Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây dầu dây ( ampelopsis heterophylla sieb et zucc var hancei planch vitaceae) thu hái ở tam đảo vĩnh phúc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY DÂU DÂY AMPELOPSIS HETEROPHYLLA SIEB... BỘ GIÁ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY

DÂU DÂY (AMPELOPSIS HETEROPHYLLA SIEB ET ZUCC VAR HANCEI PLANCH.,

VITACEAE) THU HÁI Ở TAM ĐẢO,

VĨNH PHÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC LAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY

DÂU DÂY (AMPELOPSIS HETEROPHYLLA SIEB

ET ZUCC VAR HANCEI PLANCH., VITACEAE)

THU HÁI Ở TAM ĐẢO,

VĨNH PHÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Bích Thu

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn TS NGUYỄN THỊ BÍCH THU đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Luận văn này là kết quả của quá trình học tập trong gần 16 tháng liên tục

Do đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy, cô trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tham gia vào quá trình giảng dạy và trang bị cho tôi những kiến thức để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn của mình tới TS PHƯƠNG THIỆN THƯƠNG, TS ĐỖ THỊ HÀ cùng các anh chị, các em trong Viện Dược liệu đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận văn

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới người thân, bạn

bè, đặc biệt là gia đình của tôi đã luôn động viên, giúp đỡ tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Ngọc Lan

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm chung của họ Nho (Vitaceae) 3

1.2 Đặc điểm chi Ampelopsis 3

1.2.1 Vị trí phân loại 3

1.2.2 Đặc điểm thực vật 3

1.2.3 Thành phần hóa học 4

1.2.4 Tác dụng dược lý 5

1.3 Những nghiên cứu về cây Dâu dây Ampelopsis heterophylla Sieb et Zucc var hancei Planch 6

1.3.1 Đặc điểm thực vật: 6

1.3.2 Phân bố và sinh thái 7

1.3.3 Một số công dụng theo kinh nghiệm dân gian [2], [10] 7

1.3.4 Thành phần hoá học: 7

1.3.5 Tác dụng dược lý: 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Phương tiện nghiên cứu 10

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất : 10

2.2.2 Phương tiện và máy móc 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 11

2.3.1 Về thực vật 11

2.3.2 Về hóa học 11

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22

3.1 Nghiên cứu về thực vật 22

3.1.1 Đặc điểm thực vật 22

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của thân và lá 24

3.1.3 Đặc điểm vi học 26

3.2 Nghiên cứu về hóa học 27

3.2.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong phần trên mặt đất (lá và

thân) cây Dâu dây (xem Bảng 3.1) 27

3.2.2 Định lượng và định tính cắn ở các phân đoạn 29

3.3 Phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học 34

3.3.1 Chiết xuất: 34

3.3.2 Phân lập: 34

3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất 38

3.3.4 Sắc ký đồ của dịch chiết phân đoạn với AG-1, AG-2 và AG-3 43

3.3.5 Xác định cấu trúc của các chất phân lập được 45

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 54

4.1 Về phương pháp 54

4.2 Về thực vật 54

4.3 Về thành phần hóa học 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

H-NMR: Hydro Nuclear Magnetic Resonance

IR: Infrared Spectroscopy

TLC: Thin Layer Chromatography

UV: Ultra Violet

VAST : Vietnam Academy of Science and Technology

DANH MỤC CÁC BẢNG

1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây bằng các phản ứng hóa học

28-29

2 Bảng 3.2 Hàm lượng cắn trong từng phân đoạn chiết

phần trên mặt đất của cây Dâu dây 29

3 Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn các phân đoạn trong

phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây 30-31

4 Bảng 3.4: Hệ dung môi pha động HPLC 40

5 Bảng 3.5: Số liệu phổ

1

H-NMR (500 MHz) và 13NMR (125 MHz) của chất AG-1 47

C-6 Bảng 3.6: Số liệu phổ

1

H-NMR (500 MHz) và 13NMR (125 MHz) của chất AG-2

C-49-50

7 Bảng 3.7: Số liệu phổ

1

H-NMR (500 MHz) và 13NMR (125 MHz) của chất AG-3 52-53

C-DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Ảnh cây Dâu dây (Nguồn internet) 6

2 Hình 2 2 Sơ đồ chiết phân đoạn các nhóm chất 21

3 Hình 3.3 Ảnh hình thái cây Dâu dây 23

4 Hình 3.4 Ảnh chụp vi phẫu lá cây Dâu dây 25

5 Hình 3.5 Ảnh chụp vi phẫu thân cây Dâu dây 25

6 Hình 3.6 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai và bó

tinh thể hình kim (Vi phẫu thân)

