Bài giảng Đại cương về sắc ký - Lê Nhất Tâm

Bài giảng Đại cương về sắc ký có nội dung trình bày những khái niệm cơ bản về sắc ký, sắc ký đồ, các đỉnh rửa giải hình Gaussian, lý thuyết tấm, hệ số phân vùng 1,5 Nernst (K), hiệu suất cột, các thông số lưu giữ, yếu tố phân tách (hoặc độ chọn lọc) giữa hai chất tan, hệ số phân giải giữa hai đỉnh,... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Trang 1

GENERAL ASPECTS OF CHROMATOGRAPHY

1.1 General concepts of analytical chromatography

1.2 The chromatogram

1.3 Gaussian-shaped elution peaks

1.4 The plate theory

1.5 Nernst partition coefficient ( K )

1.6 Column efficiency

1.7 Retention parameters

1.8 Separation (or selectivity) factor between two Solutes1.9 Resolution factor between two peaks

1.10 The rate theory of chromatography

1.11 Optimization of a chromatographic analysis

1.12 Classification of chromatographic techniques

Trang 2

NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ

• Sắc ký là một phương pháp tách dựa trên tính chất vật

lý hay hóa lý của các cấu tử trong hổn hợp ở thể khí hay lỏng Tiến trình xãy ra như trong quá trình chưng cất, trích ly gián đoạn

• Tiến trình sắc ký có thể mô tả như sau :

+ Một pha đứng yên được cấu tạo có thể là một cột rỗng, một tờ giấy, một bản mặt v.v được làm đầy một loại rắn hay lỏng phù hợp gọi là pha tĩnh

+ Trên một đầu pha tĩnh cho vào một lượng mẫu nhỏ

có chứa các thành phần ra khỏi nhau

Trang 3

+ Pha động là những dung môi được đưa lên liên tục sau khi cho mẫu vào, pha động sẽ di chuyển trong cột do trọng lực và đem các cấu tử khác nhau trong mẫu theo chúng Quá trình này gọi là sự rửa giải Nếu các thành phần này di chuyển với những tốc độ khác nhau thì chúng sẽ tách ra khỏi nhau và có thể thu hồi cùng với pha động

Trang 4

• Đây là phương pháp được sử dụng đầu tiên vào đầu thế

kỷ 20 đo nhà thực vật Michặl Tswett

• Quá trình xãy ra trên cột cĩ thể áp dụng để tách và làm

sạch trong tiến trình xử lý mẫu (chuẩn bị cột sắc ký)

• Quá trình xãy ra đã hình thành kỹ thuật phân tích sắc ký bằng cách đo thời gian di chuyển của các hợp chất khác nhau, nghĩa là cĩ thể định danh chúng mà khơng cần thu nhận và phân tích Quá trình định danh một hợp chất cần thiết phải cĩ chất chuẩn của nĩ.

Trang 5

• Kỹ thuật sắc ký nhanh chóng phát triển, cùng với sự hổ trợ của các ngành khoa học khác như toán học, vật lý, tin học v.v và nó có thể tách ở những thành phần ở mức vi lượng.

• Biểu đồ nhận được từ quá trình chạy sắc ký gọi là sắc ký

đồ Sắc đồ ký đồ mô tả trình tự quá trình rửa giải các thành phần khác nhau khi ra hỏi cột

• Detector là thiết bị nhận biết các cấu tử khi ra khỏi mẫu,

nó cho biết thời điểm các cấu tử ra khỏi cột và cường độ tương tác các cấu tử với detector Thông tin này giúp cho việc định danh và định lượng các cấu tử trong mẫu ban

đầu.

• Như quá trình sắc ký xãy ra hai giai đoạn.

Trang 6

Việc định danh một hợp chất chỉ dựa vào thời gian lưu là chưa hợp lý Thường người ta kết hợp với một vài phương pháp khác như Mass spectrometer hay Infrared Spectrometer Những thiết

bị này sẽ cho những thông tin độc lập từ đó có thể so sánh và kết luận.

Trang 7

GAUSSIAN-SHAPED ELUTION PEAKS

• Sắc ký đồ rửa giải của một peak có dạng giống với biểu đồ

phân bố Gaussian

• Trong đó µ tương ứng với thời gian lưu của peak rửa giải, σ là

độ lệch chuẩn của peak (σ2 là phương sai)

• y là tín hiệu nhận được từ detector nó giống như hàm theo thờigian x

• Trong trường hợp lý tưởng hàm phân bố có thể mô tả theo

phương trình:

Trang 8

• Phương trình trên có đồ thị là một đường cong đối xứng ( x=0 khi y= 3.999), đồ thị đi qua hai điểm uốn tại x= +1 và -1,

tương ứng với giá trị y đạt được là 0,242 ( chiều cao tương

ứng là 60.6% so với giá trị cực đại Độ rộng của peak tại điểmuốn là 2σ (σ =1)

