ nhựa và chỉnh lại pH

3 Để nhựa 30 phút, rửa lại trên phễu với đệm dặc gấp 5 lần

4 Nhồi và rửa cột với đệm thường cho đến khi dịch chảy ra đạt đến

pH cần

Trang 31

Chuẩn bị cột :

Thường tỉ lệ giữa đường kính và chiều cao cột từ 1/10 đến 1/20

Lượng nhựa cần dùng được tính từ dung lượng trao đổi của nhựa

và lượng mẫu thử rồi thường lấy thừa ra 50%

Nhựa được cho (nhồi) vào cột, ở đáy có bông thuỷ tinh…

Trang 32

Cho mẫu và chiết rút :

Mẫu cần thẩm tích kỹ đối đệm chạy trước khi cho lên cột, thể tích không quan trọng (có thể nhiều ít bất kỳ)

Rửa đầu tiên với ít nhất 2 lần (thường là 5 lần hoặc hơn) thể tích cột để loại hết protein không bám

Sau đó protein gắn trên cột được đẩy ra bằng cách:

1 tăng lực ion của đệm

2 thay dổi pH của nó (hạ thấp với anionit, tăng lên với

cationit)

3 hoặc cả hai biện pháp trên

Thường người ta dùng cách đầu vì điều khiển được cẩn thận

hơn

Lực ion cuốn cùng thường là 1 đối với đa số protein

Trang 33

Hoặc nồng độ đệm có thể tăng, hoặc được giữ nguyên

và tăng các ion khác (như NaCl).

Cách sau hay hơn vì khả năng đệm, do đó pH, được giữ nguyên trong quá trình tách…

(0,03% toluene), với cationit có thể dùng azid.

Trang 34

Resolution in ion exchange chromatography

The result of an ion exchange experiment (as with any other chromatographic separation) is often expressed as the resolution (Rs)

between the peaks of interest

Determination of the resolution (Rs) between two peaks

Trang 35

Separation results with different resolutions

Trang 36

Hypothetical chromatogram

V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1, VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, Vb1 = peak width for peak 1,

Vb2= peak width for peak 2.

Trang 37

The net charge of protein as a function of pH

Định dạng
Số trang	39
Dung lượng	1,72 MB