25

7 Hình 3.7 Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Dâu

dây dưới kính hiển vi

26

8 Hình 3.8 Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Dâu dây

dưới kính hiển vi

27

9 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn cắn ethylacetat 32

10 Hình 3.10 Sắc ký đồ phân đoạn cắn n-butanol 33

11 Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất, phân lập các chất trong

cây Dâu dây

19 Hình 3.19 SKLM dấu vân tay ở bước sóng 254 và

365 nm (trước khi phun thuốc thử)

44

20 Hình 3.20 SKLM dấu vân tay ở ánh sáng thường

và UV 365 nm (sau khi phun thuốc thử)

44

21 Hình 3.21 Công thức cấu tạo của 4’-O-methyl

myricitrin

48

22 Hình 3.22 Công thức cấu tạo của acid ursolic 51

23 Hình 3.23 Công thức cấu tạo của myricitrin 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, thực vật phát triển quanh năm, rất đa dạng và phong phú Thực vật không những cung cấp chất dinh dưỡng mà còn là nguồn thuốc chữa bệnh quí giá cho con người Hiện nay có rất nhiều các loại thuốc đang được lưu hành trên thế giới hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên Do vậy, hướng nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc đang rất thu hút sự quan tâm của giới khoa học

Cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla Sieb et Zucc var hancei

Planch.), còn gọi là cây nho dại, nho rừng, song nho dị diệp Cây phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Ở nước ta, cây phân bố tương đối rộng rãi

từ các tỉnh vùng đồng bằng đến trung du và vùng núi thấp Cây thường leo lên các lùm bụi ở ven rừng, đồi, bờ nương rẫy và đôi khi thấy ở cả quanh làng bản Theo Y học cổ truyền, cây có vị ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu sưng, chữa phong thấp Trong dân gian, cây được dùng phối hợp với các vị thuốc khác nhau để chữa sốt rét, chữa đau quanh vai, lưng gối đau nhức, chân sưng phù, chữa vết thương bầm tím sưng đau [2]

Cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào công bố sâu về thành

phần hóa học, tác dụng sinh học của cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla Sieb.et.Zucc.var hancei Planch.), mọc ở Việt Nam

Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng dược liệu có hiệu quả hơn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên cứu đặc điểm

thực vật và thành phần hóa học của cây Dâu dây (Ampelopsis

heterophylla Sieb et Zucc var hancei Planch., Vitaceae) thu hái ở Tam

Đảo, Vĩnh Phúc” với mục tiêu:

Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Dâu dây

Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

1 Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá, thân, đặc điểm bột lá,

thân và giám định tên khoa học của cây Dâu dây (Ampelopsis

heterophylla Sieb et Zucc var hancei Planch., Vitaceae) thu hái ở

Tam Đảo, Vĩnh Phúc

2 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng đối với cắn toàn phần và cắn các phân đoạn của các mẫu nghiên cứu

3 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học 2 đến 4 chất tinh khiết

trong cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla Sieb et Zucc var hancei

Planch., Vitaceae) thu hái ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm chung của họ Nho (Vitaceae)

Các cây thuộc họ Nho chủ yếu là dây leo thân gỗ có tua cuốn Hoa mẫu 4-5, nhị đối diện với cánh hoa và dính mép ngoài của triền; lá thường xẻ thùy chân vịt với gân chân vịt, hoặc lá kép chân vịt (gồm 3-5-7 lá chét), ít khi lá khép lông chim; bộ nhụy gồm 2 lá noãn hợp thành bầu thượng 2(6) ô, mỗi ô chứa 2 (1) noãn; thường là quả mọng; hạt thường có nội nhũ [1]

Họ Nho (Vitaceae) phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới

Ở Việt Nam có 7 chi: Ampelocissus, Ampelopsis, Cayratia, Cissus,

Parthenocissus, Tetrastigma, Vitis; khoảng 85 loài [1]

1.2 Đặc điểm chi Ampelopsis

Chi: Ampelopsis 1],3

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Chi Ampelopsis có khoảng 30 loài là những loài đặc hữu của khu vực

châu Á và Trung, Bắc Mỹ [42] Ở Ấn Độ và Trung Quốc có 5-6 loài được mô

tả Ở Việt Nam, có tác giả ước tính tới 5 loài (Nguyễn Tiến Bân, 1997) [1]

Hầu hết các loài thuộc chi này phát triển ở các vùng núi có khí hậu ôn

đới Tất cả các loài thuộc chi Ampelopsis là dạng dây leo thân gỗ có tua cuốn

Ở một số loài, tua cuốn có thể ôm lấy hoa Lá thường, chân vịt hoặc lá kép

chân vịt Cụm hoa dạng xim, tràng hoa có 5 cánh tù Quả mọng có 1 đến 4 hạt

hình trứng ngược [2]