• Trong sắc ký đồ w1/2 là ký hiệu cho độ rộng tại ½ chiều cao

peak (w = 2,35σ) Độ rộng của peak tính tại nền và được đo ở chiều cao đạt được là 13,5% so với chiều cao cực đại là w= 4 σ

GAUSSIAN-SHAPED ELUTION PEAKS

Trang 9

THE PLATE THEORY

• Gần một nữa thế kỷ các thuyết lần lượt ra đời để giãi thích sự

di chuyển và phân tách của các cấu tử trong cột

• Craig’s theoretical plate model được xem là thuyết giãi thíchquá trình di chuyển và phân tách các cấu tử chất tan trong cột

là hợp lý nhất

• Mặc dù quá trình xãy ra trong cột là một quá trình xãy ra liêntục nhưng theo mô hình của Craig, ông cho rằng đó là nhữngbước tiếp nối riêng biệt Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình

cơ bản này là sự tuần hoàn của sự hấp phụ và giãi hấp phụ Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của cáccấu tử trong cột

• Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi làđĩa lý thuyết

Trang 10

• Các đĩa này sắp xếp dọc theo chiều dài cột Mỗi một chất khi

di chuyển trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau( hấp phụ/ giãi hấp phụ) nên số đĩa khác nhau

• Nêu gọi chiều cao tương đương của một đĩa lý thuyết là H (Height equivalent to a theoretical plate)

• Ta có :

Trang 11

+ Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có: Tổnglượng chất tan mT là tổng số lượng chất tan được pha động di chuyển tới từ đĩa thứ (j-1) nằm cân bằng tại thời điểm (i-1) vàlượng chất tan thực sự có sẵn ở đĩa thứ j tại thời điển (i-1)

Trang 12

Lý thuyết có một lỗi nghiêm trọng ở chỗ nó không tính đến phân tán trong cột do sự khuếch tán của các hợp chất

Trang 13

Nerst partition coefficient(K)

• Thông số hóa lý cơ bản của quá trình sắc ký là hằng số cân

bằng K, gọi là hệ số phân bố, được tính bằng tỷ số nồng độ củachất tan nằn giữa hai pha

• Hệ số K có thể rất lớn, như 1000 nếu như pha động là khí hoặcnhỏ khi pha động là lỏng

• Mỗi một hợp chất thường phân bố trong vùng không gian

trong cột, và có nồng độ khác nhau ở những vùng khác nhau( CM và CS khác nhau) nhưng tỷ số của chúng không đổi

Trang 14

Ta có :

Trang 15

• Theo trên ta có :

• Suy ra:

• Hay:

COLUMN EFFICIENCY

Trang 16

SỐ ĐĨA HIỆU QUẢ THỰC TẾ

• Để đánh giá đúng thực chất hiệu quả cột đối với sự tách mộtcấu tử, thông số thời gian lưu tR được thay thế bằng thời gianlưu thực tế t’

R

• Lúc này ta có :

• Nếu tính ở độ rộng w1/2:

Hay

Trang 17

CÁC THÔNG SỐ LƯU GIỮ

 Thời gian lưu tR (Retention time)

 Thể tích của pha động trong cột (thể tích chết)

Trang 18

THỜI GIAN LƯU

Trang 19

THỂ TÍCH CỦA PHA ĐỘNG VÀ PHA TĨNH

TRONG CỘT

V S = V C - V M

Trang 20

THỂ TÍCH PHÂN GIÃI VR

Trang 23

• Từ đây có thể viết:

HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k

(Capacity factor)

Trang 24

HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k

(Capacity factor)

Trang 25

HỆ SỐ CHỌN LỌC GIỮA HAI CẤU TỬ

• Hệ số chọn lọc α cho phép so sánh hai peak liền kề trong mộtsắc ký đồ, xem chúng thể tách ra khỏi nhau không

• Hệ số chọn lọc α là được đánh giá là tỷ số giữa hệ số dung lượng cột của hai peak

Hay

Trang 26

HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK

• Hệ số phân giãi R giữa hai cấu tử trong cột cho phép đánh giá hai cấu tử này có thể tách ra khỏi nhau không (hệ số α cũng giúp cho chúng ta đánh giá trên mức độ này)

• Hệ số R được đánh giá là theo biểu thức sau:

Trang 27

• Giá trị đo R phản ảnh mức độ phân giãi giữa hai peak

Trang 28

• Ảnh hưởng của chiều dài cột đến độ phân giãi

Trang 29

• Phương trình liên hệ giữa độ phân giãi R với hệ số lưu k, hệ sốchọn lọc α và hiệu quả cột được biểu thị như sau:

Trang 30

PHƯƠNG TRÌNH VAN DEEMTER

• Phương trình Van deemter (1956) mô tả sự ảnh hưởng của tốc

độ dòng pha động đến hiệu quả tách

• Ba hệ số A,B,C liên quan khác nhau tùy thuộc vào bản chấtcủa cột và điều kiện thực nghiệm

• Trong đó A là hệ số khuyếch tán xoáy, B là hệ số khuyếch tándọc theo cột, C là hệ số truyền khối

• Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s, C là s

Trang 31

+ Phương trình cho thấy sự tồn tại của tốc độ dòng pha động mà tại đóhiệu quả cột là lớn nhất.