1.2.3 Thành phần hóa học

Theo Xu Zihong và cộng sự, lá chè dây (Ampelopsis cantoniensis

Planch) chứa flavon (4,73%), protein (9,25%) và giàu K+, Ca2+, Fe, Zn cùng

các vitamin E, B1, B2 Phạm Thanh Kỳ và cộng sự phát hiện lá chè dây tại Cao

Bằng có chứa flavonoid (18-19%), tanin (10,82-13,30%), đường và đã phân

lập và định lượng được 2 flavonoid tinh khiết từ lá chè dây bao gồm (+)

myricetin (1) và dihydro myricetin (2) [13]

(1) (2)

Theo Xu Z và cộng sự, rễ cây A brevipedunculata (Maxim) Trautv có

chứa các hợp chất: β-amyrin, betulin, acid vanillic, ethyl gallat, kaempferol,

acid 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic, aromadendrol và resveratrol [37]

Trong rễ cây A sinica (Miq.) W.T Wang có chứa các hợp chất gồm:

lupeol, β-sitosterol, daucosterol, catechin, sucrose và acid palmitic Đây là lần

đầu tiên lupeol được tìm thấy trong chi Ampelopsis [20]

Du Q và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc một số flavonoid

glycosid từ loài A grossedentata là: 5,7- dihydroxy-3 ',

4'-trihydroxyflavon-3-O-6''-rhamnose và 5,7-dihydroxy-3', 4'-dihydroxyflavon-3 -O-6''-rhamnose,

đồng thời cũng phân lập được (+) - dihydromyricetin tinh khiết [24]

Yuan A và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất gồm: ampelopsin,

ambrein, β-sitosterol, myricetin và myricitrin từ loài A grossedentata

(Hand.-Mazz.) W.T Wang [41]

Từ loài A humulifolia var heterophylla (Thunb.) K Koch, Zhang Q

và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của sáu hợp chất gồm: lupeol,

β-sitosterol, daucosterol, ethyl gallat, acid gallic và catechin [41]

1.2.4 Tác dụng dược lý

Cao khô chè dây (A cantoniensis Planch) chứa các flavonoid

(myricetin, dihydro myricetin) có hoạt tính chống oxi hóa và ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn, điều trị bỏng hiệu quả, điều trị loét dạ dày-

tá tràng, ức chế sự đột biến gen gây nên bởi một số tác nhân độc hại [2], [13]

Dịch chiết lá của loài A grossedentata có khả năng gây ức chế sự co

động mạch chủ của thỏ đã tiêm noradrenalin và gây giãn cơ ở chuột đã tiêm ethanol [32]

Yabe và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của loài

A.brevipedunculata (Maxim.) Trautv (Vitaceae) Kết quả cho thấy, dịch chiết

ethanol 40% từ quả của loài này có khả năng làm giảm đáng kể mức độ tổn thương gan, thông số đánh giá là: mức độ bị hoại tử của trung tâm tiểu thùy, mức độ viêm sưng và xơ hóa của tế bào gan chuột đã được tiêm carbon tetrachlorid [39]

Dịch chiết phân đoạn từ quả loài A brevipedunculata (Maxim.) Trautv

có khả năng gây ức chế sự hình thành các sợi collagen trong tế bào M của gan chuột Đồng thời dịch chiết này không làm giảm sự tổng hợp protein không chứa collagen và không ảnh hưởng đến sự hình thành các tế bào không chứa collagen [38]

1.3 Những nghiên cứu về cây Dâu dây Ampelopsis heterophylla Sieb et Zucc var hancei Planch

1.3.1 Đặc điểm thực vật:

Hình 1.1 Ảnh cây Dâu dây (Nguồn internet, www.plant.ac.cn)

Cây Dâu dây (hay cây nho rừng, nho dại) là dạng cây leo, thân cành hình trụ, đôi khi có cạnh, khi non có lông rải rác rất nhỏ Tua cuốn phân nhánh, đối diện với lá Lá mọc so le, hình tim, hơi chia thùy, dài và rộng gần bằng nhau, gốc hình tim, đầu nhọn dài, mép khía răng thô, 5 gân chính tỏa từ gốc thành hình chân vịt, hai mặt có lông mịn Cụm hoa mọc thành ngù, đối diện với lá, ngắn hơn lá; hoa màu vàng nhạt; đài hình chén, có lông, 5 răng nhỏ; tràng có 5 cánh tù, 5 nhị, chỉ nhị rất mảnh, bao phấn gần tròn, bầu 2 ô Quả mọng, màu xanh lơ hay tím nhạt, có 3-4 hạt nhỏ Mùa hoa quả: tháng 7-12 [1], [2], [10], [12]

Dâu dây còn có các tên khoa học là: Ampelopsis glandulosa var hancei (Planch.) Momiy.; Ampelopsis brevipedunculata var hancei (Planch.) Rehder.; Ampelopsis brevipedunculata var hancei (Planch.) Li.; Ampelopsis

sinica var hancei (Planch.) W.T.Wang [21]

1.3.2 Phân bố và sinh thái

Dâu dây phân bố tương đối rộng rãi từ các tỉnh vùng đồng bằng đến trung du và vùng núi thấp Cây thường leo lên các lùm bụi ở ven rừng, đồi, bờ nương rẫy và đôi khi thấy ở cả quanh làng bản [2], [10]

Dâu dây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Khi bị chặt phá nhiều lần cây vẫn có khả năng mọc chồi mới [2]

1.3.3 Một số công dụng theo kinh nghiệm dân gian [2], [10]

Dâu dây có vị ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tiêu sưng, chữa phong thấp Từ xưa, danh y Tuệ Tĩnh đã dùng dâu dây phối hợp với lá thường sơn, hạt cau rừng, trần bì, thanh bì, sắc uống chữa sốt rét (Nam dược thần hiệu)

Theo kinh nghiệm dân gian, cây dâu dây 40g phối hợp với gối hạc, huyết giác, cẩu tích mỗi vị 20g, tất cả thái nhỏ phơi khô, sắc với 400ml nước còn 100ml, chia làm 2 lần uống trong vài ngày Dùng liên tiếp 5-7 ngày, chữa đau quanh vai, lưng gối đau nhức, chân sưng phù

Để chữa vết thương bầm tím sưng đau, lấy lá dâu dây tươi, giã nát, chưng nóng đắp tại chỗ, kết hợp lấy rễ dâu dây phối hợp với dây đau xương

và huyết giác, mỗi vị 20g, sắc nước uống Ở Lạng Sơn, đồng bào Tày dùng rễ dâu dây thái nhỏ, phơi khô, ngâm rượu, uống chữa mệt mỏi trong khi lao động nặng nhọc

1.3.4 Thành phần hoá học:

Dong L và cộng sự đã phân lập và nhận dạng cấu trúc của 8 hợp chất

bao gồm: β-sitosterol, β-daucosterol, lupeol, trans-resveratrol, piceid, acid galic, n-butyl gallat và (+)-catechin từ rễ của loài A.sinica var hancei (pl.)

ampelopsin G (8) và ampelopsin H Đây là các hợp chất chính có trong loài

A.brevipedunculata var hancei [31], [32], [33]

(5)

(6)

1.3.5 Tác dụng dược lý:

Dịch chiết cao cồn và dịch chiết nước thân, cành, lá và rễ của loài A

brevipedunculata var hancei có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp collagen

của tế bào gan và làm giảm lượng mỡ trong gan [31]

Dịch chiết methanol của A brevipedunculata var hancei cũng có tác

dụng trên gan, thí nghiệm được đánh giá bằng cách tiêm liều 1mg/ml vào tế bào gan chuột đã làm tổn thương bằng cacbon tetraclorid hoặc D-galactosamin Nghiên cứu cho thấy phân đoạn dịch chiết có hoạt tính sinh học chứa một số oligostilben và có tác dụng tốt đối với việc bảo vệ gan Hơn nữa phân đoạn ethyl acetat của dược liệu cũng có tác dụng giải độc gan rất tốt [32],[33]

Ở Việt Nam chưa có công bố nào về tác dụng sinh học của cây Dâu dây

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu được thu hái tháng 11 năm 2012 tại Tam Đảo, Vĩnh phúc gồm:

- Cành tươi mang hoa để giám định tên khoa học và làm tiêu bản mẫu khô

- Cành tươi mang hoa, lá để làm tiêu bản vi học

- Cành, lá phơi khô, thái nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm mẫu nghiên cứu thành phần hóa học

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất :

- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam III, IV

- Dung môi phân tích, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích

- SKLM: Dùng bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254, RP18 F254s

(Merck)

- Sắc ký cột: Chất nhồi cột là Silica gel GF254, cỡ hạt 60-200 µm (Merck), Silica gel Merck LiChroprep® RP-18, Sephadex LH-20

- Các thuốc thử: Dragendorff, Mayer, Baljet, Diazo…

2.2.2 Phương tiện và máy móc

- Kính hiển vi: Zeiss Axioskop 40

- Kính soi nổi: Krussoptroni

- Cân kỹ thuật Precisa

- Tủ sấy Memmert

- Máy xác định độ ẩm Satorius

- Máy cắt vi phẫu cầm tay

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon

- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy Sỹ)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu bao gồm: Bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy đo điểm nóng chảy Gallenkamp, Sanyo, Nhật Bản (Viện Dược liệu)

- Máy đo quang phổ UV-Vis 1800 Shimadzu, Nhật Bản (Viện Dược liệu)

- Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (Viện Hóa học, VAST)

- Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS – Water – API – ISI (Viện Hóa học, VAST)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) của hãng Bruker (500MHz), Viện Hóa học, VAST