+ Hiệu quả cột giảm khi tốc độ dòng pha động tăng

+ Hiệu quả cột đạt cao nhất khi H nhỏ nhất ứng với

PHƯƠNG TRÌNH VAN DEEMTER

Trang 32

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

• Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được sự tách hoàn toàn các chất cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi

đi qua cột

• Để có được tối ưu quá trình sắc ký người ta phải sử dụng

những nguồn sẵn về thiết bị, phần mềm dể mô phỏng đượcnhững kết quả thu được từ sự thay đổi các thông số vật lý

khác

• Quá trình tối ưu hóa đồng nghĩa với việc chọn lựa: Cột, chiềudài cột, đường kính cột, thành phần pha tĩnh trong cột, tốc độdòng và thành phần pha động Tất cả những yếu tố này lại

tương tác với nhau Ví dụ độ phân giãi R và thời gian chu kỳsắc ký tỷ lệ nghịch với nhau

Trang 33

Trang 34

Năm hệ số K, N, k, α và R ảnh hưởng chủ yếu khi xem xét tối ưuhóa quá trình sắc ký

Trang 35

PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

• Sắc ký lỏng (LC)

• Sắc ký khí (GC)

• Sắc ký dòng siêu chảy (SFC)

Trang 37

Sắc ký lỏng-rắn : còn gọi là sắc ký hấp phụ Pha tĩnh trong trường hợp này là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích

Hệ số hóa lý cho quá trình là hệ số hấp phụ Ngày nay đã có những pha tĩnh được thiết lập đa dạng hơn để đáp ứng hiệu quả tách.

Sắc ký trao đổi ion: Trong kỹ thuật này pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề mặt gắn

những nhóm trao đổi ion Quá trình tách theo kiểu này được đặc trưng bởi hệ số phân bố ion

Trang 38

Sắc ký rây phân tử ( Size exclusion chromatography): Pha tĩnh trong kỹ thuật này là những vật liệu trên đó có những lổ xốp Kích thước lổ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách Các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lổ sẽ

được lưu giữ trong cột lâu hơn Tùy thuộc vào bản chất pha động là dung dịch hay dung môi hửu cơ mà ta có sắc ký lọc gel (gel filtration) và sắc ký thẩm thấu gel (gel permeation) Trong kỹ thuật này hệ số phân bộ được gọi là hệ số phân

tán( diffusion coefficient)

Trang 39

• Sắc ký lỏng- lỏng: Pha tĩnh là lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp (giống như chất mang) Quá trình tách các chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai hai pha tĩnh và động (đều là pha lỏng), nên hệ số đặc trưng cho quá trình

là hệ số phân bố Kỹ thuật hiện nay ít được dùng vì pha tĩnh dễ bị hòa tan, người ta gọi là hiện tượng chảy máu cột (bleeding)

Trang 40

Sắc ký lỏng – pha liên kết

• Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography).

• Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha

liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

– Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha

động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

– Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Trang 41

• Sắc ký khí (GC)

Pha động trong trường hợp này là các khí mang như

N2,H2,He Tùy vào bản chất của pha tĩnh mà người ta phân loại sắc ký khí làm 2 loại

- Sắc ký khí - lỏng ( GLC)

- Sắc ký khí- rắn (GSC)

Trang 42

Sắc ký khí - lỏng (GLC):

- Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất

mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên

trong chất mang của cột.

- Mẫu phải được hóa hơi và được khi mang đưa đi qua cột

- Kỹ thuật này được Martin và Synge đưa ra vào 1941 để

thay thế pha động là lỏng, điều này dẫn đến làm tăng khả

năng tách các hợp chất từ trong mẫu ban đầu Hệ số phân bố

K là đặt trưng cho quá trình tách

Trang 43

Trang 44

• Sắc ký dòng siêu chảy(SFC- supercritical fluid

chromatography)

- Pha động ở đây ở trạng thái dòng siêu chảy của nó như Cacbondioxyt ở khoảng 500C và 150 atm.

- Pha tĩnh lúc này có thể ở cả hai trạng thái lỏng – rắn.

- Kỹ thuật này kết hợp với các loại sắc ký lỏng – lỏng hay lỏng khí để tăng hiệu quả tách

Định dạng
Số trang	44
Dung lượng	1,96 MB