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Về thực vật

* Phân tích hình thái thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp ghi trong tài liệu phân loại thực vật [9]

- Phân tích hoa trên kính lúp soi nổi và chụp ảnh bằng máy ảnh kĩ thuật số

* Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [7], [8]

* Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [8], [9]

- Sử dụng khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu

- Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật

2.3.2 Về hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Phần trên mặt đất (lá và thân cây) được đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C Đem ra tán nhỏ lá và thân bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo để làm các phản ứng hóa học định tính đối với bột dược liệu và làm sắc ký lớp mỏng theo tài liệu [6], [7]

2.3.2.2 Chiết xuất

* Xác định độ ẩm của dược liệu [5], [16], [17]:

Lấy 2 g bột dược liệu để xác định độ ẩm Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°C Để dược liệu lên đĩa cân và trải đều trên mặt đĩa, đậy đĩa cân

và cho máy tự hoạt động, đợi khoảng 10 phút máy sẽ tự động hiện kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

*Định lượng các cắn [16], [17]:

Cân chính xác khoảng 100g dược liệu (phần trên mặt đất của cây Dâu dây) đã xác định độ ẩm Ngâm lạnh bằng MeOH trong bình chiết Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao MeOH toàn phần Hòa tan cao MeOH toàn phần vào một lượng nước vừa đủ, thu được dịch chiết nước Đem

dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần hexan, ethylacetat và n-butanol, với mỗi loại dung môi lắc kỹ đến khi nào

n-dung môi trong suốt thu được 4 phân đoạn dịch chiết Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi ở 60oC, thu được cắn tương ứng Chiết theo sơ đồ hình 2.1

Cắn các phân đoạn được đem sấy ở nhiệt độ 40oC tới khối lượng không đổi Quá trình chiết xuất được lặp lại 3 lần Hàm lượng cắn là kết quả trung bình của 3 lần thực nghiệm Xác định hàm lượng cắn trong từng phân đoạn bằng phương pháp cân Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công thức:

Trong đó:

F: hàm lượng chất (%)

a: khối lượng cắn (g)

M: khối lượng dược liệu đã sấy khô (g)

x: độ ẩm của dược liệu (%)

đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10 ml dung dịch H2SO4 1N Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết acid

+ Ống 1: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Mayer

+ Ống 2: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Bouchardat

+ Ống 3: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Dragendorff

 Định tính glycosid tim:

Cho 20g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn

25o, lắc đều, ngâm trong 24 giờ Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) bằng chì acetat 30% để dư Để lắng, lọc Loại chì acetat thừa bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa đến khi không còn tủa với Na2SO4 nữa Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp chloroform : ethanol (4:1), mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến khô Cắn thu được để làm phản ứng định tính

+ Phản ứng Keller-Kiliani:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm

 Định tính saponin:

+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:

Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20ml, thêm vào

đó 5ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20ml, thêm 5ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát

 Định tính anthranoid:

+ Phản ứng Borntraeger:

Lấy 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml dung dịch H2SO4 10% Đun cách thủy sôi trong 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để nguội rồi lắc với 5ml chloroform Gạn lớp chloroform để làm phản ứng

Cho vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NH4OH 10%

Ống 2: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NaOH 10%

Lắc nhẹ

+ Vi thăng hoa:

Đặt khoảng 3g bột dược liệu trong một đĩa nhôm Hơ nhẹ trên bếp điện cho bay hết nước trong dược liệu Đặt lên trên đĩa nhôm một phiến kính, trên phiến kính đó có để một miếng bông đã tẩm nước lạnh Để đĩa nhôm trực tiếp trên bếp điện Sau 5 – 10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển

Phản ứng với NH 3 : Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô,

quan sát dưới ánh sáng thường thấy có màu vàng, sau đó hơ trên miệng lọ amoniac đặc

Phản ứng với NaOH: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt

dung dịch NaOH 10%

+ Phản ứng Cyanidin:

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi giỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc

+ Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc nhẹ

+ Phản ứng mở, đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết

Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

+ Quan sát huỳnh quang:

Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô Nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH 5%, hơ cho khô Bịt một nửa phần giấy

lọc thấm dịch chiết bằng tấm kim loại và đặt tấm giấy lọc dưới ánh sáng UV trong vòng 10 phút Bỏ miếng kim loại ra và quan sát dưới đèn UV thấy phần giấy lọc thấm dịch chiết không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che, tiếp tục đặt giấy lọc dưới ánh sáng UV mà không bị che miếng kim loại

Định tính tanin:

Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột dược liệu, thêm 10ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

+ Ống 1: 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt FeCl3 5%

Kết quả: Xuất hiện tủa xanh đen

+ Ống 2: 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10%

Kết quả: Xuất hiện tủa bông

+ Ống 3: 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%

 Định tính chất béo:

Cân khoảng 10g dược liệu vào túi lọc đã chuẩn bị sẵn rồi cho vào bình chiết Shoxhlet Chiết hồi lưu trên bếp cách thủy với dung môi chiết là ether dầu hỏa trong 3 giờ, thu được dịch lọc Nhỏ một giọt dịch lọc lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi

 Định tính steroid:

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa ở trên Bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ từng giọt H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm

Cho 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2CO3

 Định tính polysaccharid:

Lấy khoảng 2g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi cách thủy vài phút, lọc lấy dịch, cho vào 2 ống nghiệm:

+ Ống 1: 4ml dịch lọc + 5 giọt thuốc thử Lugol

+ Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

- Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất được tách tốt nhất

- Bình sắc ký rửa sạch, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng và kín 3 mặt thành trong của bình

- Bão hòa dung môi: Rót dung môt đã pha ở trên từ từ theo thành bình, để yên cho dung môi bão hòa

- Chấm sắc ký:

+ Lấy một lượng mẫu thích hợp vào xilanh, đưa xilanh vào hệ thống bơm mẫu tự động Lập file cho mỗi mẫu phân tích Nhập các thông số cần thiết: độ rộng vết, số lượng vết, thể tích mẫu chấm

+ Song song với quá trình bơm mẫu là quá trình làm khô tự động dịch chiết trên bản mỏng bằng khí nén

- Triển khai sắc ký:

+ Đặt thẳng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín,

để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

+ Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm trước và sau khi phun thuốc thử hiện màu

2.3.2.4 Phân lập và nhận dạng chất tinh khiết

Sử dụng phương pháp sắc ký cột thông thường để phân lập các chất trong phân đoạn ethylacetat Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, dựa trên các tài liệu [4], [5], [6], [11], [17]

Sử dụng các phổ IR, UV, NMR, MS để xác định cấu trúc chất tinh khiết [14], [15], [16]

Tiến hành [11]:

- Chuẩn bị cột: Cột rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên một giá cố định

- Ổn định cột: Dùng đũa thủy tinh dài để lót một lớp bông (loại bông thấm nước) lên trên ống thoát dịch của cột

Cân silica gel một lượng vừa đủ vào cốc có mỏ Thêm dung môi rửa giải vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đểu cho tới khi hết bọt khí Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silica gel lắng tự nhiên xuống đáy cột Khi dung môi chảy gần hết trong cột thì tiếp tục rót hỗn dịch chất hấp phụ vào cột Chú ý không để khô dung môi ở cột Tiếp tục dùng dung môi hứng rót lên cột và cho chảy liên tục một thời gian (có thể từ 5-10 giờ) đến khi cột hấp phụ đã hoàn toàn ổn định

- Đưa mẫu vào cột: Trộn đều một lượng bột silica gel với dung dịch thử, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt silica gel

- Rửa giải:

+ Sử dụng hệ dung môi thích hợp

+ Kiểm soát tốc độ dòng chảy

+ Hứng dịch rửa giải vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích thích hợp

+ Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn cho sắc

ký đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn

Hình 2 1 Sơ đồ chiết phân đoạn các nhóm chất

+ n-hexan

Dịch nước

Dược liệu

Cắn MeOH -MeOH

-n-butanol

Cắn BuOH

Cắn dịch chiết nước (còn lại)

Dịch chiết H2O

- n-hexan

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật

Dạng dây leo, thân và cành hình trụ, hơi phình to ở đốt, khi non có rải rác lông mịn hoặc nhẵn, tua cuốn đối diện với lá, xẻ đôi 1-2 lần Lá đơn, mọc cách, cuống lá dài 2-7 cm, có lông mịn hoặc nhẵn; phiến lá hình tim hoặc tam giác, cỡ 5-10 x 4-9 cm, nguyên, có hoặc xẻ thùy 3-5, có lông mịn ở gân mặt dưới, gốc lá hình tim hay lõm, mép lá có 4-7 đôi răng cưa nhọn, chóp lá nhọn, gân lá hình chân vịt, gân từ gốc lá 5, gân giữa có 3-5 đôi gân bên; lá kèm sớm rụng Cụm hoa dạng ngù kép của xim 2 ngả, đối diện với lá, dài 2-5 cm, có lông tơ mịn, cuống cụm hoa dài 1-2,5 cm, cuống hoa dài 1,5-2 mm, nụ hình trứng rộng hoặc gần hình càu, dài 1,5-2 mm Hoa lưỡng tính, bao hoa mẫu 5: đài hình chén, mép có 5 thùy nông; cánh hoa hình trứng hay gần hình tam giác, có lông mịn hoặc nhẵn ở mặt ngoài Nhị đối diện với cánh hoa, chỉ nhị mảnh, bao phấn 2 ô, đính lưng, hình bầu dục rộng; triền nạc dính quanh gốc bầu, có 5 thùy hình tam giác; bầu hình nón, vòi nhụy hình trụ ngắn, núm nhụy hình dùi Quả mọng hình cầu, cỡ 5-8 mm, khi chín màu tím xanh sau đó chuyển sang màu đen Hạt 3-4, hình trứng ngược, dài 4-5 mm, mặt bụng có 2

hố dài ở 2 bên

Đối chiếu với bản mô tả ghi trong các tài liệu phân loại thực vật [12], [21],

[28], [29], cây Dâu dây được sơ bộ xác định thuộc chi Ampelopsis, họ Nho

(Vitaceae) và được các chuyên gia về thực vật thuộc Bộ môn Thực vật, trường

Đại học Dược Hà Nội xác định tên khoa học là: Ampelopsis glandulosa var

hancei (Planch.) Momiy., họ Nho (Vitaceae) Tên thường gọi là Song nho, song

nho Hance Mã tiêu bản: 08513/HNIP

Ảnh mẫu nghiên cứu được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3 Ảnh hình thái cây Dâu dây

1 Hoa, quả và lá; 2 Cành mang hoa; 3 Tổng số cánh trong hoa; 4 Nhị;

5 Triền tuyến mật; 6 Bầu cắt dọc

3.1.2 Cấu tạo giải phẫu của thân và lá

3.1.2.1 Cấu tạo giải phẫu lá

Quan sát dưới kính hiển vi mặt cắt ngang vuông góc với gân chính lá cây Dâu dây cho thấy: Lá được chia thành 2 phần chính là phần gân lá và phần phiến lá

 Phần gân lá:

Gân lá lồi nhiều ở cả hai phía Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (9) là một hàng tế bào tròn, nhỏ, mang lông Lông che chở (3) Dưới biểu bì trên là đám tế bào mô dày (2) góc, sát lớp biểu bì dưới có 3-4 hàng tế bào mô dày

Mô mềm (8) là những tế bào thành mỏng, hình tròn, hình đa giác không đều nhau, rải rác có các tinh thể Calci oxalat hình cầu gai Có 3-5 bó libe-gỗ (5,6) xếp thành hình cung cân đối, cung ở giữa to nhất Mỗi bó có một đám tế bào

mô cứng (7) ôm sát lớp libe

 Phần phiến lá:

Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 lớp tế bào có kích thước lớn hơn phần gân chính Mô giậu (4) gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp vuông góc với biểu bì trên

Ảnh chụp vi phẫu lá cây Dâu dây được trình bày ở hình 3.4

3.1.2.2 Cấu tạo giải phẫu thân

Mặt cắt vi phẫu thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: Bần (1) gồm nhiều hàng tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau tạo thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm Ngay sát bần là lớp mô mềm vỏ gồm các tế bào thành mỏng, phần ngoài tế bào bị ép bẹt (2) Libe – gỗ xếp thành tứng bó, phía ngoài cùng có

mô cứng (3), các mô cứng xếp thành các đám tạo thành vòng Các bó libe –

gỗ được ngăn cách nhau bởi các tia ruột, trong tia ruột chứa các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (4) Libe (5) ở ngoài, gỗ (6) ở trong, có những mạch gỗ lớn nằm trong mô gỗ, kết thành đám được phân cách bởi các tia ruột hóa gỗ Phía trong cùng là mô mềm ruột (7), đôi khi chứa các tinh thể calci oxalat hình cầu gai hay hình kim tập trung thành bó (Xem hình 3.5; 3.6)

Hình 3.4 Ảnh chụp vi phẫu lá cây Dâu dây

Hình 3.5 Ảnh chụp vi phẫu thân cây Dâu dây

3.1.3 Đặc điểm vi học

3.1.3.1 Bột thân

Bột thân cây Dâu dây có màu lục hơi vàng, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính hiển vi thấy: có các mảnh bần (1), nhiều mảnh mô mềm (2) Mảnh mạch (3) đứng riêng lẻ hay nằm trong mảnh mô mềm Sợi tập trung thành bó (4) Rải rác có các mảnh mang màu (5), mảnh mô cứng (6) Hạt tinh bột đơn, có rốn rõ (7) Đặc biệt trong bột thường gặp các tinh thể Calci oxalat hình cầu gai đứng riêng lẻ (8) hay tinh thể hình kim, tập trung thành bó (9)

Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Dâu dây dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.7

Hình 3.7 Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Dâu dây dưới kính hiển vi 3.1.3.2 Bột lá

Bột màu lục, không mùi, vị hơi đắng Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Các mảnh biều bì (1), mảnh mô (2) đôi khi chứa mảnh mạch vạch, các mảnh

mô mangtinh bột (3) Mảnh mạch nhiều, đứng riêng lẻ hay tập trung thành bó (4) Rải rác còn thấy các lông che chở (5) đơn bào hay đa bào Các tinh thể Calci oxalat hình kim (6) tập trung thành bó hoặc hình cầu gai (7) Hạt tinh bột đơn (8) có kích thước khác nhau, các mảnh mô cứng (9)

Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Dâu dây dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.8

Hình 3.8 Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Dâu dây dưới kính hiển vi

3.2 Nghiên cứu về hóa học

3.2.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây (xem Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong phần trên mặt đất (lá

và thân) cây Dâu dây bằng các phản ứng hóa học

STT Tên nhóm chất Phản ứng định tính Kết

quả

Sơ bộ kết luận

1

Alcaloid

Phản ứng với TT Mayer -

Không Phản ứng với TT Dragendorff -

Quan sát huỳnh quang -

4 Glycosid tim

Phản ứng Lieberman -

Không Phản ứng Baljet -

Phản ứng Legal - Phản ứng Keller- kiliani -

5 Anthranoid Phản ứng Borntrager -

Không Phản ứng vi thăng hoa -

6 Saponin Hiện tượng tạo bọt ++

Có Phản ứng Slkowski ++

7 Tanin Phản ứng với dd FeCl3 5% ++

Có Phản ứng với dd chì acetate

10%

++

Phản ứng với dd gelatin 1% ++

8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không

9 Caroten Phản ứng với H2SO4 + Có

10 Steroid Phản ứng Lieberman ++ Có

11 Acid hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 ++ Có

12 Đường khử Phản ứng với TT Fehling ++ Có

13 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin - Không

14 Polysaccarid Phản ứng với TT Lugol + Có Ghi chú:

(-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính nhẹ

(++): Phản ứng dương tính rõ

(+++): Phản ứng dương tính rất rõ

3.2.2 Định lượng và định tính cắn ở các phân đoạn

 Định lượng cắn các phân đoạn (xem Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Hàm lượng cắn trong từng phân đoạn chiết phần trên mặt đất

của cây Dâu dây

Cắn methanol Cắn n-hexan

Cắn ethyl acetat

Cắn

n-butanol

m cắn (g)

F (%)

m cắn (g)

F (%)

m cắn (g)

F (%)

m cắn (g)

F (%)

1 100,05 7,81 8,34 8,46 1,09 1,18 1,76 1,91 1,72 1,86

2 100,14 7,83 8,36 8,48 1,09 1,18 1,77 1,92 1,73 1,87

3 100,00 7,81 8,34 8,45 1,08 1,17 1,75 1,90 1,70 1,84

Nhận xét: Phần trên mặt đất của cây Dâu dây có hàm lượng cắn

ethylacetat là lớn nhất (1,91 %), tiếp đến là cắn phân đoạn n-butanol (1,86 %), thấp nhất là cắn phân đoạn n-hexan ( 1,18%)

 Định tính các phân đoạn:

Định tính bằng các phản ứng hóa học:

Khi tiến hành định tính các nhóm chất trong cây Dâu dây, kết quả cho thấy phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây có các nhóm chất: flavonoid, saponin, tanin, caroten, acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid Do đó, chúng tôi tiến hành định tính các nhóm chất flavonoid, saponin, tanin, caroten, acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid ở các phân đoạn, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn các phân đoạn trong phần

trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây

STT Nhóm chất Phản ứng đặc

trưng

Kết quả Cắn

n-hexan

Cắn ethyl acetat

Cắn

n-butanol

Cắn nước (còn lại)

- + ++ -

Pứ với dd gelatin 1%

- + ++ -

4 Caroten Pứ với H2SO4 + + - -

5 Steroid Pứ Lieberman ++ - - -

6 Acid hữu cơ Pứ với bột Na2CO3 - - - +

7 Đường khử Pứ với TT Fehling - - + +++

8 Polysaccarid Pứ với TT Lugol - - - +

Cắn ở phân đoạn n-butanol cho phản ứng dương tính với các nhóm hợp

chất: flavonoid, saponin, tanin, đường khử

Cắn ở phân đoạn dịch chiết nước cho phản ứng dương tính với: đường khử, acid hữu cơ và polysaccarid

Vì vậy, sơ bộ nhận định trong các phân đoạn trên thành phần flavonoid

đều có mặt trong phân đoạn ethylacetat và n-butanol Trong đó nhóm hợp

chất flavonoid tập trung chủ yếu ở phân đoạn ethylacetat

Định tính cắn các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng:

- Dung dịch chấm sắc ký: Hòa tan cắn thu được ở phân đoạn ethylacetat, butanol trong dung môi methanol làm dịch chấm sắc ký

n Bản mỏng Silica gel F254 (Merck) tráng sẵn được hoạt hóa ở 110oC trong

1 giờ, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

- Cắn phân đoạn ethylacetat dùng hệ dung môi: Ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10:1:1:2)